CN111334602A - 大豆分枝数分子标记及其应用 - Google Patents

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CN111334602A CN202010182107.8A CN202010182107A CN111334602A CN 111334602 A CN111334602 A CN 111334602A CN 202010182107 A CN202010182107 A CN 202010182107A CN 111334602 A CN111334602 A CN 111334602A
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Abstract

本发明公开了一种大豆分子标记及获得分子标记的方法与应用，采用图位克隆的方式获得分子标记，以特定的引物对对基因组DNA扩增，并将获得的分子标记应用于大豆分枝数的鉴定中。利用图位克隆的方法，对多分枝数大豆基因组中多分枝决定性碱基序列进行定位，并进行克隆，根据克隆结果，确定大豆是否为多分枝数大豆，进而对其进行种植，以提高大豆的产量。

Description

大豆分枝数分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术及基因工程技术领域，更具体地说是涉及大豆多态性分子标记及其在鉴定大豆分支数中的应用
背景技术
大豆(Glycinemax(L.))是我国主要的粮食作物，既是优质蛋白的主要来源，也是重要的粮油兼用作物。我国常年大豆种植面积9000万亩左右，总产量1200万吨(平均单产12加公斤/亩)；随着人民生活水平的提高和养殖业的快速发展，我国大豆远不能满足需求，自给率每年下降3.6％。因此，进口量不断增加，2017年进口量9553万吨，对进口大豆的依存度85％以上。进口大豆按当前全国大豆亩产计算，需要增加近8亿亩耕地。而造成我国大豆供求紧张的主要原因是单产水平低，因此提高大豆单产一直以来都是大豆育种的重要目标。
分枝数是构成大豆产量的重要因子，与大豆产量的提高密切相关，其不仅影响结荚数还影响群体通风透光状况进而影响植株对光能的利用。此外，大豆分枝发育对出苗不齐起到巨大的补偿作用，有效地补充了群体的产量。
然而，由于大豆基因组十分复杂，存在大量重复序列；分枝数又是由多基因控制的数量性状，遗传结构复杂，使得大豆分枝性状的研究尚处于起步阶段，未有图位克隆新基因的报道。探索大豆分枝发生的遗传机制、定位并克隆分枝相关基因，进而研究大豆中分枝相关基因调控途径，可为培育具有理想株型的高产品种奠定重要理论基础。
因此，如何利用图位克隆的方法提供一种大豆分子标记并对大豆进行分枝数的鉴定是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明利用图位克隆的方法，对多分枝数大豆基因组中多分枝决定性碱基序列进行定位，并进行克隆，根据克隆结果，确定大豆是否为多分枝数大豆，进而对其进行种植，以提高大豆的产量。
一种大豆分子标记，其特征在于，所述大豆分子标记包括：以大豆基因组DNA为模板、采用引物对BR69进行扩增得到的DNA分子；和，以大豆基因组DNA为模板、采用引物对BR77进行扩增得到的DNA分子。
所述BR69引物对包括：
BR69-F：5’-AGTTGACAGGAACTAAAGT-3’，如SEQ ID NO.1所示；
BR69-R：5’-GATAATTCAAGTAAATAGCGA-3’，如SEQ ID NO.2所示；
所述BR77引物对包括：
BR77-F:5’-TCTCTTTGTGTATGTCTTCTCC-3’，如SEQ ID NO.3所示；
BR77-R：5’-TTGTTGCATCCAAATGAGAG-3’，如SEQ ID NO.4所示。
分子标记，即大豆基因组中的一段碱基序列，以该段碱基序列作为大豆基因组的分子标记，并以可以特异扩增出分子标记的引物对BR69和BR77对大豆基因组进行扩增，若能扩增出目的片段，则说明待测大豆可作为多分枝数的大豆种子进行种植；为鉴别大豆分枝数的性状提供了基础，且，两组引物对的灵敏度和特异性优良，防止了假阳性的出现。
作为本发明优选的技术方案，其中，所述DNA分子a中，KF19的大豆分子标记序列为：
ATTTTTTTATTGAATAAAATCAAAATAATCCTATTTTTAAAAACTAAAATTAAGTCTTTTTTTTTACATGCTAGTTAAAGTAATACTTAAGTTTATAACTTATTATAACCTTTTCATTTTTACTTATTGATGTAATCTCTTTTTTATATA，如SEQ ID NO.5所示；
所述DNA分子a中，KN24的大豆分子标记序列为：
