CN113151576B - 与小麦株高主效qtl紧密连锁的分子标记及其获取方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及小麦分子生物技术与育种应用领域，公开了一种与降低小麦株高主效QTL紧密连锁的分子标记及其获取方法和应用，所述降低小麦株高主效QTL位于小麦3D染色体上，命名为QTL‑qPh‑3D，与所述主效QTL‑qPh‑3D位点连锁的分子标记为LD533258900，所述分子标记LD533258900的引物对包括如SEQIDNO:1所示的上游引物序列和如SEQIDNO:2所示的下游引物序列。本发明可用于小麦株高的分子标记育种，为小麦分子育种提供优异基因资源和选择工具，加快小麦株型改良进程。

Description

与小麦株高主效QTL紧密连锁的分子标记及其获取方法和 应用
技术领域
本发明涉及小麦分子生物技术与育种应用领域，具体涉及一种与降低小麦株高主效QTL紧密连锁的分子标记及其获取方法和应用。
背景技术
株高是影响植物倒伏、收获指数以及产量的重要农艺性状。从发现和利用植物矮化基因开启“绿色革命”至今，大量小麦的矮化优良品种应用于农业生产。目前，小麦中已经发现和命名了25个矮化基因(32个等位位点)，其中10个来源于四倍体小麦。矮化育种是小麦高产育种的一个重要途径，在小麦的育种过程中，不断发现和利用矮秆基因使得世界小麦产量得到了进一步增加。因此，矮秆基因的不断探索、挖掘、鉴定、研究和利用，对小麦高产育种意义重大。
基于分子标记遗传连锁或关联分析是挖掘小麦新矮秆基因的重要手段。迄今，小麦21条染色体上均有株高QTL的报道；但3D染色体已报道的株高QTL相对较少。Cadalenetal.（TheorApplGenet,1998,96:933–940）利用Courtot×ChineseSpring衍生的DH群体，检测到3D染色体的Xfba347、Xfba213与株高显著关联；Börneretal.（TheorApplGenet,2002,105:921–936）利用Opta85×W7984国际小麦作图群体，在3DL的Xfba389－Xfbb316区间检测到一个环境特异性株高QTL，该区间对应于中国春3D染色体的532.2－579.9Mb区间；Wangetal.（Euphytica,2010,174:447–458）利用Hanxuan10×Lumai14衍生的RIL群体，检测到1B与3DS间存在株高上位性互作效应，但没有在3D染色体检测到株高加性QTL；Sunetal.（PlantBiotechnolJ,2017,15:953–969）利用自然群体进行GWAS分析，检测到3D染色体的Kukri_rep_c70063_663与株高显著关联；Akrametal.（JApplGenet,2021,62:27–41）利用来自109个杂交组合的312个育种材料进行遗传分析，在两个环境下均检测到M6710与株高显著关联；近期，Luoetal.（TheorApplGenet,2021,134:171–189）利用Zhongmai175×Xiaoyan60衍生的RIL群体，在3D染色体的AX-111571185－AX-94528475区间检测到1个主效株高QTL，能够在5个环境下被重复检测到，对应于中国春3D染色体的520.8－536.03Mb区间，降秆效应来自亲本Xiaoyan60。迄今未见小麦的3D株高QTL的标记信息。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与降低小麦株高主效QTL紧密连锁的分子标记及其获取方式和应用，通过获得的与降低小麦株高主效QTL紧密连锁的分子标记，来检测小麦品种或品系中是否具有降低小麦株高的QTL，以加快小麦优异品种的选育进程。
为实现上述目的，本发明一方面涉及一种与降低小麦株高主效QTL紧密连锁的分子标记，所述降低小麦株高主效QTL位于小麦3D染色体上，命名为QTL-qPh-3D，与所述主效QTL-qPh-3D位点连锁的分子标记为LD533258900，所述降低小麦株高主效QTL位于小麦3D染色体上，命名为QTL-qPh-3D，与所述主效QTL-qPh-3D位点连锁的分子标记为LD533258900，所述分子标记LD533258900的引物对包括如SEQIDNO:1所示的上游引物序列和如SEQIDNO:2所示的下游引物序列。
进一步地，所述分子标记LD533258900的DNA序列如SEQIDNO:3所示。
进一步，本发明涉及一种与降低小麦株高主效QTL紧密连锁的分子标记的获取方法，所述分子标记LD533258900是以小麦基因组DNA为模板，采用如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示引物对进行PCR扩增所得大小为370bp的DNA片段。
