CN112961936A - 一种绿豆InDel分子标记检测引物组及其应用 - Google Patents

一种绿豆InDel分子标记检测引物组及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种绿豆InDel分子标记检测引物组及其应用，属于植物分子标记技术；所述绿豆InDel分子标记检测引物组均匀分布于11条染色体上，引物组序列如SEQ ID NO.1‑1794所示，所述绿豆InDel分子标记检测引物组数量丰富、多态性高、遗传稳定且重复性好，可用较简捷的琼脂糖电泳检测，大大提高了效率；本发明还公开了所述InDel分子标记的试剂盒与检测方法，该方法简捷，成功率高，且能避免了由于特异性和复杂性导致的后续分析模糊的问题，拥有广泛的应用前景。

Description

一种绿豆InDel分子标记检测引物组及其应用
技术领域
本发明涉及植物分子标记技术领域，特别是涉及一种绿豆InDel分子标记检测引物组及其应用。
背景技术
绿豆(Vigna radiate L.)是二倍体植物，基因组有2N＝22条染色体。相比于一些模式作物，与绿豆相关的分子遗传学、基因组学的研究不多，但是近年来有了一定的发展。作为开展遗传分析和基因定位等工作的重要工具，绿豆的分子标记开发工作也有相当的进展。近年，绿豆品种VC1973A的全基因组序列已被发布(Kang et at.,2014)，这是绿豆基因绿学上的一大进步，将会对今后的分子标记开发、基因定位和基因功能分析等工作带来便利。Isemura等(2012)利用野生绿豆JP211847和栽培绿豆品种Sukhothai发展BC1F1群体，构建了一个含有430个SSR或EST-SSR分子标记的遗传图谱，这些标记被定位在11个链锁群上，总长度为727.6cM，是绿豆的第一张连锁群数目与单倍型染色体数目一致的遗传图谱。有研究通过比较基因组学分析，发现一些通用分子标记在绿豆、豇豆、红豆、黑豆和菜豆的链锁群上的排序有着共线性关系(Somta et al.,2009；Menancio-Hautea et al.,1993；Kajonphol et al.,2012；Boutin et al.,1995)。通过第二代测序技术，研究人员开发了一些新的绿豆分子标记，但是，这些标记的多态信息含量(PIC)比较低(Tangphatsornruanget al.,2009；Chen et al.,2015)。所以，有必要开发更多可用于绿豆分子标记辅助选择的多态分子标记。
插入/缺失(insertion/deletion，InDel)是指在同一物种或近缘物种不同个体之间的基因组同一位点的序列存在不同大小核苷酸片段的插入或缺失。InDel标记属于共显性标记，具有较好的稳定性和较为丰富的多态性，已广泛应用于玉米，水稻，茄子，黄瓜等作物分子标记辅助育种中，并且取得了较大的进展。通过设计开发一批高质量的绿豆InDel标记，可为绿豆的分子标记辅助选择育种工作带来便利，可缩短育种年限，提高育种效率。同时，InDel标记也可为绿豆种质的分类、核心种质库的构建和利用提供分子水平上的依据，因此，开发出一组高质量的绿豆InDel标记，无论在遗传学基础理论研究还是在具体的育种工作上都具有较大的科学意义与应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种绿豆InDel分子标记检测引物组及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。所述InDel分子标记及其引物具有数量丰富、多态性高、遗传稳定、重复性好。
为实现上述目的，本发明提供一种绿豆InDel分子标记检测引物组，包括检测897个InDel分子标记位点的特异性引物，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.1-1794所示。
本发明还提供一种绿豆InDel分子标记检测试剂盒，包括所述的绿豆InDel分子标记检测引物组。
本发明还提供一种根据所述的绿豆InDel分子标记检测引物组或所述试剂盒在绿豆遗传图谱构建、种群中的相同或相关的绿豆植物基因型鉴定、绿豆分子辅助育种、绿豆种质资源鉴定、绿豆QTL定位、绿豆遗传多样性分析、绿豆杂交子代真实性鉴定或绿豆种子纯度鉴定中的应用。
本发明还提供一种绿豆InDel分子标记的检测方法，包括以下步骤：
利用任一所述的引物组或所述的试剂盒，对DNA样品模板DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；将所述PCR扩增产物纯化后进行建库、测序。
进一步的，在所述PCR扩增产物纯化前进行凝胶电泳检测。
本发明还提供一种根据所述的绿豆InDel分子标记检测引物组的开发方法，具体步骤包括：选用不同绿豆品种进行全基因组测序，对序列进行组装、InDel挖掘和引物设计，经引物多态性验证得到所述的绿豆InDel分子标记检测引物组。
进一步的，所述引物多态性验证前还包括过滤候选引物过程；经过滤，符合以下条件任意一项的引物被剔除：(1)引物3’端存在错配；(2)前引物和后引物比对到不同的染色体上；(3)PCR产物大于500bp；(4)引物比对到不能组装在染色体上的scaffold上。
本发明公开了以下技术效果：本发明提供的InDel分子标记及其引物具有数量丰富、多态性高、遗传稳定、重复性好的特点，特别是，这些InDel标记可用较简捷且对器材要求不高的琼脂糖电泳检测，大大提高了效率。因此，这些InDel标记可为绿豆的分子育种和基因定位等中小规模的分子标记分析工作带来便利。在绿豆种质资源研究中，这是是首次报道基于绿豆测序的InDel标记的开发及遗传多样性分析，因此具有首创性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为部分标记电泳结果，其中，S表示苏绿1号得到的条带；V表示V2709得到的条带；H表示苏绿1号与V2709杂交种得到的条带；