ATTTTTTTATTGAATAAAATCAAAATAATCCTATTTTTAAAAACTAAAATCATATTTAAGTCTTTTTTTTTACATGCTAGTTAAAGTAATACTTAAGTTTATAACTTATTATAACCTTTTCATTTTTACTTATTGATGTAATCTCTTTTTTATATA，，如SEQ ID NO.6所示；
其中，所述DNA分子b中，KF19的大豆分子标记序列为：
AATAATTTTATTTTCTAGTAAAGATTGTCACCAACTATAATGAATAAGTTCTTTTGAAAGTTAAAACAAAAATAATTTTTATTGCAGTCATTCAAATAACCTTTATCTAATAAAATACAATATTTCACTTTACATTTAAATTATCTAAACCTTGATAAAAATTAATTTTTACTATACATTAAATACACTTAATTTTTTAGCTTGAAACTCTACAAATATTTCCCCGAATAATACCTCAAGATAAGTACATTACGTGTTCATCATACATGCTGTATATAGT，如SEQ ID NO.7所示；
所述DNA分子b中，KN24的大豆分子标记序列为：
AATAATTTTATTTTCTAGTAAAGATTGTCACCAACTATAATGAATAAGTTCTTTTGAAAGTTAAAACAAAAATAATTTTTATTGCAGTCATTCAAATAACCTTTATCTAATAAAATACAATATTTCACTTTACATTTAAATTATCTAAACCTTGATAAAAATTAATTTTTACTATACATTAAATACACTTAATTTTTTAGCTTGAAACTCCCCGAATAATACCTCAAGATAAGTACATTACGTGTTCATCATACATGCTGTATATAGT，如SEQ ID NO.8所示。
一种获得大豆分子标记的方法，其特征在于，包括下述过程：
1)以多分枝大豆品种KN24为母本，少分枝品种KF19为父本构建分离群体；
2)提取两个KN24和KF19及重组自交系群体叶片基因组DNA；
3)整合大豆遗传图谱，并以公开发表的SSR引物对步骤2)提取得到的亲本基因组DNA进行扩增；扩增产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、固定、染色和显色后，根据目的条带的分子量大小进行判别，筛选多态性引物；
4)从18号染色体的定位区间内筛选新的亲本间多态性标记，共利用10个SSR标记对F2代全部个体的基因型进行检测，结合表型数据将分枝数QTL定位于标记BARCSOYSSR_18_1777和BARCSOYSSR_18_1858之间，约1.6Mb，可解释8.0％的遗传变异，通过查阅文献可以确定这是一个行的分枝数QTL位点；
5)利用18号染色体定位区间内亲本间有多态性的11个SSR标记鉴定KN24×KF19F7代580个重组自交系基因型，结合分枝数表型数据，通过构建遗传连锁图谱进一步将分枝主效QTL定位区间由1.6Mb缩小到113kb，区间内有14个基因，LOD值为19.3，解释14.2％的表型遗传变异；
6)对区间内基因进行测序，在物理位置55882277处，KN24相对于KF19增加了6个碱基，在物理位置55946270处KF19相对于KN24增加了12个碱基，从Phytozome下载含Indel变异位点的序列,利用Primer3web网站开发分子标记BR69与BR77，用其鉴定F7基因型。
7)为了鉴定所开发的Indel标记的实用性，我们设置了12个DNA浓度，分别为100ng/μl、80ng/μl、60ng/μl、40ng/μl、20ng/μl、10ng/μl、5ng/μl、2ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl、0.2ng/μl、0.1ng/μl。BR69在DNA≥2ng的8个浓度时均可以扩增出两亲本目标条带，且两亲本间差异明显。在DNA≤1ng的4个浓度时两亲本均出现杂带，特异性差。BR77在DNA≥5ng的7个浓度时均可以扩增出两亲本目标条带，且两亲本间差异明显，在DNA≤2ng的5个浓度时条带不清晰。
以上技术方案达到的技术效果是：以上技术方案达到的技术效果是：图位克隆，亦称定位克隆，是指基于目标基因紧密连锁的分子标记在染色体上的位置来逐步确定和分离目标基因的技术方法。用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA顺序，也无需预先知道其表达产物的有关信息，因此，根据此方法可快速、准确得出目的基因(多分枝数性状控制基因)的位置，并获得分子标记。
如权利要求1-3任一所述的大豆分子标记在鉴定大豆分枝数中的应用。