在本申请的一种优选实施方式中，所述小麦为以小麦科农9204为亲本，通过采用常规杂交并繁衍选育至F2代以上的科农9204小麦衍生品种或品系。
本发明还有另外一个方面涉及一种采用所述分子标记LD533258900的引物对进行鉴定或辅助鉴定小麦品种或品系的方法，包括如下步骤：
S1、以待测小麦的基因组DNA为模板，采用如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；
S2、将上述PCR产物在6.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上稳压147V电泳分离后，如能够获得扩增产物的分子量为370bp的扩增片段，则该小麦品种或品系为在该基因位点上具有降低小麦株高基因的小麦品种或品系；否则，该小麦品种或品系属于在该位点为不具有降低小麦株高基因的小麦品种或品系。
进一步地，所述步骤S1中的PCR扩增体系，包括：1μl的DNA模板、0.5μl如SEQIDNO:1所示的上游引物、0.5μl如SEQIDNO:2所示的下游引物、5μl的2×TaqPCRStarMix和3μl的ddH2O。
进一步地，所述PCR扩增采用普通PCR扩增程序：95℃变性5min，34个循环的普通PCR程序：95℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸40s；72℃延伸5min；结束扩增，12℃保存。
进一步地，所述小麦品种或品系的DNA是指将小麦植株叶片分离提取后获得的DNA。
进一步地，所述6.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶是指100ml聚丙烯酰胺凝胶溶液中含有5.85g丙烯酰胺和0.15g甲叉丙烯酰胺。
本发明还有另外一个方面涉及一种与降低小麦株高主效QTL紧密连锁的分子标记在检测小麦品种或品系是否含有降低小麦株高的QTL中的应用或在小麦分子育种中的应用。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1）本发明公开的小麦株高紧密连锁的分子标记LD533258900充分体现了小麦品种或品系的株高主效QTL，通过分子标记对小麦品种或品系PCR扩增，可以快捷地对小麦品种或品系是否具有降低株高的QTL进行判断，以便快速筛选出具有降低小麦株高的QTL的小麦品种或品系用于育种，可大大加快小麦优异品种的选育进程，为小麦产量性状分子育种提供优异基因资源和选择工具。
2）将本发明提供的与小麦株高紧密连锁的分子标记方法用于小麦育种，只需检测这些标记的扩增条带特性，可以判断株高主效基因位点的增效变异存在与否，来预测小麦的株高表型，用于指导小麦数量性状改良的育种工作，不仅筛选快速精准，不受环境影响，选择目标明确，而且节约了生产成本，大大提高了小麦品种或品系的选择效率和质量，直接实现了目标基因在小麦种质资源以及育种后代中的鉴定，为小麦育种开拓更多新的遗传资源。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1是本发明小麦品种科农9204的株高主效QTL在染色体3DL上的作图区间；图中：空心长方形代表染色体，左侧是分子标记的名称，右侧数字是标记在染色体上的位置，单位是cM；图中有一种分子标记为InDel标记，即LD533258900，用下划线标出；染色体右方黑色的长方形分别表示株高在各个环境下的QTL作图区间；
图2是本发明在12个环境中均检测到的株高稳定QTL，位于3D染色体上，图中的LOD-E1到LOD-E12指的是在12个环境下（参见表1）其株高QTL检测时LOD值在3D染色体变化峰图，利用IciMapping4.1进行QTL检测，步长为0.1 Mb；LOD值越高，表明该染色体位置存在控制株高QTL的可能性越大；
图3是本发明的标记LD533258900在KJ-RIL家系中的部分扩增结果，其中K为科农9204；J为京411，M为DNALadderMarker；1至40为从188个KJ-RIL家系部分扩增结果；
