CN115198030B

CN115198030B - 用于朱顶红杂交后代鉴定的ssr分子标记组合、ssr引物组合及其应用

Info

Publication number: CN115198030B
Application number: CN202210641501.2A
Authority: CN
Inventors: 周琳; 蔡友铭; 张永春; 杨柳燕; 陈敏敏; 聂功平; 李心
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-06-07
Filing date: 2022-06-07
Publication date: 2023-09-01
Anticipated expiration: 2042-06-07
Also published as: CN115198030A

Abstract

本发明公开一种用于朱顶红杂交后代鉴定的SSR分子标记组合、SSR引物组合及其应用，本发明基于朱顶红转录组数据开发EST‑SSR标记，以朱顶红亲本和杂交后代基因组DNA为模板，使用SSR引物进行PCR扩增，通过毛细管电泳，进行朱顶红亲本和杂交后代的EST‑SSR分析，可用于朱顶红杂交后代的早期鉴定。本发明的检测方法适用于朱顶红EST‑SSR分子标记开发及其杂交后代的早期鉴定，既提高了朱顶红杂交育种效率，又降低了杂交后代株系的管理成本，具有准确性高、操作简便等优点。

Description

用于朱顶红杂交后代鉴定的SSR分子标记组合、SSR引物组合及其应用

技术领域

本发明属于花卉遗传育种与技术应用领域，具体涉及用于朱顶红杂交后代鉴定的SSR分子标记组合、SSR引物组合及其应用。

背景技术

朱顶红(Hippeastrum spp.)为石蒜科朱顶红属(Hippeastrum)多年生球根花卉的总称，原产于中南美洲，其品种繁多(超过600个园艺品种)、株型优美、花大色艳、花型多变、花色艳丽且丰富，极具观赏价值(孙翊等,2017)。朱顶红常用作切花和盆花，在国内外花卉市场上均深受喜爱，此外朱顶红又可露地种植，已逐渐应用于园林景观，具有广阔的市场前景(曹华等,2021；孙翊等,2017)。

目前，国际上流行的园艺杂交种朱顶红有100多个品种，而国内推广应用的朱顶红品种主要引自荷兰、美国和南非等地，缺少自主培育的新品种，种球主要依赖国外进口(石丰瑞等,2014；王黎等,2020)。中国的朱顶红市场前景极为广阔，然而缺乏自主知识产权的品种是限制朱顶红产业发展的主要“瓶颈”之一，导致朱顶红在生产和销售上受到限制且价格高昂；因此，近年来国内逐渐关注创制具有自主知识产权的朱顶红品种或品系(叶露,2007；石丰瑞等,2014；杨柳燕等,2019)，以期选育出商品价值高的新品种，从而减少种球的进口，满足国内日益增长的需求。目前，杂交育种是培育朱顶红新品种最为常用的方法，虽然朱顶红不同杂交组合的结实率存在差异，但通过杂交可获得大量杂交后代，例如石丰瑞等(2014)通过44个杂交组合获得了1.6万株杂交苗，田松青(2007)采用引进的12个品种配置67个组合共获得了2万株一代杂种单株。在选育朱顶红新品种时，新品种鉴定主要依赖传统的形态学鉴定，即通过杂交苗开花性状鉴定，而杂交苗培育到开花种球需要2～3年时间，杂交获得的后代群体数量较大，管理成本较高，且育种周期较长。例如，石丰瑞等(2014)于2010年开展杂交育种并获得1.6万株杂交苗，直至2014年才通过已开花组合进行鉴定并筛选出新材料5个；田松青(2007)杂交获得的2万株一代杂种单株经连续3年的初选及单株复选，才从167个初选杂交后代中选育出31个优良品种。因此，对杂交后代进行早期鉴定，是降低朱顶红育种成本、缩短育种周期的有效途径，将加快朱顶红新品种的培育进程，为实现我国自主选育朱顶红的市场供应有着重要意义。