作为本发明优选的技术方案，鉴定大豆分枝数的过程包括：
1)提取待测大豆的基因组DNA，并以基因组DNA为模板，采用引物对BR69、BR77进行PCR扩增，得到PCR产物；
2)对PCR产物依次进行6％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和硝酸银染色，得出PCR产物的长度，若BR69的PCR产物为156bp且BR77的PCR产物为268bp，则待测大豆的分枝数为多分枝或候选为多分枝；若BR69的PCR产物不为156bp或BR77的PCR产物不为268bp，则待测大豆的分枝数为少分枝或候选为少分枝。
作为本发明优选的技术方案，PCR扩增反应程序为：
Figure BDA0002412923080000051
一种扩增大豆分子标记的引物对，所述引物如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示。
以上技术方案达到的技术效果是：BR69的最低扩增浓度为2ng/μl，BR77的最低扩增浓度为5ng/μl，可知，两种引物对的灵敏度较高，可准确扩增出分子标记。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为KF19(左)和KN24(右)性状表征图；
图2附图以BR69引物对待测大豆(F7)的基因组进行扩增的扩增产物电泳图，从左至右依次编号，其中泳道1至泳道30依次为表1中编号1至30的多分枝单株，泳道31为垦农24，泳道32为垦丰19；
图3附图为以BR69引物对待测大豆(F7)的基因组进行扩增的扩增产物电泳图，从左至右依次编号，其中泳道1至泳道30依次为表1中编号31至60的多分枝单株泳道31为垦农24，泳道32为垦丰19；
图4附图为以BR69引物对待测大豆(回交群体)的基因组进行PCR扩增后的电泳图，从左至右依次编号，其中泳道1至泳道30依次为表2中编号1至30的多分枝单株，泳道31为垦农24，泳道32为垦丰19；
图5附图为以BR69引物对待测大豆(回交群体)的基因组进行PCR扩增后的电泳图，从左至右依次编号，其中泳道1至泳道30依次为表2中编号31至60的少分枝单株，泳道31为垦农24，泳道32为垦丰19；
图6附图以BR77引物对待测大豆(F7)的基因组进行扩增的扩增产物电泳图，从左至右依次编号，其中泳道1至泳道30依次为表1中编号1至30的多分枝单株，泳道31为垦农24，泳道32为垦丰19；
图7附图以BR77引物对待测大豆(F7)的基因组进行扩增的扩增产物电泳图，从左至右依次编号，其中泳道1至泳道30依次为表1中编号1至30的多分枝单株，泳道31为垦农24，泳道32为垦丰19；
图8附图为以BR69引物对不同浓度的基因组DNA进行扩增的电泳图，其中P1为KN24，P2为KF19，图中白色数字为DNA浓度；
图9附图为以BR77引物对不同浓度的基因组DNA进行扩增的电泳图，其中P1为KN24，P2为KF19，图中白色数字为DNA浓度；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种大豆分子标记，所述大豆分子标记包括：以大豆基因组DNA为模板、采用引物对BR69进行扩增得到的DNA分子；和，以大豆基因组DNA为模板、采用引物对BR77进行扩增得到的DNA分子。
所述BR69引物对包括：
BR69-F：5’-AGTTGACAGGAACTAAAGT-3’，如SEQ ID NO.1所示；
BR69-R：5’-GATAATTCAAGTAAATAGCGA-3’，如SEQ ID NO.2所示；
所述BR77引物对包括：
BR77-F:5’-TCTCTTTGTGTATGTCTTCTCC-3’，如SEQ ID NO.3所示；
BR77-R：5’-TTGTTGCATCCAAATGAGAG-3’，如SEQ IDNO.4所示。
其中，DNA分子a中，KF19的大豆分子标记序列为：
ATTTTTTTATTGAATAAAATCAAAATAATCCTATTTTTAAAAACTAAAATTAAGTCTTTTTTTTTACATGCTAGTTAAAGTAATACTTAAGTTTATAACTTATTATAACCTTTTCATTTTTACTTATTGATGTAATCTCTTTTTTATATA，如SEQ ID NO.5所示；
所述DNA分子a中，KN24的大豆分子标记序列为：
ATTTTTTTATTGAATAAAATCAAAATAATCCTATTTTTAAAAACTAAAATCATATTTAAGTCTTTTTTTTTACATGCTAGTTAAAGTAATACTTAAGTTTATAACTTATTATAACCTTTTCATTTTTACTTATTGATGTAATCTCTTTTTTATATA，，如SEQ ID NO.6所示；
