CN117265175B - 与小麦不育小穗数主效qtl紧密连锁的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与小麦不育小穗数主效QTL紧密连锁的分子标记及其应用，属于小麦分子生物技术与育种技术领域。其中，所述分子标记为Ssnps‑7D7，核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，序列长度455bp，可由SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物扩增得到。本发明提供的分子标记Ssnps‑7D7充分体现了小麦品种（系）的不育小穗数主效QTL‑qSsnps‑ 7D，其能够快捷且精准地判断小麦品种（系）是否具有不育小穗数主效QTL‑qSsnps‑7D，从而能够快速筛选出具有相对较少的不育小穗数的小麦品种（系），用于下一步育种研究，加快小麦高产新品种的选育进程。
Description
技术领域
本发明涉及一种分子标记及其应用，具体涉及一种与小麦不育小穗数主效QTL紧密连锁的分子标记及其在小麦辅助育种及遗传改良中的应用，属于小麦分子生物技术与育种技术领域。
背景技术
小麦（Triticum aestivum L.）是三大谷物之一，其穗粒数、单位面积穗数、千粒重为构成产量的三要素，保证小麦的稳产高产是保护粮食安全的重要环节。研究显示，小穗数与穗粒数呈正相关，对小麦的产量影响较大，不育小穗数的产生导致穗粒数减少不育。穗部各性状间关系错综复杂，但结实小穗多、穗大粒大一直是小麦育种领域追求的重要目标。通过对不育小穗数进行QTL定位并开发与之紧密连锁的分子标记，可为小穗数遗传改良提供基因标记资源。
现与小麦穗部性状相关的QTL报道有200多篇，这些QTL分布于小麦21条染色体上，但是对于小麦不育小穗数的研究相对较少，与之相关的分子标记相对更少。因此，开发不育小穗数相关分子标记在小麦高产分子育种应用中具有重要的研究意义和价值。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种与小麦不育小穗数主效QTL紧密连锁的分子标记Ssnps-7D7及其应用。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种用于鉴定小麦科农9204和京411及其子代不育小穗数性状的引物对，为能够扩增得到如下DNA片段的引物对：所述DNA片段是以小麦科农9204、京411或其子代基因组DNA为模板，采用如SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物进行PCR扩增所得的DNA片段Ssnps-7D7，所述上游引物和下游引物均为单链DNA分子，该DNA片段Ssnps-7D7的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，序列长度455bp。
前述的引物对在鉴定小麦科农9204和京411及其子代不育小穗数性状中的应用。
利用前述的引物对鉴定小麦科农9204和京411及其子代不育小穗数性状的方法，包括以下步骤：
步骤1：提取待测小麦品种或品系的基因组DNA；
步骤2：以待测小麦品种或品系的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
步骤3：将得到的PCR扩增产物在6.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上稳压电泳分离，如果出现了分子量大小为455bp的扩增片段，则该小麦品种或品系的不育小穗数较其他没有出现分子量大小为455bp的扩增片段的小麦品种或品系的不育小穗数多。
本发明的有益之处在于：
（1）本发明提供的分子标记Ssnps-7D7充分体现了小麦品种（系）的不育小穗数主效QTL-qSsnps-7D，以待测小麦品种（系）的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物对小麦品种（系）进行PCR扩增，能够快捷且精准地判断小麦品种（系）是否具有不育小穗数主效QTL-qSsnps-7D，从而能够快速筛选出具有相对较少的不育小穗数的小麦品种（系），用于下一步育种研究，加快小麦高产新品种的选育进程；
（2）利用本发明提供的与小麦不育小穗数主效QTL紧密连锁的分子标记Ssnps-7D7辅助选育具有相对较少的不育小穗数的小麦品种（系）或鉴定小麦不育小穗数性状时，只需检测PCR扩增产物的特性，就可以辨别小麦不育小穗数主效QTL-qSsnps-7D基因位点的增效变异存在与否，从而预测小麦的不育小穗数表型，用于指导小麦产量性状改良的育种工作，除（1）中所述优点外，还具有以下优点：所鉴定材料受环境影响较小，选择目标明确，节约生产成本，小麦品种（系）的选择效率大大提高，直接实现了目标基因在小麦种质资源以及育种后代中鉴定的目的，为小麦育种提供更多新的不育小穗数基因标记资源。
附图说明
图1是小麦不育小穗数主效QTL-qSsnps-7D在7D染色体上的作图区间，其中，空心长方形代表染色体，染色体左侧是SNP标记的名称，染色体右侧是SNP标记在染色体上的位置，单位是Mb；染色体右侧黑色的长方形分别表示不育小穗数在5个环境下的QTL作图区间；
图2是分子标记Ssnps-7D7在KJ-RIL群体的部分家系中的PCR扩增结果图，其中，M是50bp DNA Ladder，1-28是KJ-RIL部分家系，K是科农9204，J是京411；
图3是8个不同环境下基于分子标记Ssnps-7D7的不育小穗数的单标记分析结果图，其中，黑色柱是京411（记为BB），白色柱是科农9204（记为AA），**表示差异极显著（P<0.01），*表示差异显著（P<0.05）。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
