CN110172525A - 林木差异表达基因ssr引物组及多态性ssr标记开发方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种林木差异表达基因SSR引物组及SSR标记开发方法。SSR标记开发方法是先提取某树种不同组织或不同发育阶段材料的RNA，进行转录组测序；根据qvalue<0.05的阈值筛选差异表达基因，用MISA对差异表达的unigene进行SSR检测，获取该树种差异表达基因SSR引物组，合成差异表达基因SSR引物，以该树种至少8个不同来源个体DNA为模板，按优化后的条件进行的PCR扩增，经电泳检测，筛选并开发出具有多态性的差异表达基因SSR标记。开发具多态性的杉木差异表达基因SSR引物序列如表2所示。本发明优化的PCR反应条件有效提高了引物扩增的特异性；本发明筛选出具多态性的SSR对林木遗传多样性研究、加快分子辅助育种具有重要意义和参考价值。
Description
技术领域
本发明属于基因转录及分子标记领域，具体涉及林木差异表达基因SSR标记方法。
背景技术
林木在长期演化过程中，由于地理、生境的隔离，在温度、湿度等因素影响下，同一物种的不同群体的遗传组成以及形态、适应性、生长发育、抗性等性状产生显著差异，形成了地理种源，遗传多样性丰富。林木的遗传改良需以遗传变异为基础，因此，准确有效的分析不同种质的遗传背景具有重要意义。
简单序列重复（Simple sequence repeats，SSR，也称为微卫星和小卫星）是一类由相对较短的基序的串联重复组成，并且很容易发生突变的DNA区段。越来越多的证据表明SSRs能够正向调节生物适应性进化（Kashi et al， 2006）。SSR标记符合孟德尔遗传规则，共显性表达，普遍分布于真核生物的基因组中且具有数量多、分布均匀、多态性信息丰富、易于检测等优点，已广泛应用于种质及基因型鉴定与品种保护、遗传图谱构建、分子标记辅助育种等领域（Bai et al, 2008) 。
基于转录组测序序列开发的SSR源于基因的转录区，因此这些SSR与目标基因功能关联密切，比gSSRs标记具有更高通用性(Eujayl et al., 2002)。而差异表达基因是表型多样性的重要来源,基因差异表达影响着杂种种质表型性状（Knight, 2004）。通过转录组检测获得杉木不同组织或不同发育阶段中差异表达的基因，设计差异表达基因SSR引物，并在杉木群体中进行多态性检验，建立了开发杉木差异表达基因SSR标记开发的方法。所开发的标记可用于林木种质资源鉴定、核心种质构建和分子标记辅助育种。
发明内容
本发明的目的是提供一种林木差异表达基因SSR引物组及SSR标记开发方法，该方法的建立对分析林木遗传多样性、加快分子辅助育种具有及其重要的意义。
本发明是通过以下技术方案实现的：
林木差异表达基因SSR标记开发方法，包括如下步骤：
（1）转录组测序，提取某树种不同组织或不同发育阶段材料的RNA，经RNA质量检测合格后建库，并进行转录组测序；对转录组检测序列进行拼接，挑选每个基因中最长的转录本作为该基因的unigene；
（2）差异表达基因筛选及SSR标记开发，根据qvalue < 0.05的阈值筛选差异表达基因，然后用MISA对差异表达基因进行SSR检测（SSR检测条件：单核苷酸为重复单位时，重复至少20次；二核苷酸重复至少6次；三核苷酸重复至少5次；四核苷酸重复至少5次；五核苷酸重复至少5次；六核苷酸重复至少5次），采用 Primer3进行 SSR 引物设计，合成林木差异表达基因SSR引物，并以该树种至少8个不同来源个体DNA为模板，经PCR 扩增，对PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，筛选具有多态性的SSR标记。
本发明中PCR扩增的SSR反应体系，以总体积为20μL为计：
30ng uL-1模板DNA 1μL，
5 U·μL-1的Taq DNA 聚合酶 0.1μL，
20 mM的10×Taq Buffer（Mg2+ Plus） 2μL，
