CN109234423B - 大豆分子标记及其多态性在鉴定大豆分枝数性状中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了大豆分子标记及其多态性在鉴定大豆分枝数性状中的应用。本发明公开的大豆分子标记为以大豆基因组DNA为模板、采用引物对BRCH进行扩增得到的DNA分子；BRCH由名称为BRCH_F和BRCH_R的单链DNA组成，BRCH_F为与大豆基因组DNA中序列1的第84位上游特异结合的单链DNA，BRCH_R为与大豆基因组DNA中序列1的第84位下游特异结合的单链DNA。实验证明，根据本发明的大豆分子标记区分的基因型中，GG基因型大豆的分枝数显著高于TT基因型大豆，表明，本发明的大豆分子标记与大豆分枝数性状关系密切，可以用来鉴定大豆分枝数性状，并且还可以依据该大豆分子标记进行大豆育种。

Description

大豆分子标记及其多态性在鉴定大豆分枝数性状中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，大豆分子标记及其多态性在鉴定大豆分枝数性状中的应用。
背景技术
大豆是世界重要的粮食和经济作物，是人类植物脂肪和蛋白质的重要来源，在日常膳食结构中占有重要地位。然而，近十几年来，我国大豆总产量持续下滑，我国大豆对外依存度持续增高。2016年我国进口大豆8391万吨，较2015年(8169万吨)增长2.7％，再创历史最高纪录，达到国内大豆产量的7倍左右。造成我国大豆供求紧张的主要原因是单产水平低，因此提高大豆单产一直以来都是大豆育种的重要目标。分枝数是构成大豆产量的重要因子，与大豆产量的提高密切相关，其不仅影响结荚数还影响群体通风透光状况进而影响植株对光能的利用。此外，大豆分枝发育对出苗不齐起到巨大的补偿作用，有效地补充了群体的产量。然而，由于大豆基因组十分复杂，存在大量重复序列；分枝数又是由多基因控制的数量性状，遗传结构复杂，使得大豆分枝性状的研究尚处于起步阶段，未有图位克隆新基因的报道。因此探索大豆分枝发生的遗传机制、定位并克隆分枝相关基因，进而研究大豆中分枝相关基因调控途径，可为培育具有理想株型的高产品种奠定重要理论基础。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何鉴定大豆的分枝数性状。
本发明首先提供了大豆分子标记或其多态性在鉴定或辅助鉴定大豆分枝数性状中的应用；
所述大豆分子标记为以大豆基因组DNA为模板、采用引物对BRCH进行扩增得到的DNA分子；
所述BRCH由名称为BRCH_F和BRCH_R的单链DNA组成，所述BRCH_F为与大豆基因组DNA中序列1的第84位上游特异结合的单链DNA，所述BRCH_R为与大豆基因组DNA中序列1的第84位下游特异结合的单链DNA。
上述应用中，所述BRCH_F可为序列1的第1-20位所示的单链DNA，所述BRCH_R可为与序列1的第173-197位所示单链DNA反向互补的单链DNA。所述大豆分子标记具体可为序列1或序列2所示的DNA分子。
所述引物对BRCH可独立包装，所述引物对BRCH中的两条单链DNA的摩尔比可为1:1。
本发明还提供了能从大豆基因组DNA中扩增得到包含对应于序列1的第84位的DNA片段的引物对，该引物对可为由序列1的第1-20位所示的单链DNA与与序列1的第173-197位所示单链DNA反向互补的单链DNA组成的引物对，也可为能从大豆基因组DNA中扩增得到包含对应于序列1的第84位的DNA片段的任一引物对。
本发明还提供了所述大豆分子标记。
本发明还提供了鉴定或辅助鉴定大豆分枝数性状的成套试剂，所述成套试剂由所述引物对BRCH与限制性内切酶组成；所述限制性内切酶能特异识别下述a1)或a2)：
a1)序列1的第84位及其上下游核苷酸；
a2)序列2的第84位及其上下游核苷酸。
所述限制性内切酶仅能识别a1)和a2)中的一种。
所述限制性内切酶具体可为Taq I，Taq I的识别序列为序列1的第84-87位，TaqI不能识别序列2的第84-87位。