其中，所述DNA分子b中，KF19的大豆分子标记序列为：
AATAATTTTATTTTCTAGTAAAGATTGTCACCAACTATAATGAATAAGTTCTTTTGAAAGTTAAAACAAAAATAATTTTTATTGCAGTCATTCAAATAACCTTTATCTAATAAAATACAATATTTCACTTTACATTTAAATTATCTAAACCTTGATAAAAATTAATTTTTACTATACATTAAATACACTTAATTTTTTAGCTTGAAACTCTACAAATATTTCCCCGAATAATACCTCAAGATAAGTACATTACGTGTTCATCATACATGCTGTATATAGT，如SEQ ID NO.7所示；
所述DNA分子b中，KN24的大豆分子标记序列为：
AATAATTTTATTTTCTAGTAAAGATTGTCACCAACTATAATGAATAAGTTCTTTTGAAAGTTAAAACAAAAATAATTTTTATTGCAGTCATTCAAATAACCTTTATCTAATAAAATACAATATTTCACTTTACATTTAAATTATCTAAACCTTGATAAAAATTAATTTTTACTATACATTAAATACACTTAATTTTTTAGCTTGAAACTCCCCGAATAATACCTCAAGATAAGTACATTACGTGTTCATCATACATGCTGTATATAGT，如SEQ ID NO.8所示。
一种获得大豆分子标记的方法，包括下述过程：
1)以多分枝大豆品种KN24为母本，少分枝品种KF19为父本构建分离群体；KN24和KF19的性状如图1所示；田间表型鉴定结果表明两亲本的平均分枝数分别为6个和0.6个，存在极显著差异且在两年间表现稳定；F2群体符合正态分布说明分枝性状是由数量性状位点所调控的，F2自交产生F3，依次自交产生F7；
2)提取两个KN24和KF19及重组自交系群体叶片基因组DNA；
用CTAB法提取亲本及F2代分离群体叶片的基因组DNA，提取基因组DNA的方法如下：
取等量的混合叶片于2mL离心管，放入钢珠，液氮迅速冷冻，打样。每份样品中加600μLCTAB(加入2％的β-巯基乙醇)，剧烈振荡，混合均匀，65℃水浴60min，加入5μL(10mg/μL)RNaseA，混合均匀，37℃水浴30min；加入600μL酚：氯仿抽提(酚：氯仿＝25:24)，充分震荡混匀，于12000rpm离心10min；小心吸取上清400μL到新的离心管中，加入600μL异丙醇，轻轻颠倒混匀，于12000rpm离心10min，弃上清液；加入500μL70％乙醇，振荡使DNA沉淀悬浮，去上清，洗涤两次；吸净残留液体，晾干DNA沉淀，加入100μL超纯水充分溶解，溶解后置于-20℃保存。
3)整合大豆遗传图谱，并以公开发表的SSR引物对步骤2提取得到的基因组DNA进行扩增；扩增产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、固定、染色和显色后，根据目的条带的分子量大小进行判别，筛选多态性引物；
其中，扩增反应体系如下：DNA:2.0μL(70ng/μL)；EasyTa酶:0.2μL10×EasyTaqBuffer:2.0μL；dNTPmixture:2.0μL；引物(双):2.0μL(2μM)；ddH2O:11.8μL；总体积为20μL；
扩增程序为：先95℃5min；然后95℃30S，55℃30S，72℃30S，扩增35个循环；最后72℃延伸10min，4℃forever。
扩增产物采用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳，PCR产物中加入3.4μL10×LoadingBuffer，混合均匀，取1.0μL混合样品，用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
非变性聚丙烯酰胺凝胶配方(6％PA胶，1L)：丙烯酰胺57g，N，N-亚甲基双丙烯酰胺3g，5×TBE缓冲液100mL。
TBE缓冲液(1L)：Tirs108g，硼酸55g，EDTA7.43g。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤：玻璃板在水中浸泡3-5min，用钢丝球擦洗至玻璃板上无杂质；用70％乙醇再次擦洗玻璃板；待玻璃板干燥后将凹板和平板相对放置，两边各用1个夹子对称夹紧，水准仪调平；取30-40mL6％PAGE胶，加入300μL10％过硫酸铵，30μLTEMED，混匀，于两板中灌胶，如有气泡需排净；缓慢插入梳齿，室温凝胶备用。
采用250V恒压，0.5×TBE缓冲液进行电泳，根据PCR产物大小调整电泳时间，电泳30min左右。电泳后采用硝酸银染色法进行染色。染色液和显影液配方如下：；