dNTP Mixture（各2.5 mM） 1.6μL，
反向SSR引物(100uM) 各0.5μL，
灭菌ddH2O 补足20μL。
本发明中PCR扩增反应条件：
根据权利要求1所述的林木差异表达基因的SSR标记开发方法，其特征在于，所述PCR扩增反应条件：94℃预变性 5min ；然后 94℃变性 20s，62℃退火 30s，72℃延伸 30s，此三个步骤循环5次；然后94℃变性 20s，58℃退火 30s，72℃延伸 30s，此三个步骤循环5次；然后94℃变性 20s，54℃退火 30s，72℃延伸 30s，此三个步骤循环5次；然后94℃变性 20s，50℃退火 30s，72℃延伸 30s，此三个步骤循环5次；然后94℃变性 20s，56℃退火 30s，72℃延伸 30s，此三个步骤循环15次；共35个循环；最后 72℃延伸 10min，4℃保存；PCR 扩增结束后，采用 8％聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行分离，银染检测引物的多态性，拍照采集电泳图像。在目的片段位置出现多态性的SSR引物入选。
本发明筛选出具多态性的杉木差异表达基因SSR引物16对，如表2所示。
本发明的林木差异表达基因的SSR标记开发方法可以应用到林木遗传多样性、分子辅助育种中。
本发明的有益效果是：
本发明优化的PCR反应条件有效提高了引物扩增的特异性；本发明提供了一种开发林木差异表达基因SSR标记的方法，差异表达基因是表型多样性的重要来源,影响着杂种种质表型性状，林木差异表达基因SSR标记的开发为林木遗传多样性、分子辅助育种研究提供了有力的技术支持。
附图说明
图1是本方明杉木差异表达基因SSR引物CYSSR1的扩增情况电泳图。
具体实施方式
本发明用下列实施例进行说明，但不是对本发明的使用范围的限制。
实施例1
杉木差异表达基因SSR标记开发方法，包括如下步骤：
1、杉木不同组织材料转录组测序
采集根、茎、叶、种子等杉木组织材料，每个样品设置两个生物学重复，提取RNA。经琼脂糖凝胶电泳定量、Nanodrop及Agilent 2100检测合格的RNA，建库后通过IlluminaHiSeqTM2000进行了转录组测序。采用Trinity软件进行转录本拼接，挑选中每个基因中最长的转录本作为该基因的unigene。
、差异表达基因分析
以转录组作为参考序列，采用了RSEM软件检测每个样品的序列，得到比对到每个基因上的读取数目，并将读取数进行了FPKM转换。设定基因差异表达的筛选阈值为qvalue <0.05。
、差异表达基因SSR引物设计
使用软件MISA搜索转录组中SSR。SSR筛选标准为：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸的最少重复次数 20、6、5、4、3、3次以上。使用在线引物设计软件Primer3.0设计杉木组织差异表达unigene中SSR引物，引物配对序列避免微卫星的出现。并以杉木至少8个不同来源个体DNA为模板，经PCR 扩增，对PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，筛选具有多态性的SSR标记。
杉木差异表达基因SSR多态性检测，具体操作如下：
从广西融水贝江河林场国家级杉木良种基地采集来至广西、广东、湖南、贵州、福建、浙江等地的24份杉木不同种质材料，如表1所示，应用上海生工的植物基因组DNA抽提试剂盒提取材料DNA。选择150对杉木组织差异表达基因SSR引物采用以下反应体系和PCR程序进行扩增。SSR反应体系总体积为20μL：10ng uL-1的模板DNA 1μL，5 U·μL-1的Taq DNA 聚合酶0.1ul，20 mM的10×Taq Buffer（Mg2+ Plus）2ul，dNTP Mixture（各2.5 mM）1.6ul，反向SSR引物 (100uM) 各0.5uL，灭菌ddH2O 14.3ul。