本发明还提供了鉴定或辅助鉴定大豆基因型的方法，所述基因型为GG基因型、GT基因型和TT基因型，所述方法为下述O、P、Q或R：
O、包括：检测待测大豆基因组中对应于序列表中序列1的第84位的核苷酸，如所述待测大豆基因组中两条染色体均为下述g1)的染色体，所述待测大豆为TT基因型大豆；如所述待测大豆基因组中两条染色体均为下述g2)的染色体，所述待测大豆为GG基因型大豆；如所述待测大豆基因组中两条染色体一条为下述g1)的染色体、另一条为下述g2)的染色体，所述待测大豆为GT基因型大豆；
g1)对应于序列1的第84位的核苷酸为T；
g2)对应于序列1的第84位的核苷酸为G；
P、包括如下P1)和P2)：
P1)以待测大豆基因组DNA为模板，利用所述引物对BRCH进行PCR扩增得到PCR产物；
P2)检测步骤P1)得到的PCR产物的序列，如果所述PCR产物对应于序列1的第84位为T，所述待测大豆为TT基因型大豆；如果所述PCR产物对应于序列1的第84位为G和T，所述待测大豆为GT基因型大豆；如果所述PCR产物对应于序列1的第84位为G，所述待测大豆为GG基因型大豆；
Q、包括如下Q1)和Q2)：
Q1)以待测大豆基因组DNA为模板，利用所述引物对BRCH进行PCR扩增得到PCR产物；
Q2)检测步骤Q1)得到的PCR产物的序列，如果所述PCR产物的序列为序列1，所述待测大豆为TT基因型大豆；如果所述PCR产物的序列为序列1和序列2，所述待测大豆为GT基因型大豆；如果所述PCR产物的序列为序列2，所述待测大豆为GG基因型大豆；
R、包括如下R1)和R2)：
R1)以待测大豆基因组DNA为模板，利用所述引物对BRCH进行PCR扩增得到PCR产物，采用限制性内切酶Taq I处理所述PCR产物得到酶切产物；
R2)检测步骤R1)得到的酶切产物的大小，如果所述酶切产物在50-250bp间为一条DNA片段，所述待测大豆为GG基因型大豆；如果所述酶切产物在50-250bp间为三条DNA片段，所述待测大豆为GT基因型大豆；如果所述酶切产物在50-250bp间为两条DNA片段，所述待测大豆为TT基因型大豆。
上述方法中，所述PCR扩增的反应体系中所述BRCH_F和所述BRCH_R的浓度可为0.2-0.5μM，如0.3μM。
所述PCR扩增的退火温度可为55℃-60℃，如58℃。
本发明还提供了鉴定或辅助鉴定大豆分枝数性状的方法，所述方法包括：利用所述鉴定或辅助鉴定大豆基因型的方法鉴定待测大豆的基因型，GG基因型待测大豆的分枝数大于或候选大于GT基因型待测大豆，GG基因型待测大豆的分枝数大于或候选大于TT基因型待测大豆，GT基因型待测大豆的分枝数大于或候选大于TT基因型待测大豆。
本发明还提供了下述X1)或X2)的应用：
X1)检测所述大豆分子标记的物质在鉴定或辅助鉴定大豆分枝数性状中的应用；
X2)所述鉴定或辅助鉴定大豆基因型的方法在鉴定或辅助鉴定大豆分枝数性状中的应用。
上述应用中，所述物质可为所述引物对BRCH。
本发明还提供了大豆育种方法，所述方法包括：按照所述鉴定或辅助鉴定大豆基因型的方法检测大豆的基因型，选择GG或TT或GT基因型的大豆作为亲本进行育种。
实验证明，根据本发明的大豆分子标记区分的基因型中，GG基因型大豆的分枝数显著高于TT基因型大豆，表明，本发明的大豆分子标记与大豆分枝数性状关系密切，可以用来鉴定大豆分枝数性状，并且还可以依据该大豆分子标记进行大豆育种。
附图说明
图1为大豆基因型的鉴定结果。其中，1-8分别为绥农14，泰兴矮脚红，黑河27，辽鲜1号，黑河19，东大2号，N13，合丰40，M为DNA分子量标准，左侧1-10为PCR产物(Taq I酶切前)电泳结果，右侧1-10为Taq I对PCR产物酶切后的电泳结果。
图2为大豆基因型与分枝数的关系。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、利用大豆分子标记鉴定大豆分枝数性状
本实施例提供的大豆分子标记为以大豆的基因组DNA为模板、采用引物对BRCH进行扩增得到的DNA分子。本发明的申请人发现大豆分子标记有两种序列：序列1和序列2，序列1和序列2的不同在于：序列1的第84位为T，序列2的第84位为G，其他序列均相同。