银染液：AgNO31g/L；
显影液：NaOH15g/L，甲醛7.5mL/L。
将胶片从玻璃板上剥下，浸入银染液中震荡染色10min；取出后用去离子水冲洗2次；放入显影液中显色5min；去离子水冲洗2次；保鲜膜封胶。
4)从18号染色体的定位区间内筛选新的亲本间多态性标记，共利用10个SSR标记对F2代全部个体的基因型进行检测，结合表型数据将分枝数QTL定位于标记18_1777和18_1858之间，约1.6Mb，可解释8.0％的遗传变异，通过查阅文献可以确定这是一个行的分枝数QTL位点；
5)利用18号染色体定位区间内亲本间有多态性的11个SSR标记鉴定KN24×KF19F7代580个重组自交系基因型，结合分枝数表型数据，通过构建遗传连锁图谱进一步将分枝主效QTL定位区间由1.6Mb缩小到113kb，区间内有14个基因，LOD值为19.3，解释14.2％的表型遗传变异；
6)对区间内基因进行测序，在物理位置55882277处，KN24相对于KF19增加了6个碱基，在物理位置55946270处KF19相对于KN24增加了12个碱基，从Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)下载含Indel变异位点的序列,利用Primer3web网站开发分子标记BR69与BR77，用其鉴定F7基因型。
表1精细定位所用分子标记
Table1 Molecularmarkersinformationforfinemapping
Figure BDA0002412923080000091
Figure BDA0002412923080000101
实施例2
辅助鉴定大豆分枝数建立的方法如下：
提取待测大豆的基因组DNA，并以基因组DNA为模板，采用引物对BR69与BR77进行PCR扩增(PCR反应程序为：95℃5min；95℃30S，55℃30S，72℃30S，35个循环；72℃10min。)，然后依次进行6％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和硝酸银染色。然后进行如下判定：
以待测大豆的基因组DNA为模板，用所述特异性引物BR69与BR77对进行PCR扩增，得出PCR产物的长度，若BR69的PCR产物为156bp且BR77的PCR产物为268bp，则待测大豆的分枝数为多分枝或候选为多分枝；若BR69的PCR产物不为156bp或BR77的PCR产物不为268bp，则待测大豆的分枝数为少分枝或候选为少分枝。
实施例3按照实施例2建立的方法鉴定F7群体与大豆分枝数
对构建的垦农24/垦丰19F7群体的各单株的实际分枝数进行记录，实验结果见表2。随机取30株多分枝的单株和30株少分枝的单株，按照实施例2建立的方法进行鉴定。采用引物对BR69进行PCR扩增后的电泳见图2和图3(图2中A为30株多分枝单株的电泳图，其中泳道1至泳道30依次为编号1至30的多分枝单株，泳道31为垦农24，泳道32为垦丰19；图3中B为30株少分枝单株的电泳图，其中泳道1至泳道30依次为编号31至60的少分枝单株，泳道31为垦农24，泳道32为垦丰19)。采用引物对BR77进行PCR扩增后的电泳见图6和图7(图6中A为30株多分枝单株的电泳图，其中泳道1至泳道30依次为编号1至30的多分枝单株，泳道31为垦农24，泳道32为垦丰19；图7中B为30株少分枝单株的电泳图，其中泳道1至泳道30依次为编号31至60的少分枝单株，泳道31为垦农24，泳道32为垦丰19)。测序结果表明，使用BR69与BR77对垦农24和30株多分枝单株进行PCR扩增后均得到156bp与268bp的片段；使用BR69与BR77对垦丰19和30株少分枝单株进行PCR扩增后均没有得到得到156bp与268bp的片段。结果表明，分枝数变异分子标记BR69与BR77与大豆分枝数具有紧密连锁关系。
表2.垦农24/垦丰19F7群体的各单株的实际分枝数及株高的统计结果
编号 株高 分枝数 编号 株高 分枝数
1 93 8 31 41 2
2 90 9 32 56 1
3 105 9 33 50 1
4 116 9 34 46 1
5 106 8 35 63 1
6 111 9 36 51 0
7 110 8 37 73 2
8 112 8 38 52 2
9 120 9 39 44 2
10 127 9 40 48 2
11 125 8 41 50 2
12 140 10 42 76 2
13 131 9 43 64 2
14 145 9 44 49 2
15 100 8 45 66 1
16 100 9 46 94 2
17 110 8 47 97 2
18 106 8 48 102 1