图4是基于LD533258900对188个KJ-RIL家系基因型分型及8个环境株高差异分析；其中AA为在LD533258900位点基因型与科农9204相同，BB为在LD533258900位点基因型与京411相同；E1到E8为8个环境即：2012–2013中国科学院栾城农业生态系统试验站的高、低氮环境（E1、E2），2013–2014中国科学院栾城农业生态系统试验站的高、低氮环境（E3、E4），2015-2016年在中国科学院遗传与发育生物学研究所北京平西府农场的高、低氮环境（E5、E6）及2017-2018年在河南省新乡市业科学研究院辉县试验基地高、低氮环境（E7、E8）。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。应当指出的是，以下的实施实例只是对本发明的进一步说明，但本发明的保护范围并不限于以下实施例。
本发明所述小麦品种科农9204为审定品种，于2002年通过河北省农作物品种审定委员会审定；2003年通过全国品种审定，品种审定编号为国审麦2003037；
京411为审定品种，于1991年通过北京市品种审定；1992年通过天津市、山西省和全国品种审定；京411可以从国家农作物种质资源库索取，全国统一编号为ZM020984。
本发明中2×TaqPCRStarMix为预混的含有优化浓度的高纯度TaqDNA聚合酶、dNTPs、Mg2+、反应缓冲液和优化剂等成分的即用型2倍浓度的PCR溶液，本产品品牌为TIANGEN，由天根生化科技（北京）有限公司提供。
实施例1
与小麦株高主效QTL紧密连锁的分子标记。
如图1所示，所述小麦株高主效QTL位于小麦3D染色体上，命名为QTL-qPh-3D，与所述主效QTL-qPh-3D位点连锁的分子标记为LD533258900，所述分子标记LD533258900的引物对包括上游引物序列：TCCGGCAGATATTGATTTCCT（如SEQIDNO:1）和下游引物序列：GCTTGTAATAAAACTTGCGCC，如SEQIDNO:2所示。所述分子标记LD533258900的DNA序列如SEQIDNO:3所示。
与小麦株高主效QTL紧密连锁的分子标记的获取方法，用LD533258900标记引物对小麦品种科农9204的DNA进行PCR扩增，其PCR扩增体系为10μl，包括：1μl的DNA模板，0.5μl如SEQIDNO:1所示的上游引物，0.5μl如SEQIDNO:2所示的下游引物，5μl的2×TaqPCRStarMix，3μl的ddH2O；采用普通PCR扩增程序：95℃变性5min，34个循环的普通PCR程序：95℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸40s；72℃延伸5min；结束扩增，12℃保存；扩增产物在6.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上稳压147V电泳分离，银染法，获得对应的扩增产物的分子量为350bp的DNA片段（如SEQIDNO:3所述）。
本发明对PCR仪没有特别的限制，对本实施例中PCR程序采用的型号为：T100TMThermalCycler，PCR扩增均采用该型号PCR仪。
实施例2
采用分子标记LD533258900的引物对进行鉴定或辅助鉴定小麦品种或品系的方法，包括如下步骤：
S1、以待测小麦的基因组DNA为模板，采用如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；所述PCR扩增体系，包括：1μl的DNA模板、0.5μl如SEQIDNO:1所示的上游引物、0.5μl如SEQIDNO:2所示的下游引物、5μl的2×TaqPCRStarMix和3μl的ddH2O，共10μl。所述PCR扩增采用普通PCR扩增程序：95℃变性5min，34个循环的普通PCR程序：95℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸40s；72℃延伸5min；结束扩增，12℃保存。
S2、将上述PCR产物在6.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上稳压147V电泳分离后，如能够获得扩增产物的分子量为370bp的扩增片段，则该小麦品种或品系为在该基因位点上具有降低小麦株高基因的小麦品种或品系；否则，该小麦品种或品系属于在该位点为不具有降低小麦株高基因的小麦品种或品系。所述6.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶是指100ml聚丙烯酰胺凝胶溶液中含有5.85g丙烯酰胺和0.15g甲叉丙烯酰胺。
实施例3
与小麦株高主效QTL紧密连锁的分子标记的筛选方法，具体包括以下步骤：
（i）以株高较低的小麦品种科农9204为母本、以株高较高的小麦品种京411为父本进行杂交得到杂种F1，F1自交产生的F2，F2逐代自交形成含有188个家系的F6代RIL群体；