近年来，随着全基因组测序、简化基因组测序、RNA-seq等高通量测序技术的快速发展，提高了分子标记的开发效率，降低了开发成本(郭丽丽等,2021)。基于SSR、SNP等分子标记，已构建了梅花、菊花、莲花、牡丹、桂花、等重要花卉的高密度遗传图谱，为该些物种的分子标记辅助育种提供了基础，加快了新品种选育的进程。简单重复序列(SimpleSequence Repeats,SSR)，也称为微卫星DNA，是一类由1-6bp组成的基序串联重复而成的DNA序列。与其它分子标记技术相比，SSR标记具有数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高；(2)具有多等位基因的特性，提供的信息量高；(3)以孟德尔方式遗传，呈共显性；另外还具有DNA用量少，DNA质量要求不高，快速简便，重复性好等优点(卓蕾等,2021)。基于EST(Expressed sequence tags)序列开发的SSR标记具有信息量大、通用性好、开发简单等优越性，是目前一种主要的功能性分析标记，已广泛应用于植物遗传图谱构建、亲缘关系鉴定、遗传多样性评价、功能基因组学研究等(钱学磊等,2012；陈思等,2018)。因此，开发可用于朱顶红杂交后代早期鉴定的EST-SSR分子标记，将有助于开展朱顶红的分子标记辅助育种工作，实现朱顶红新种质的早期鉴定，加快朱顶红新品种的选育。

发明内容

发明目的：朱顶红杂交育种存在后代群体数量较大，管理成本较高，且育种周期较长等问题，相较于其他观赏植物，其分子标记辅助育种技术较为薄弱，制约了国产新品种的选育进程。针对上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种用于朱顶红杂交后代鉴定的SSR分子标记组合、SSR引物组合及其应用，所述SSR引物组合可用于朱顶红杂交后代的早期鉴定，既提高了朱顶红杂交育种效率，又降低了杂交后代株系的管理成本，具有准确性高、操作简便等优点。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

用于朱顶红杂交后代鉴定的SSR分子标记组合，所述组合中的SSR分子标记分别由具有如下核苷酸序列的引物对扩增所得：

用于朱顶红杂交后代鉴定的SSR引物组合，所述组合包括具有如下核苷酸序列的引物对：

一种试剂盒，其包所述的SSR引物组合。

所述的SSR分子标记组合、所述的SSR引物组合、或所述的试剂盒在朱顶红杂交后代鉴定中的应用。

朱顶红亲本及其杂交后代的分子身份证，采用所述SSR引物组合或所述试剂盒，对朱顶红样品的DNA进行PCR扩增，PCR产物进行电泳检测，将每个个体的等位基因转换成为1和0字符串，最终得到朱顶红亲本及其杂交后代的由1、0编号的原始数据，作为每一个朱顶红样本的‘分子身份证’。

优选的，所述朱顶红亲本中，母本品种选择‘Picotee’、‘Rapido’和‘Naranja’，父本品种选择‘Blossom peacock’、‘Sunny nymph’、‘Matterhorn’、‘Luna’和‘Naranja’，共配置6组杂交组合，分别为♀Picotee×♂Blossompeacock、♀Rapido×♂Blossompeacock、♀Picotee×♂Sunny nymph、♀Picotee×♂Matterhorn、♀Naranja×♂Luna、♀Luna×♂Naranja。