其中，BRCH由名称为BRCH_F和BRCH_R的单链DNA组成，BRCH_F为序列1的第1-20位所示的单链DNA，BRCH_R为与序列1的第173-197位所示单链DNA反向互补的单链DNA。
将引物对BRCH的PCR产物序列为序列1的大豆的基因型记为TT基因型，将PCR产物为序列2的大豆的基因型记为GG基因型，将PCR产物为序列1和序列2的大豆的基因型记为GT基因型。
1、供试大豆
133份大豆种质资源，具体信息如表1所示。
表1、133份大豆种质资源
Figure BDA0001340709490000041
Figure BDA0001340709490000051
2、基因型与分枝数的鉴定
提取表1各大豆的基因组DNA，利用引物对BRCH进行PCR扩增，测序结果表明，PCR产物共有两种序列，其序列分别为序列1和序列2。
PCR扩增的反应体系为：基因组DNA，4μl(30ng/μl)；KOD-Plus-Neo，0.4μl；10×Buffer，3.0μl；2.0mM dNTPs，3.0μl；MgSO4，1.8μl；10μM BRCH_F，1.0μl；10μM BRCH_R，1.0μl；ddH2O，15.8μl；总体积为30μl。其中，KOD-Plus-Neo、10×Buffer和2.0mM dNTPs为东洋纺(上海)生物科技有限公司产品。
PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，68℃延伸55s，34个循环；68℃延伸10min，4℃保存。
用限制性内切酶TaqⅠ酶切各PCR扩增产物并用2.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，部分大豆的结果如图1所示。序列1的第84-87位为TaqⅠ的识别序列，序列2不含TaqⅠ的识别序列，TaqⅠ将序列1所示的PCR产物酶切为大小分别为84bp和113bp的两条DNA片段，而TaqⅠ不能将序列2所示的DNA片段酶切开。
酶切反应体系为：PCR产物，3μl；TaqⅠ，0.3μl；CutSmart，1.5μl；ddH2O，5.2μl；总体积10μl。其中，CutSmart和TaqⅠ为NEB公司产品。
酶切反应程序为：65℃酶切2h，80℃保持20min，4℃保存。
根据上述实验结果，确定各大豆的基因型：酶切产物含有1条的DNA片段的植株为GG基因型植株，测序显示，该条DNA片段的序列为序列表中序列2；酶切产物含有两条DNA片段的植株为TT基因型植株，测序显示这两条DNA片段的序列分别为序列表中序列1的第1-84位和第85-197位；酶切产物含有三条DNA片段的植株为GT基因型植株，测序显示这三条DNA片段的序列分别为序列表中序列2、序列1的第1-84位和第85-197位。结果如表2所示。
统计各大豆在成熟期的分枝数，结果如表2所示。
表2、133份大豆种质资源的基因型与分枝数
Figure BDA0001340709490000061
Figure BDA0001340709490000071
结果显示，TT基因型大豆的分枝数为1.3±0.7个，GG基因型大豆的分枝数为2.0±0.8个。GG基因型大豆的分枝数显著高于TT基因型大豆，说明本实施例的大豆分子标记与大豆分枝数性状关系密切。
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 大豆分子标记及其多态性在鉴定大豆分枝数性状中的应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 197
<212> DNA
<213> 大豆
<400> 1
agagccccaa agaagcagat tttccattaa aacaggaggg tcattctcaa tcaattactg 60
atcctgaaaa ggcaaaggct tcatcgagct cagtagcaca atggccaaga ttgaaagatc 120