（ii）用改良的CTAB法，即改良的十六烷基三甲基溴化铵法（VanderBeeketal.,1992）提取上述RIL群体各株系的DNA，采用InDel标记、基于表达序列标签PCR扩增标记即STS标记（图3）对所述家系进行基因型分析，获得所述RIL群体的基因型值材料。InDel(insertion-deletion)标记即插入缺失标记，指的是根据两种亲本中在全基因组中的差异，相对另一个亲本而言，其中一个亲本的基因组中有一定数量的核苷酸插入或缺失。根据基因组中插入缺失位点，设计扩增这些插入缺失位点的PCR引物序列标记位点(sequencetagsite,STS)又称为序列靶位点,是以某一引物进行PCR扩增,使其与基因组DNA序列中的特定位点结合,从而扩增出基因组中的某段区域。图2为在不同环境下利用IciMapping 4.1检测到的LOD峰值，基于KJ-RIL群体株高及穗下节间长QTL初级QTL定位结果如表1所示。
表1 基于KJ-RIL群体株高及穗下节间长QTL初级QTL定位结果
TraitName Position LeftMarker RightMarker LOD PVE(%) Add
株高E1 541.7953 <i>AX-111109273</i> <i>AX-111705267</i> 6.43 16.39 2.91
株高E2 547.2939 <i>AX-111705267</i> <i>AX-109429351</i> 4.46 10.83 3.05
株高E3 541.5953 <i>AX-111109273</i> <i>AX-111705267</i> 6.48 16.60 3.09
株高E4 542.8950 <i>AX-111109273</i> <i>AX-111705267</i> 3.31 9.01 3.02
株高E5 541.0955 <i>AX-111109273</i> <i>AX-111705267</i> 4.29 11.37 3.30
株高E6 540.0957 <i>AX-111109273</i> <i>AX-111705267</i> 4.34 11.43 2.95
株高E7 539.8958 <i>AX-111109273</i> <i>AX-111705267</i> 4.40 11.52 2.85
株高E8 540.0957 <i>AX-111109273</i> <i>AX-111705267</i> 3.92 10.31 2.79
株高E9 521.1003 <i>AX-94785859</i> <i>AX-111163387</i> 5.48 12.87 2.90
株高E10 547.3939 <i>AX-111705267</i> <i>AX-109429351</i> 2.68 6.60 2.88
株高-E11 540.7955 <i>AX-111109273</i> <i>AX-111705267</i> 4.96 12.92 3.14
株高-E12 515.8016 <i>AX-108889732</i> <i>AX-110515857</i> 2.96 7.00 2.76
改良的CTAB法提取叶片DNA的步骤包括：取钢珠和0.2g左右的新鲜叶片放入2.0ml离心管中，快速放在液氮中，摇晃磨成细粉；加CTAB提取液0.8ml，摇匀，65℃水浴30~60min，其间不时反转2-4次摇匀；离心管放置于室温冷却，加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1）或加入等体积酚-氯仿-异戊醇（25:24:1），剧烈摇晃1min混匀；8000rpm离心10min；吸上清600ul至另一1.5ml离心管中；加入0.8倍体积预冷的异丙醇（-20°预冷）沉淀DNA；12000rpm离心6min；倒掉上清，加入适量70%乙醇洗涤沉淀1-2次；离心管倾斜放置于通风橱吹干，待无酒精味，加400ulTE溶解，放-20℃冰箱长期保存。
用LD533258900标记引物对KJ-RIL群体的DNA进行PCR扩增，其PCR扩增体系为10μl，包括：1μl的DNA模板，0.5μl如SEQIDNO:1所示的上游引物，0.5μl如SEQIDNO:2所示的下游引物，5μl的2×TaqPCRStarMix，3μl的ddH2O；采用普通PCR扩增程序：95℃变性5min，34个循环的普通PCR程序：95℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸40s；72℃延伸5min；结束扩增，12℃保存。