19 119 8 49 48 2
20 117 8 50 62 2
21 120 8 51 89 2
22 143 8 52 85 2
23 117 9 53 84 2
24 115 8 54 86 1
25 143 8 55 89 2
26 140 8 56 44 1
27 134 8 57 55 1
28 134 9 58 60 1
29 121 9 59 62 1
30 120 10 60 58 1
实施例4按照实施例2建立的方法鉴定回交群体大豆分枝数
对构建的垦农24/垦丰19回交群体的各单株的实际分枝数进行记录，实验结果见表3。随机取30株多分枝的单株和30株少分枝的单株，按照实施例1建立的方法进行鉴定。
表3.垦农24/垦丰19回交群体的各单株的实际分枝数的统计结果
编号 分枝数 编号 分枝数
1 5 31 0
2 5 32 0
3 5 33 0
4 5 34 0
5 6 35 0
6 6 36 0
7 5 37 0
8 5 38 0
9 5 39 0
10 6 40 0
11 5 41 0
12 5 42 0
13 5 43 0
14 5 44 0
15 6 45 0
16 5 46 0
17 5 47 0
18 5 48 0
19 5 49 0
20 5 50 0
21 6 51 0
22 5 52 0
23 5 53 0
24 6 54 0
25 6 55 0
26 5 56 0
27 5 57 0
28 5 58 0
29 6 59 0
30 6 60 0
采用引物对BR69进行PCR扩增后的电泳如图4和图5所示；(图4中A为30株多分枝单株的电泳图，其中泳道1至泳道30依次为编号1至30的多分枝单株，泳道31为垦农24，泳道32为垦丰19；图5中B为30株少分枝单株的电泳图，其中泳道1至泳道30依次为编号31至60的少分枝单株，泳道31为垦农24，泳道32为垦丰19)。测序结果表明，垦农24和30株多分枝单株进行PCR扩增后均得到156bp的片段；垦丰19和30株少分枝单株进行PCR扩增后均没有得到得到156bp的片段。结果表明，分枝数变异分子标记BR69与大豆分枝数具有紧密连锁关系。
实施例5灵敏度检测
灵敏度检测
方法：使用BR69与BR77扩增不同浓度的亲本DNA，垦农24与垦丰19的DNA浓度分别为100ng/μl、80ng/μl、60ng/μl、40ng/μl、20ng/μl、10ng/μl、5ng/μl、2ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl、0.2ng/μl、0.1ng/μl。
PCR扩增体系：DNA2μl，引物(F+R)2μl，buffer2μl，dNTP2μl,EasyTaq酶0.2μl，无菌水11.8μl。
反应程序：95℃5min，95℃30s，55℃30s，72℃30s，72℃5min，35个循环。
对不同浓度下的扩增产物进行6％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图8与图9所示。BR69在DNA≥2ng的8个浓度时均可以扩增出两亲本目标条带，且两亲本间差异明显。在DNA≤1ng的4个浓度时两亲本均出现杂带，特异性差。BR77在DNA≥5ng的7个浓度时均可以扩增出两亲本目标条带，且两亲本间差异明显，在DNA≤2ng的5个浓度时条带不清晰(图3)。究结果表明，BR69和BR77两个标记在亲本DNA浓度为5-100ng/μl之间均扩增出清晰条带。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 大豆分枝数分子标记及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agttgacagg aactaaagt 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gataattcaa gtaaatagcg a 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tctctttgtg tatgtcttct cc 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttgttgcatc caaatgagag 20
<210> 5
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atttttttat tgaataaaat caaaataatc ctatttttaa aaactaaaat taagtctttt 60
tttttacatg ctagttaaag taatacttaa gtttataact tattataacc ttttcatttt 120
