CN113308566B - 大豆主茎节数关联的InDel分子标记的引物和应用 - Google Patents

大豆主茎节数关联的InDel分子标记的引物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种大豆主茎节数关联的InDel分子标记及其引物和应用,涉及分子生物学及遗传育种技术领域。本发明通过利用C025和JD18双亲构建的RIL群体,从中选取极端多主茎节数和极端少主茎节数各30株构建混池,然后利用SLAF‑seq高通量测序技术与BSA相结合的方法在4号染色体检测到与大豆主茎节数相关区域,同时结合双亲重测序信息开发关联区域InDel分子标记,检测与大豆主茎节数相关的分子标记。利用这两对标记对两亲本衍生的RIL群体进行基因型分析,挑选出来的携带有利基因单株主茎节数均值超过携带不利基因单株均值,因此利用这两对标记进行辅助选择可以快速选择育种。

Description

大豆主茎节数关联的InDel分子标记的引物和应用
技术领域
本发明涉及分子生物学及遗传育种技术领域,具体涉及一种大豆主茎节数关联的InDel分子标记及其引物和应用。
背景技术
大豆是世界上重要的农作物之一,也是食用油、植物蛋白和饲料的主要来源,由于目前大豆的供需极度不平衡,因此培育高产优质的大豆品种是育种的最重要目标。大豆主茎节数是从子叶节以上至主茎顶端的有效节数,是一个相对稳定的数量遗传性状,且遗传力较高。该农艺性状不仅是影响大豆株型的主要性状,同时也是影响大豆产量的重要农艺性状之一。
由于前人定位所采用的标记大多数是SSR标记(可开发的大豆SSR标记较少),定位的区间都比较大。随着大豆全基因组测序信息的公布,利用重测序技术可以更精确检测与主茎节数关联位点和基因,由于重测序紧密连锁的分子标记是SNP,但是SNP标记不能直接运用,必需基于SNP转化为CAPA或者dCAPS标记才能应用。但是,由于标记的转化过程耗时长,并且转化成本高,应用较为困难。
发明内容
有鉴于此,本发明利用SLAF-seq高通量测序技术与BSA相结合的方法在4号染色体检测到与大豆主茎节数相关区域,同时结合双亲重测序信息开发关联区域InDel分子标记,并设计了其引物,在大豆主茎节数特征育种中进行了应用,可为鉴定大豆主茎节数特征提供新手段,加速大豆主茎节数特征性状的改良进程,提高育种的准确性和选择效率。利用双亲间的插入缺失核酸位点设计InDel标记作为与大豆主茎节数紧密连锁的分子标记是可以实现的,并且InDel标记与SSR标记同样具有变异稳定,多态性强,成本低的优点
本发明一方面提供了大豆主茎节数关联的InDel分子标记的引物对,其中,所述大豆主茎节数关联的InDel分子标记包括Chr04-38和Chr04-46。
上述大豆主茎节数相关的InDel分子标记的筛选方法,包括如下步骤:
(1)利用在大豆主茎节数有极显著差异的大豆材料C025和JD18杂交,杂种F1代,然后经过多代自交获得RIL(Recombinant Inbred Lines)群体,并进行两年对RIL群体主茎节数特征的表型鉴定。
(2)筛选RIL群体极端少主茎节数30株和极端多主茎节数30株,构建两个极端混池,利用极端混池(BSA)和SLAF-Seq相结合的方法在4号染色体检测到与大豆主茎节数相关的5个关联区域。
(3)依据双亲材料的高通量重测序信息,获取关联区域的InDel信息,并开发InDel标记。利用InDel标记在F2群体进行基因型分析,结果主效位点落在第三个关联区域。
(4)在主效区域开发8个共显性InDel标记,结合RIL群体全部株系进行表型鉴定,最终获得9个交换单株,将主效区间分为6种交换类型,结合表型分析最终将大豆主茎节数位点精细定位到Indel标记Chr04-38和Chr04-46之间,其区间只有171.9kb。
利用上述技术,发明人最终获得了一个控制大豆主茎节数主效区间位点,与发明人自主开发的InDel标记Chr04-38和Chr04-46紧密连锁。
在本发明一种实施方式中,扩增Chr04-38的引物对包括:上游引物序列SEQ IDNO.1:CCTTGCATGCACAAAATCAC,下游引物序列SEQ ID NO.2:TCATGCACTACCGTTTCAGG。
在本发明一种实施方式中,扩增Chr04-46的引物对包括:上游引物序列SEQ IDNO.3:CGATCAGAGCACAATAGCCA,下游引物序列SEQ ID NO.4:GACACCTGAGCACCAAGGAT。
本发明第二方面提供了试剂和/或试剂盒,包括本发明第一方面所述的大豆主茎节数关联的InDel分子标记的引物对。
本发明中,所述试剂盒除包含大豆主茎节数关联的InDel分子标记的引物对之外,还可以包含本领域试剂盒中常规的其他组分,例如缓冲液、酶、dNTP等。可以根据试剂盒使用的目的对其他组分进行合理的选择,在此不做限定。
本发明第三方面提供了第一方面所述的大豆主茎节数关联的InDel分子标记的引物对,或第二方面所述的试剂和/或试剂盒在鉴定大豆主茎节数中的应用。
本发明第四方面提供了一种鉴定大豆主茎节数的方法,通过基因工程技术,采用第一方面所述的大豆主茎节数关联的InDel分子标记引物对鉴定大豆主茎节数。
进一步,在本发明提供的技术方案的基础上,所述鉴定大豆主茎节数的方法,包括以下步骤:
(a)引物设计:设计并筛选,得到本发明第一方面所述的引物对;
(b)DNA提取:提取待检测大豆植株总DNA;
(c)PCR扩增:以步骤(b)获得的总DNA为模板,采用步骤(a)的引物对进行PCR扩增,获得PCR产物;
(d)电泳图谱分析:对所得PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读,根据其大小及位置关系确定所属基因型。
进一步,所述步骤(c)中,引物对中的正向引物和反向引物的浓度均不小于10μmol/L。
进一步,所述步骤(c)中,PCR反应体系:100ng/μl大豆总DNA1μl、正向引物1μl、反向引物1μl、2×Power Taq PCR MasterMix 12.5μl、ddH2O 9.5μl;
进一步,反应程序:94℃ 5分钟,35个循环的94℃ 20秒钟、58℃ 1分钟、72℃ 30秒、72℃ 5分钟。
在一种优选地实施方式中,所述鉴定大豆主茎节数的方法,包括以下步骤:
(1)引物设计:设计并筛选,得到本发明第一方面所述的引物对;
(2)DNA提取:采用CTAB法提取待检测大豆植株总DNA;
(3)PCR扩增:反应体系:100ng/μl大豆总DNA1μl、正向引物1μl、反向引物1μl、2×Power Taq PCR MasterMix 12.5μl、ddH2O 9.5μl;反应程序:94℃ 5分钟,35个循环的94℃20秒钟、58℃ 1分钟、72℃ 30秒、72℃ 5分钟;