一种朱顶红杂交后代鉴定方法，包括如下步骤：

1)朱顶红亲本和杂交后代DNA提取；

2)采用所述的SSR引物组合或所述的试剂盒，对朱顶红亲本和杂交后代PCR扩增；

3)扩增产物毛细管电泳检测；

4)根据电泳结果，将每个个体的等位基因转换成为1和0字符串，最终得到朱顶红亲本及其杂交后代的由1、0编号的原始数据；

5)将步骤4)的结果与权利要求5所述的分子身份证进行比对，进行朱顶红杂交后代鉴定鉴定，如果杂交后代间，编号完全一致，则为重复样本。

有益效果：本发明通过对朱顶红亲本和杂交后代样本的转录组测序，利用MISA软件从Unigenes中获得了大量候选SSR位点，从中挑选SSR位点并设计和合成引物，通过朱顶红亲本和部分杂交后代的毛细管电泳检测，筛选出特异性高、多态性好的EST-SSR位点，并应用于朱顶红杂交后代的早期鉴定。该方法简单易行，稳定可靠，准确性高，具有很好的实用价值。本发明方法基于朱顶红亲本和杂交后代转录组测序数据，通过生物信息学分析，高效地开发出多个特异性高、多态性好的EST-SSR标记，可用于朱顶红杂交后代的快速鉴定。因此，本发明方法对加快朱顶红新品种选育具有十分重要的应用价值。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明名做进一步详细说明。给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：

试验材料为本单位保存的朱顶红种质资源及其相应的杂交后代，母本品种选择‘Picotee’、‘Rapido’和‘Naranja’，父本品种选择‘Blossom peacock’、‘Sunny nymph’、‘Matterhorn’、‘Luna’和‘Naranja’，共配置6组杂交组合，分别为♀Picotee×♂Blossompeacock、♀Rapido×♂Blossompeacock、♀Picotee×♂Sunny nymph、♀Picotee×♂Matterhorn、♀Naranja×♂Luna、♀Luna×♂Naranja。杂交育种和杂交后代的管理参照田松青(2007)的方法。

6组杂交组合中，从每组中随机选择60株杂交后代，用于本实施例的测试。

1.朱顶红亲本及杂交后代转录组测序分析

采集朱顶红亲本及其杂交后代中30％样本(即30株)的叶片，为降低测序成本，将所有样本亲本1份样本，使用植物RNA提取试剂盒参照说明书提取RNA，委托测序公司按照转录组测序常规流程完成文库构建和测序。

2.朱顶红EST-SSR标记挖掘和引物设计

使用MISA软件从Unigenes中搜索SSR位点，搜索标准为单核苷酸重复最少搜索次数为10次，二核苷酸重复为6次，三核、四核、五核和六核苷酸重复为5次。基于SSR位点信息(名称、引物序列、引物长度、引物TM值、产物长度、重复单元类型、重复次数)。由表1可见，基于朱顶红亲本和杂交后代的转录组测序，获得了大量的SSR候选位点，除了单核苷酸类型外，二核苷酸和三核苷酸SSR位点较多。

表1朱顶红EST-SSR的数量和类型

基于转录组数据挖掘的SSR位点长度、Unigene上的开始位置和结束位置、重复序列所在的位置区域、相应的上下游引物及其适宜的退火温度等信息，按照以下标准筛选SSR位点——选择重复单元为2、3、4、5个碱基的位点；选择片段长度大于150bp，小于300bp；基因所在位置不宜太集中、已经有多态的位点优先选、不同组合的重复单元均衡选择，最终选择25个候选EST-SSR标记，如表2所示。

引物设计遵循以下原则：选择在20-23bp之间的引物、选择TM值在60度左右的引物；选择碱基重复数小于等于4个的引物；选择5’和3’端不要有2个连续A/T碱基；引物内不能有重复序列。所设计的引物如表2所示。

表2 SSR位点及其引物

续上表：

3.亲本和杂交后代DNA提取

使用植物DNA提取试剂盒提取朱顶红亲本(8个)和杂交后代(30株)叶片DNA，具体提取步骤按试剂盒说明书进行。提取的DNA通过1.0％琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，使用NanoDrop1000分光光度计检测DNA浓度及纯度，达到检测要求的DNA冻存与-80℃备用。

4.PCR扩增

PCR扩增体系共计20μL，具体如下：

组分	体积
		2×TSINGKE Master Mix(blue)	10μL
10μM Primer F(加接头)	1μL
		10μM Primer R	1μL
Template(gDNA)	1μL
		ddH₂O	7μL
Total	20μL