SSR 扩增为：94℃预变性 5min ；然后 94℃变性 20s，62℃退火 30s，72℃延伸 30s，此三个步骤循环5次；然后94℃变性 20s，58℃退火30s，72℃延伸 30s，此三个步骤循环5次；然后94℃变性 20s，54℃退火 30s，72℃延伸30s，此三个步骤循环5次；然后94℃变性 20s，50℃退火 30s，72℃延伸 30s，此三个步骤循环5次；然后94℃变性 20s，56℃退火 30s，72℃延伸 30s，此三个步骤循环15次；共35个循环；最后 72℃延伸 10min，4℃保存；PCR 扩增结束后，采用 8％聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行分离，银染检测引物的多态性，拍照采集电泳图像。共检测获得CYSSR1-16这16对SSR引物存在多态性差异，如表2所示。
表1 杉木SSR多态性分析材料
表2 16对具有多态性的杉木差异表达基因SSR引物信息
Claims (6)
1.一种利用权利要求1所述的林木差异表达基因SSR引物组进行的SSR标记开发方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）转录组测序，提取某树种不同组织或不同发育阶段材料的RNA，经RNA质量检测合格后建库，并进行转录组测序；对转录组检测序列进行拼接，挑选每个基因中最长的转录本作为该基因的unigene；
（2）差异表达基因筛选及SSR标记开发，根据qvalue < 0.05的阈值筛选差异表达基因，用MISA对差异表达的unigene进行SSR检测，获取该树种差异表达基因SSR引物组，采用Primer3进行 SSR 引物设计，合成林木差异表达基因SSR引物，以该树种至少8个不同来源个体DNA为模板，经PCR 扩增，对PCR扩增产物进电泳检测，筛选并开发出具有多态性的差异表达基因SSR标记。
2.根据权利要求1所述的林木差异表达基因的SSR标记开发方法方法，其特征在于，所述SSR检测条件：单核苷酸为重复单位时，重复至少20次；二核苷酸重复至少6次；三核苷酸重复至少5次；四核苷酸重复至少5次；五核苷酸重复至少5次；六核苷酸重复至少5次。
3.根据权利要求1所述的林木差异表达基因的SSR标记开发方法，其特征在于，所述PCR扩增的SSR反应体系，以总体积为20μL为计：
10ng uL-1模板DNA 1μL，
5 U·μL-1的Taq DNA 聚合酶 0.1ul，
20 mM的10×Taq Buffer（Mg2+ Plus） 2ul，
dNTP Mixture（各2.5 mM） 1.6ul，
正反向SSR引物 (100uM) 各0.5uL，
灭菌ddH2O 补足20μL。
4.根据权利要求1所述的林木差异表达基因的SSR标记开发方法，其特征在于，所述PCR扩增反应条件：94℃预变性 5min ；然后 94℃变性 20s，62℃退火 30s，72℃延伸 30s，此三个步骤循环5次；然后94℃变性 20s，58℃退火 30s，72℃延伸 30s，此三个步骤循环5次；然后94℃变性 20s，54℃退火 30s，72℃延伸 30s，此三个步骤循环5次；然后94℃变性20s，50℃退火 30s，72℃延伸 30s，此三个步骤循环5次；然后94℃变性 20s，56℃退火30s，72℃延伸 30s，此三个步骤循环15次；共35个循环 ；最后 72℃延伸 10min，4℃保存；PCR 扩增结束后，采用 8％聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行分离，银染检测引物的多态性，拍照采集电泳图像；在目的片段位置出现多态性的SSR引物入选。
5.如权利要求1所述的林木差异表达基因的SSR标记开发方法的应用，其特征在于，它在林木遗传多样性、分子辅助育种中的应用。
6.一组具有多态性的杉木差异表达基因SSR引物，其特征在于，该引物组为16对，如表2所示。
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