tacttattga tgtaatctct tttttatata 150
<210> 6
<211> 156
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atttttttat tgaataaaat caaaataatc ctatttttaa aaactaaaat catatttaag 60
tctttttttt tacatgctag ttaaagtaat acttaagttt ataacttatt ataacctttt 120
catttttact tattgatgta atctcttttt tatata 156
<210> 7
<211> 280
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aataatttta ttttctagta aagattgtca ccaactataa tgaataagtt cttttgaaag 60
ttaaaacaaa aataattttt attgcagtca ttcaaataac ctttatctaa taaaatacaa 120
tatttcactt tacatttaaa ttatctaaac cttgataaaa attaattttt actatacatt 180
aaatacactt aattttttag cttgaaactc tacaaatatt tccccgaata atacctcaag 240
ataagtacat tacgtgttca tcatacatgc tgtatatagt 280
<210> 8
<211> 268
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aataatttta ttttctagta aagattgtca ccaactataa tgaataagtt cttttgaaag 60
ttaaaacaaa aataattttt attgcagtca ttcaaataac ctttatctaa taaaatacaa 120
tatttcactt tacatttaaa ttatctaaac cttgataaaa attaattttt actatacatt 180
aaatacactt aattttttag cttgaaactc cccgaataat acctcaagat aagtacatta 240
cgtgttcatc atacatgctg tatatagt 268

Claims (7)

1.一种大豆分枝数分子标记，其特征在于，所述大豆分子标记包括：以大豆基因组DNA为模板、采用引物对BR69进行扩增得到的DNA分子a；和，以大豆基因组DNA为模板、采用引物对BR77进行扩增得到的DNA分子b；其中，所述BR69引物对包括：
BR69-F:5’-AGTTGACAGGAACTAAAGT-3’，如SEQ ID NO.1所示；
BR69-R:5’-GATAATTCAAGTAAATAGCGA-3’，如SEQ ID NO.2所示；
所述BR77引物对包括：
BR77-F:5’-TCTCTTTGTGTATGTCTTCTCC-3’，如SEQ ID NO.3所示；
BR77-R:5’-TTGTTGCATCCAAATGAGAG-3’，如SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的一种大豆分枝数分子标记，其特征在于，其中，所述DNA分子a中，KF19的大豆分子标记序列为：
ATTTTTTTATTGAATAAAATCAAAATAATCCTATTTTTAAAAACTAAAATTAAGTCTTTTTTTTTACATGCTAGTTAAAGTAATACTTAAGTTTATAACTTATTATAACCTTTTCATTTTTACTTATTGATGTAATCTCTTTTTTATATA，如SEQ ID NO.5所示；
所述DNA分子a中，KN24的大豆分子标记序列为：
ATTTTTTTATTGAATAAAATCAAAATAATCCTATTTTTAAAAACTAAAATCATATTTAAGTCTTTTTTTTTACATGCTAGTTAAAGTAATACTTAAGTTTATAACTTATTATAACCTTTTCATTTTTACTTATTGATGTAATCTCTTTTTTATATA，如SEQ ID NO.6所示；
其中，所述DNA分子b中，KF19的大豆分子标记序列为：