(4)电泳图谱分析:对所得PCR产物进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读,根据其大小及位置关系确定所属基因型。
本发明第五方面提供了所述的大豆主茎节数关联的InDel分子标记的引物对,或所述的试剂和/或试剂盒,或所述的鉴定大豆主茎节数的方法在大豆主茎节数辅助选择育种中的应用。
本发明采用上述技术方案具有以下有益效果:
(1)本发明结合双亲重测序信息开发关联区域InDel分子标记,并设计了其引物,在大豆主茎节数特征育种中进行了应用,可为鉴定大豆主茎节数特征提供新手段,加速大豆主茎节数特征性状的改良进程,提高育种的准确性和选择效率。
(2)本发明提供的InDel分子标记变异稳定、检测容易,不需要酶切等繁琐的步骤,并且成本低廉,提高了大豆主茎节数特征育种的选择效率和准确率,从而能加快育种进程。
(3)本发明提供的InDel分子标记与目标区间紧密连锁,物理遗传距离仅为171.9kb,加快了大豆主茎节数特征基因的克隆和功能验证。
附图说明
图1所示为RIL群体主茎节数两年频率分布图。
图2所示为SNP-index关联值在染色体上的分布结果。
图3所示为利用新开发的InDel标记对F2群体进行大豆主茎节数QTL扫描结果。
图4所示为利用分子标记Chr04-38和Chr04-46的引物在部分RIL群体基因组DNA中的扩增结果。
具体实施方式
除非另有定义,本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下面结合具体实施例详细描述本发明,这些实施例用于理解而不是限制本发明。
实施例1 大豆主茎节数RIL分离群体的构建及性状测定
本实施例中使用大豆材料C025和JD18杂交,杂种F1代连续自交5代产生102个单株/株系的RIL群体,2017年和2018年两年调查RIL群体主茎节数,发现分离群体主茎节数表现出广泛的变异(4.03-19.19)(如图1所示)。
实施例2 大豆主茎节数InDel分子标记的开发方法
大豆主茎节数相关的InDel分子标记的开发方法,具体步骤如下:
(1)筛选实施例1获得的RIL群体极端少主茎节数30株和极端多主茎节数30株,构建两个极端混池,利用极端混池(BSA)和SLAF-Seq相结合的方法在4号染色体检测到与大豆主茎节数相关的5个关联区域(如图2所示)。
(2)依据双亲材料的高通量重测序信息,在关联区间共获到4214个InDel位点。
(3)在关联区间选择缺失片段大于40bp的InDels。利用Perl自编程序提取插入缺失相应位置前后各500bp的序列,设计对应的InDel引物。
实施例3 InDel引物多态性的筛选
InDel引物多态性的筛选的流程如下:
(一)从亲本中各随机选择10株DNA等量混合,作为筛选引物的模板。
(二)利用溶解后的引物对亲本DNA进行PCR扩增,
PCR扩增反应体系(20μl):
模板(稀释至25ng/μl)    2μl
Buffer (10×)          2μl
dNTPs(10mM)            0.4μl
Primer-F(10μM)         1μl
Primer-R(10μM)         1μl
Taq酶(5U/μl)           0.2μl
ddH2O                  13.4μl
PCR扩增程序:
(1) 94℃变性3min;
(2) 94℃ 30s,58℃ 45s,72℃ 45s;34个循环;
(3) 72℃ 5min延伸;
(三) 凝胶电泳带型判读
(四) 最终获得了67对共显性InDel引物。
实施例4:大豆F2群体分子标记分析
大豆F2群体分子标记分析,其步骤如下:
(1)采用CTAB法提取F2群体188个单株的DNA;
(2)挑选出多态性引物对F2群体188个单株的DNA进行PCR扩增,然后对PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读。本发明涉及到的分子标记为共显性标记,即差异条带表现为位置上(既扩增产物大小)的变异,分离群体的带型依情况分别读作A、B和H,分别表示来源于C025、JD18和杂合带型。
(3)通过对染色后获得的分子标记带型进行判读,获得分子标记基因型数据。
(4)利用Joinmap4.0软件对F2群体的分子标记基因型数据进行连锁分析以构建分子标记遗传连锁图谱,获得20个连锁群。
(5)利用每个区间开发的新Indel标记对双亲和F2群体进行基因型验证,结果显示在Indel标记Chr04-21和Chr04-55间检测到一个与大豆主茎节数相关的主效QTL(如图3所示),同时这个位置也是关联区间的第三个关联区间。因此我们初步将候选区间缩小到第3区间0.9Mb范围内。
(6)为了进一步精细定位主效区间,我们在第3区间利用新开发的8个共显性Indel标记对102个株系的RIL群体进行基因型鉴定,大豆主茎节数定位于Chr04-38和Chr04-46标记之间,物理位置为171.9kb。
实施例5:大豆主茎节数关联的InDel分子标记在育种中的应用
实施例4中Chr04-38和Chr04-46分子标记在94个株系RIL群体中的基因型鉴定(图4)。
结果表明,分子标记Chr04-38的基因型在60份少主茎节数株系中58份为A,2份为H。而在34份多主茎节数株系中,有22份为B,12份为H,基因型鉴定的准确率达到85.1%。分子标记Chr04-46的基因型在60份少主茎节数株系中58份为A,2份为H。而在34份多主茎节数株系中,有19份为B,15份为H,基因型鉴定的准确率达到81.9%。
以上的结果说明通过分子标记Chr04-38和Chr04-46来预测大豆主茎节数特征,可以提高大豆主茎节数特征育种的选择效率,从而加速育种进程。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 山西农业大学
<120> 大豆主茎节数关联的InDel分子标记的引物和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(“”)
<400> 1
ccttgcatgc acaaaatcac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(“”)
<400> 2
tcatgcacta ccgtttcagg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(“”)
<400> 3
cgatcagagc acaatagcca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(“”)
<400> 4
gacacctgag caccaaggat 20