扩增产物采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：凝胶浓度6.0%，电泳缓冲液为1×TBE，147V恒压电泳2小时。凝胶制备及电泳过程：将玻璃板水平放置，平板放下边，凹板放上面，中间放上封条，试插梳子是否合适；小板每板需50ml的6%非变性聚丙烯酰胺凝胶，加20ul的TEMED和200ul10%的过硫酸铵，搅拌均匀；用玻璃棒引流灌胶，若有气泡，及时敲打玻璃板将其赶出，灌胶完毕，将梳子插上；约10分钟后，观看凝胶是否凝固；拔下梳子，用去离子水冲洗胶孔，看胶孔是否有残胶，若有，用注射器将其吸出；将凝固好的玻璃板放置于电泳槽，凹槽朝里，用夹子夹住。上下各加满1×TBE；点样后电泳2个小时。进行硝酸银染色步骤：电泳完毕，取下胶块在固定液中固定3min；用去离子水快速冲洗2–3次，每次30–40s；于银染液中染色5–7min后，用水快速冲洗（10s左右，不超过20s）；放入显影液中显影至扩增带出现（一般以Marker出现、颜色不再加深时止）；放入去离子水中停影，拍照，记录带型，得到非变性聚丙烯酰胺凝胶图片（图3）。由此进行结果分析，小麦品种科农9204扩增片段大小为350bp，小麦品种京411扩增片段大小为370bp.
（iv）将RIL群体进行了8个试验环境的田间种植及表型鉴定，分别考察不同年份、不同地点及不同氮水平处理条件下的各个株系的株高，其中8个环境即：2012–2013、2013–2014连续2年在中国科学院栾城农业生态系统试验站（T1及T2：37°53’N，114°41’E）、2015-2016年在中国科学院遗传与发育生物学研究所北京平西府农场（T3：40°06’N，116°24’E）及2017-2018年在河南省新乡市业科学研究院辉县试验基地（T4：35°27’N，113°48’E）种植，每试验环境分高氮（Highnitrogen，HN）和低氮（Lownitrogen，LN）两个处理；
其中LN处理，全年不施肥；而HN处理，每年播种前施300kg•hm-2磷酸二胺和225kg•hm-2尿素作为底肥，拔节期施150kg•hm-2尿素追肥；
其中小麦种植方法：每个系种植2行，每行播40粒；行长3m，株距7.5cm，行距25cm，正常生长及收获；小麦株高测定方法：在小麦孕穗期间在试验田用精确度为0.01的直尺测量小麦。
利用LD533258900作为QTL-qPh-3D紧密连锁的分子标记，进行188个RIL家系基因型分型，分析LD533258900对产量相关性状的遗传效应。利用SPSS13.0对KJ-RIL共188个家系的株高性状值进行差异显著性分析，利用MicrosoftExcel对KJ-RIL群体的株高性状值进行描述性统计，来自京411在qPh-3D的等位基因在降低株高（图4）。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质。
序列表
<110> 鲁东大学
<120> 与小麦株高主效QTL紧密连锁的分子标记及其获取方法和应用
<141> 2021-04-15
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tccggcagat attgatttcc t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcttgtaata aaacttgcgc c 21
<210> 3
<211> 199
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tccggcagat attgatttcc tgcgatgtca aaaacatgga aaaatagcaa ctggcatttg 60
gcactatgtc cataggttag taccaaaaaa tgatataaaa tgattataaa acatccaaga 120
ttgataatat aacagcatgg aacaatcaaa aattatagat acattggaga cgtatcatgg 180
cgcaagtttt attacaagc 199

Claims (2)

1.一种与小麦株高主效QTL紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述小麦株高主效QTL位于小麦3D染色体上，命名为QTL-qPh-3D，与所述QTL-qPh-3D位点连锁的分子标记扩增引物对包括如SEQIDNO:1所示的上游引物和如SEQIDNO:2所示的下游引物，所述分子标记的DNA序列如SEQIDNO:3所示。
2.如权利要求1所述的与小麦株高主效QTL紧密连锁的分子标记在检测小麦株高性状中的应用。
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