AATAATTTTATTTTCTAGTAAAGATTGTCACCAACTATAATGAATAAGTTCTTTTGAAAGTTAAAACAAAAATAATTTTTATTGCAGTCATTCAAATAACCTTTATCTAATAAAATACAATATTTCACTTTACATTTAAATTATCTAAACCTTGATAAAAATTAATTTTTACTATACATTAAATACACTTAATTTTTTAGCTTGAAACTCTACAAATATTTCCCCGAATAATACCTCAAGATAAGTACATTACGTGTTCATCATACATGCTGTATATAGT，如SEQ ID NO.7所示；
所述DNA分子b中，KN24的大豆分子标记序列为：
AATAATTTTATTTTCTAGTAAAGATTGTCACCAACTATAATGAATAAGTTCTTTTGAAAGTTAAAACAAAAATAATTTTTATTGCAGTCATTCAAATAACCTTTATCTAATAAAATACAATATTTCACTTTACATTTAAATTATCTAAACCTTGATAAAAATTAATTTTTACTATACATTAAATACACTTAATTTTTTAGCTTGAAACTCCCCGAATAATACCTCAAGATAAGTACATTACGTGTTCATCATACATGCTGTATATAGT，如SEQ ID NO.8所示。
3.一种获得大豆分枝数分子标记的方法，其特征在于，包括下述过程：
1)以多分枝大豆品种KN24为母本，少分枝品种KF19为父本构建分离群体，获得F2-F7代；
2)分别提取KN24、KF19及重组自交系群体F2-F7代叶片基因组DNA；
3)整合大豆遗传图谱，并以公开发表的SSR引物(表1)对步骤2提取得到的叶片基因组DNA进行扩增；扩增产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、固定、染色和显色后，根据目的条带的分子量大小进行判别，筛选多态性引物；
4)从18号染色体的定位区间内筛选新的亲本间多态性标记，共利用10个SSR标记对F2代全部个体的基因型进行检测，结合表型数据将分枝数QTL定位于标记BARCSOYSSR_18_1777和BARCSOYSSR_18_1858之间，约1.6Mb，解释8.0％的遗传变异；
5)利用18号染色体定位区间内亲本间有多态性的11个SSR标记鉴定KN24×KF19 F7代580个重组自交系基因型，结合分枝数表型数据，通过构建遗传连锁图谱进一步将分枝主效QTL定位区间由1.6Mb缩小到113kb，区间内有14个基因，LOD值为19.3，解释14.2％的表型遗传变异；
6)对区间内基因进行测序，在物理位置55882277处，KN24相对于KF19增加了6个碱基，在物理位置55946270处KF19相对于KN24增加了12个碱基，从Phytozome下载含Indel变异位点的序列,利用Primer3web网站开发分子标记BR69与BR77，用其鉴定F7基因型。
7)为了鉴定所开发的Indel标记的实用性，我们设置了12个DNA浓度，分别为100ng/μl、80ng/μl、60ng/μl、40ng/μl、20ng/μl、10ng/μl、5ng/μl、2ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl、0.2ng/μl、0.1ng/μl。BR69在DNA≥2ng的8个浓度时均可以扩增出两亲本目标条带，且两亲本间差异明显。在DNA≤1ng的4个浓度时两亲本均出现杂带，特异性差。BR77在DNA≥5ng的7个浓度时均可以扩增出两亲本目标条带，且两亲本间差异明显，在DNA≤2ng的5个浓度时条带不清晰。
4.如权利要求1-2任一所述的大豆分枝数分子标记在鉴定大豆分枝数中的应用。
5.如权利要求4所述的分枝数分子标记在鉴定大豆分枝数中的应用，其特征在于，鉴定大豆分枝数的过程包括：
1)提取待测大豆的基因组DNA，并以基因组DNA为模板，采用引物对BR69、BR77进行PCR扩增，得到PCR产物；
2)对PCR产物依次进行6％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和硝酸银染色，得出PCR产物的长度，若BR69的PCR产物为156bp且BR77的PCR产物为268bp，则待测大豆的分枝数为多分枝或候选为多分枝；若BR69的PCR产物不为156bp或BR77的PCR产物不为268bp，则待测大豆的分枝数为少分枝或候选为少分枝。
6.如权利要求5所述的分枝数分子标记在鉴定大豆分枝数中的应用，其特征在于，PCR扩增反应程序为：
Figure FDA0002412923070000031
7.一种扩增大豆分枝数分子标记的引物对，其特征在于，所述引物如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示。
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