PCR反应程序的具体步骤如下：

/>

扩增后的PCR产物(2μL扩增产物+6μL溴酚蓝)通过1.0％琼脂糖凝胶电泳(电压300V，12min)获取鉴定胶图，通过胶图确定模板浓度，加水稀释到毛细管电泳所需浓度。

5.毛细管电泳检测

首先将HiDi与GS500的内标按130：1混合，配成mix；用国产96孔反应板分装mix，每个孔中加入10μLmix；对应着在96孔板中加入0.5μL样品模板，离心到4000rpm即停；用金属浴加热器将混合板95℃加热预变性5min，拿出后立即放入-20℃冷却；冷却后拿出，4000rpm离心，解冻、混匀后，采用ABI 3730测序仪进行毛线管电泳。

6.特异性高，多态性好的EST-SSR位点筛选

获取下机结果，用Gene mapper 4.1软件进行数据准确位点的分析，分析数据按照引物对应关系的核心碱基重复数来确定位点准确大小；根据分析出来的位点信息(峰图.PDF和数据.excel)来判断检测引物是否具有位点多态性，选取特异性高，多态性好的位点。

从25个候选EST-SSR标记中，最终获得11个具有较高多态性的EST-SSR位点，具有较高的开发效率(44％)。11个EST-SSR位点，每个位点的有效等位基因数为2个，具体信息如表3所示，可用于朱顶红杂交后代的鉴定。

表3具有较高多态性的EST-SSR位点及其引物信息

7.基于EST-SSR的朱顶红杂交后代鉴定

以朱顶红亲本(8个)和杂交后代(60株)为测试材料，参照步骤3)提取DNA，应用表3中引物，参照步骤4)进行PCR扩增，参照步骤5)进行毛细管电泳检测。按表3引物的顺序(即ZLSSR004、ZLSSR008、ZLSSR010、ZLSSR011、ZLSSR013、ZLSSR014、ZLSSR016、ZLSSR018、ZLSSR022、ZLSSR024和ZLSSR025)，将每个个体的等位基因转换成为1和0字符串，最终得到朱顶红亲本及其杂交后代的由1、0编号的原始数据，作为每一个朱顶红样本的‘分子身份证’。如果杂交后代间，编号完全一致，则为重复样本。

由表4、表5可见，基于开发的11对EST-SSR标记，♀Luna×♂Naranja的60个杂交后代以及♀Naranja×♂Luna的60个杂交后代，每个均获得各自‘分子身份证’，通过在Excel表格中检索重复项，可将重复的(‘分子身份证’)一致的样本分辨出，从而可以实现杂交后代的快速鉴定，减少后续杂交后代的重复管理，提高选育的效率。

其余4组杂交组合的鉴定，通过该方法，也达到了较好的鉴定效果。

表4 ♀Luna×♂Naran ja杂交后代鉴定结果

表4 ♀Naran ja×♂Luna杂交后代鉴定结果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海市农业科学院

<120> 用于朱顶红杂交后代鉴定的SSR分子标记组合、SSR引物组合及其应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agaaagcccc aaaacttggt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acagaagtcg ccatgcttct 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtggttctc ccagttgaaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

attcgtatgc tatcggcgtc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctgctattgt acgccaagca 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gagtgattcc acgatggagc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggggaggtcc atggtagttt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctctctttcc tccagcatcg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaaaatgtcg ttgaaccgct 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aattgttggg agggttttcc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aatgcttggg ataaagggct 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tgccttacac aaacacccaa 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acagagcaaa agccaacaca 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gttgattcct tggcgttgtt 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aaaataaggc tcgtcgcaga 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gcattccttg agcatcgtct 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tccaaattcc aatgacagca 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ttgggggttt cttcatcaac 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tgagagtgtt tgggaggagg 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

acatctgctc attgtcgtcg 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ggaaaaacgg acgaaaacaa 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cttagggagt ggactctgcg 20