Claims (7)

1.大豆主茎节数关联的InDel分子标记的引物对,含有所述引物对的试剂和/或试剂盒在鉴定大豆主茎节数中的应用;
其中,所述大豆主茎节数关联的InDel分子标记包括Chr04-38和Chr04-46;
扩增Chr04-38的引物对包括:上游引物序列SEQ ID NO.1:CCTTGCATGCACAAAATCAC,下游引物序列SEQ ID NO.2:TCATGCACTACCGTTTCAGG;
扩增Chr04-46的引物对包括:上游引物序列SEQ ID NO.3:CGATCAGAGCACAATAGCCA,下游引物序列SEQ ID NO.4:GACACCTGAGCACCAAGGAT。
2.一种鉴定大豆主茎节数的方法,其特征在于,通过基因工程技术,采用权利要求1中所述的引物对鉴定大豆主茎节数。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(a)引物设计:设计并筛选,得到权利要求1中所述的引物对;
(b)DNA提取:提取待检测大豆植株总DNA;
(c)PCR扩增:以步骤(b)获得的总DNA为模板,采用步骤(a)的引物对进行PCR扩增,获得PCR产物;
(d)电泳图谱分析:对所得PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读,根据其大小及位置关系确定所属基因型。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述步骤(c)中,引物对中的正向引物和反向引物的浓度均不小于10μmol/L。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述步骤(c)中,PCR反应体系:100ng/μl大豆总DNA1μl、正向引物1μl、反向引物1μl、2×Power Taq PCR MasterMix 12.5μl、ddH2O9.5μl。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述PCR的反应程序:94℃ 5分钟,35个循环的94℃ 20秒钟、58℃ 1分钟、72℃ 30秒,72℃ 5分钟。
7.权利要求2-6任一项所述的鉴定大豆主茎节数的方法在大豆主茎节数辅助选择育种中的应用。
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