图2为绿豆遗传多样性分析。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例1InDel标记开发
提取绿豆品种苏绿1号和V2709的基因组DNA后，利用illumine
Figure BDA0003032991320000021
SBS进行建库并利用illumine MiSeq测序进行全基因组测序。经过去除接头和过滤后，苏绿1号和V2709分别得到20,526Mb和17,944Mb的paired-end序列数据。利用mInDel软件的流程进行InDel标记开发，预期的InDel大小参数设置20-500bp。结果产生了1809对候选InDel标记的引物。
利用BLAST将得到的InDel标记的引物序列比对到绿豆的参考基因组序列(GenBank assembly accession:GCA_000180895.1)，以得到这些引物的物理位置。根据比对的结果，按以下4个条件过滤掉部份候选标记：1)引物3’端存在错配；2)前引物和后引物比对到不同的染色体上；3)预期PCR产物大于500bp；4)引物比对到不能组装在染色体上的scaffold上。经过过滤，剩下969个候选标记用于后续的多态检测。
将969个候选标记的引物在苏绿1号和V2709的基因组DNA上进行PCR扩增和PCR产物电泳，以检测这些标记的多态。20μl PCR反应体系中包括：0.15μM附表中VRID155和VRID120的引物、200μM的dNTP、1×PCR反应缓冲液、50-100ng的DNA模板、1U Taq酶。产物扩增在热循环仪中进行。所用的反应程序基本为：94℃预变性2min；94℃15s，55℃30s，72℃30s，共35次循环；72℃延伸2min，15℃保存10分钟。将PCR产物进行3％的琼脂糖电泳。部份标记的电泳结果如图1所示。一共检测到897个多态标记，标记引物如表1所示。
表1
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实施例2绿豆遗传多样性分析
随机在表1中选取24个多态InDel标记，包括M0082、M0110、M0115、M0130、M0183、M0189、M0310、M0366、M0550、M0616、M0793、M0826、M0841、M1160、M1229、M1252、M1308、M1309、M1344、M1351、M1355、M1366、M1489和M1516，对由40个绿豆品种(或种质资源)组成的自然群体基因分型条带数据形成0-1矩阵，统计各种质材料间多态标记的个数。并用powermarker计算各种质材料间的Nei’s遗传距离，并依据距离矩阵构建系统发生树，进行Neighbor-Joining聚类分析，生成结果如图2所示，40份绿豆材料可以划分两大类群。
实施例3绿豆杂交子代真实性鉴定
以绿豆品种苏绿1号为母本，V2709为父本进行杂交。得到的种子成熟后单株种植。取每个待检测的杂交植株的叶片，用CTAB法提取DNA。以各个待检测的杂交植株和两仩亲本的DNA为模板，用InDel标记M0679的引物进行PCR扩增。得到的PCR产物在3％琼脂糖凝胶中进行电泳。如果待测的杂交植株得到两条条带，其中一条与苏绿1号的大小相同，另一条与V2709的大小相同，则该植株为真实杂交子代。如果待测的杂交植株只得到一条与苏绿1号同相的条带，则为假杂交子代。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种绿豆InDel分子标记检测引物组，其特征在于，包括检测以下897个InDel分子标记位点的特异性引物，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.1-1794所示：
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Figure FDA0003032991310000411
2.一种绿豆InDel分子标记检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的绿豆InDel分子标记检测引物组。
3.一种根据权利要求1所述的绿豆InDel分子标记检测引物组或权利要求2所述试剂盒在绿豆遗传图谱构建、种群中的相同或相关的绿豆植物基因型鉴定、绿豆分子辅助育种、绿豆种质资源鉴定、绿豆QTL定位、绿豆遗传多样性分析、绿豆杂交子代真实性鉴定或绿豆种子纯度鉴定中的应用。
4.一种绿豆InDel分子标记的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
利用权利要求1任一项所述的引物组或权利要求2所述的试剂盒，对DNA样品模板DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；将所述PCR扩增产物纯化后进行建库、测序。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，在所述PCR扩增产物纯化前进行凝胶电泳检测。
6.一种根据权利要求1所述的绿豆InDel分子标记检测引物组的开发方法，其特征在于，具体步骤包括：选用不同绿豆品种进行全基因组测序，对序列进行组装、InDel挖掘和引物设计，经引物多态性验证得到所述的绿豆InDel分子标记检测引物组。
7.根据权利要求6所述的开发方法，其特征在于，所述引物多态性验证前还包括过滤候选引物过程；经过滤，符合以下条件任意一项的引物被剔除：(1)引物3’端存在错配；(2)前引物和后引物比对到不同的染色体上；(3)PCR产物大于500bp；(4)引物比对到不能组装在染色体上的scaffold上。
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