Claims

1.一种朱顶红杂交后代鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）朱顶红亲本和杂交后代DNA提取；

2）采用如下SSR引物组合，对朱顶红亲本和杂交后代PCR扩增；

所述引物组合包括具有如下核苷酸序列的引物对：

序号上游引物序列编号下游引物序列编号 ZLSSR004 AGAAAGCCCCAAAACTTGGT SEQ ID NO:1 ACAGAAGTCGCCATGCTTCT SEQ ID NO:2 ZLSSR008 GGTGGTTCTCCCAGTTGAAA SEQ ID NO:3 ATTCGTATGCTATCGGCGTC SEQ ID NO:4 ZLSSR010 CTGCTATTGTACGCCAAGCA SEQ ID NO:5 GAGTGATTCCACGATGGAGC SEQ ID NO:6 ZLSSR011 GGGGAGGTCCATGGTAGTTT SEQ ID NO:7 CTCTCTTTCCTCCAGCATCG SEQ ID NO:8 ZLSSR013 GAAAATGTCGTTGAACCGCT SEQ ID NO:9 AATTGTTGGGAGGGTTTTCC SEQ ID NO:10 ZLSSR014 AATGCTTGGGATAAAGGGCT SEQ ID NO:11 TGCCTTACACAAACACCCAA SEQ ID NO:12 ZLSSR016 ACAGAGCAAAAGCCAACACA SEQ ID NO:13 GTTGATTCCTTGGCGTTGTT SEQ ID NO:14 ZLSSR018 AAAATAAGGCTCGTCGCAGA SEQ ID NO:15 GCATTCCTTGAGCATCGTCT SEQ ID NO:16 ZLSSR022 TCCAAATTCCAATGACAGCA SEQ ID NO:17 TTGGGGGTTTCTTCATCAAC SEQ ID NO:18 ZLSSR024 TGAGAGTGTTTGGGAGGAGG SEQ ID NO:19 ACATCTGCTCATTGTCGTCG SEQ ID NO:20 ZLSSR025 GGAAAAACGGACGAAAACAA SEQ ID NO:21 CTTAGGGAGTGGACTCTGCG SEQ ID NO:22

3）扩增产物毛细管电泳检测；

4）根据电泳结果，将每个个体的等位基因转换成为1和0字符串，最终得到朱顶红亲本及其杂交后代的由1、0编号的原始数据；

5）将步骤4）的结果与朱顶红亲本及其杂交后代的分子身份证进行比对，进行朱顶红杂交后代鉴定鉴定，如果杂交后代间，编号完全一致，则为重复样本。

2.根据权利要求1所述的朱顶红杂交后代鉴定方法，其特征在于，步骤5）中所述朱顶红亲本及其杂交后代的分子身份证，由以下方法获得：

采用如下SSR引物组合，对朱顶红样品的DNA进行PCR扩增，PCR产物进行电泳检测，将每个个体的等位基因转换成为1和0字符串，最终得到朱顶红亲本及其杂交后代的由1、0编号的原始数据，作为每一个朱顶红样本的‘分子身份证’；所述引物组合包括具有如下核苷酸序列的引物对：

。

3.根据权利要求2所述的朱顶红杂交后代鉴定方法，其特征在于，所述朱顶红亲本中，母本品种选择‘Picotee’、‘Rapido’和‘Naran ja’，父本品种选择‘Blossom peacock’、‘Sunny nymph’、‘Matterhorn’、‘Luna’和‘Naran ja’，共配置6组杂交组合，分别为♀Picotee× ♂ Blossom peacock、♀Rapido× ♂Blossom peacock、♀Picotee× ♂Sunnynymph、♀Picotee×♂Matterhorn、♀ Naran ja×♂Luna、♀Luna×♂Naran ja。