caaggattgt gcgagtatct agagcctttg gaggaaaaga caggcacagc aaggttttca 180
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Claims (9)

1.大豆分子标记或其多态性在鉴定或辅助鉴定大豆分枝数性状中的应用；
所述大豆分子标记为以大豆基因组DNA为模板、采用引物对BRCH进行扩增得到的DNA分子，其序列为序列1或序列2；
所述BRCH由名称为BRCH_F和BRCH_R的单链DNA组成，所述BRCH_F为与大豆基因组DNA中序列1的第84位上游特异结合的单链DNA，所述BRCH_R为与大豆基因组DNA中序列1的第84位下游特异结合的单链DNA。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述BRCH_F为序列1的第1-20位所示的单链DNA，所述BRCH_R为与序列1的第173-197位所示单链DNA反向互补的单链DNA。
3.大豆分子标记，所述大豆分子标记为以大豆基因组DNA为模板、采用引物对BRCH进行扩增得到的DNA分子，其序列为序列1或序列2。
4.鉴定或辅助鉴定大豆分枝数性状的成套试剂，由引物对BRCH与TaqⅠ组成，所述引物对BRCH由名称为BRCH_F和BRCH_R的单链DNA组成，所述BRCH_F为序列1的第1-20位所示的单链DNA，所述BRCH_R为与序列1的第173-197位所示单链DNA反向互补的单链DNA。
5.鉴定或辅助鉴定大豆基因型的方法，所述基因型为GG基因型、GT基因型和TT基因型，所述方法为下述Q或R：
Q、包括如下Q1）和Q2）：
Q1）以待测大豆基因组DNA为模板，利用引物对BRCH进行PCR扩增得到PCR产物；所述引物对BRCH由名称为BRCH_F和BRCH_R的单链DNA组成，所述BRCH_F为序列1的第1-20位所示的单链DNA，所述BRCH_R为与序列1的第173-197位所示单链DNA反向互补的单链DNA；
Q2）检测步骤Q1）得到的PCR产物的序列，如果所述PCR产物的序列为序列1，所述待测大豆为TT基因型大豆；如果所述PCR产物的序列为序列1和序列2，所述待测大豆为GT基因型大豆；如果所述PCR产物的序列为序列2，所述待测大豆为GG基因型大豆；
R、包括如下R1）和R2）：
R1）以待测大豆基因组DNA为模板，利用所述引物对BRCH进行PCR扩增得到PCR产物，采用限制性内切酶TaqI处理所述PCR产物得到酶切产物；
R2）检测步骤R1）得到的酶切产物的大小，如果所述酶切产物在50-250bp间为一条DNA片段，所述待测大豆为GG基因型大豆；如果所述酶切产物在50-250bp间为三条DNA片段，所述待测大豆为GT基因型大豆；如果所述酶切产物在50-250bp间为两条DNA片段，所述待测大豆为TT基因型大豆。
6.鉴定或辅助鉴定大豆分枝数性状的方法，包括：利用权利要求5所述方法鉴定待测大豆的基因型，GG基因型待测大豆的分枝数大于GT基因型待测大豆，GG基因型待测大豆的分枝数大于TT基因型待测大豆，GT基因型待测大豆的分枝数大于TT基因型待测大豆。
7.下述X1）或X2）的应用：
X1）检测大豆分子标记的物质在鉴定或辅助鉴定大豆分枝数性状中的应用，所述大豆分子标记为以大豆基因组DNA为模板、采用引物对BRCH进行扩增得到的DNA分子，其序列为序列1或序列2；
X2）权利要求5所述的方法在鉴定或辅助鉴定大豆分枝数性状中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述物质为引物对BRCH，所述引物对BRCH由名称为BRCH_F和BRCH_R的单链DNA组成，所述BRCH_F为序列1的第1-20位所示的单链DNA，所述BRCH_R为与序列1的第173-197位所示单链DNA反向互补的单链DNA。
9.大豆育种方法，包括：按照权利要求5所述的方法检测大豆的基因型，选择GG或TT或GT基因型的大豆作为亲本进行育种。
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