本发明所用的2×Taq PCR预混试剂由天根生化科技（北京）有限公司生产，规格具体为KT211-02（1mL，含染料，蓝色），该预混试剂含有Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应的增强剂和优化剂以及稳定剂，具有快速简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，可最大限度减少人为误差。
本发明所用的质量浓度为6.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制方法为：将5.85g丙烯酰胺和0.15g甲叉丙烯酰胺溶于100mL蒸馏水中。
一、设计和开发与小麦不育小穗数主效QTL-qSsnps-7D紧密连锁的分子标记
设计和开发与小麦不育小穗数主效QTL-qSsnps-7D紧密连锁的分子标记，步骤具体如下：
（1）以7D染色体上等位基因表现为不育小穗数多的小麦品种科农9204为母本、以7D染色体上等位基因表现为不育小穗数少的小麦品种京411为父本进行杂交得到杂种F1，F1自交得到F2，F2逐代自交形成含有188个家系的F8代RIL群体。
（2）将RIL群体进行8个试验环境的田间种植及表型鉴定，分别考查不同年份、不同地点及不同氮水平处理条件下的各个株系的不育小穗数，其中：
（i）8个试验环境分别为：
E1：2011-2012年石家庄低氮；
E2：2011-2012年石家庄高氮（常规大田管理）；
E3：2012-2013年石家庄低氮；
E4：2012-2013年石家庄高氮；
E5：2012-2013年北京低氮；
E6：2012-2013年北京高氮；
E7：2012-2013年新乡低氮；
E8：2012-2013年新乡高氮；
（ii）不同氮水平处理分别为：
LN（低氮）处理：全年不施肥；
HN（高氮）处理：每年播种前施300kg•hm-2磷酸二胺和225kg•hm-2尿素作为底肥，拔节期施150kg•hm-2尿素追肥；
（iii）小麦种植方法具体为：
每个系种植2行，每行播40粒；行长3m，株距7.5cm，行距25cm，正常生长及收获；
（iv）不育小穗数的测定方法为：
收获后每个株系随机选择5株，分出主茎，数出主茎不育小穗数。
（3）用改良的CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法提取亲本和RIL群体各株系的叶片DNA，提取方法具体如下：
（i）取钢珠和0.2g左右新鲜的叶片放入2.0mL离心管中，快速放入液氮中，摇晃磨成细粉；
（ii）加0.8mL CTAB提取液，摇匀，65℃水浴30-60min，其间不时反转2-4次摇匀；
（iii）将离心管放置于室温冷却，加入等体积的氯仿-异戊醇（体积比24:1）或酚-氯仿-异戊醇（体积比25:24:1），剧烈摇晃1min混匀，8000rpm离心10min；
（iv）吸上清600μL至另一1.5mL离心管中，加入0.8倍体积预冷的异丙醇（-20°预冷）沉淀DNA，12000rpm离心6min；
（v）倒掉上清，加入适量70%乙醇洗涤沉淀1-2次，离心管倾斜放置于通风橱吹干，待无酒精味后加400μL TE缓冲液溶解，放-20℃冰箱长期保存。
（4）对188个KJ-RIL家系和亲本DNA进行660K SNP芯片测序，获得物理位置，绘制分子图谱。将8个单一环境中直接调查得到的不育小穗数表型值及高低氮环境分别得到的BLUE值，按照IciMapping v4.1的BIP模块格式要求整理后进行加性QTL定位。以1Mb为步进区间，进行1000次置换检验，确定LOD阈值为2.5；利用KJ-RIL遗传群体在8个环境条件下不育小穗数QTL定位结果，其中，IciMapping 4.1多环境下均在7D染色体同一区段检测到不育小穗数多环境稳定表达的主效QTL-qSsnps-7D（表1），qSsnps-7D LOD值为3.80%-10.26%，PVE值为3.64%-10.50%，减少不育小穗数的优异等位基因来自京411（表1）。加性效应值为0.08-0.17。通过标记性状关联分析，发现来自京411的优异等位基因在所有环境下均能降低不育小穗数，其中在8个环境中达到显著水平，进一步证实该QTL确实和不育小穗数有关。以上结果表明不育小穗数QTL位点是一个可在多环境下重复鉴定的主效QTL，因此可进一步进行精细定位。
表1 基于KJ-RIL群体的不育小穗数初级QTL定位结果
注：由于确定LOD阈值为2.5，而E1、E4、E7和E8的LOD值均小于2.5，所以E1、E4、E7和E8的相关数据均不在表1中。
（5）根据科农9204和京411基因组重测序数据比对结果，在定位区间内Chr7D：244954628位置处开发了一个InDel （Insertion-Deletion）标记Ssnps-7D7，其在靶区间的位置如图1所示。相对于科农9204而言，京411基因组中有50bp的碱基插入，根据该位点设计相应的PCR 引物对，设计得到的PCR 引物对的序列具体如下：
上游引物：CAAAGGCCCATGATCCATCG（SEQ ID NO:1）；
下游引物：TGGATCTTGCTTGCCAGTTG（SEQ ID NO:2）。
（6）利用上述PCR 引物对对科农9204和京411以及KJ-RIL群体的叶片DNA分别进行PCR扩增，其中：
（i）PCR扩增反应体系为10μL，具体包括：
1μL浓度为50ng/μL的DNA模板；
0.5μL浓度为10μmol/L的SEQ ID NO:1所示的上游引物；
0.5μL浓度为10μmol/L的SEQ ID NO:2所示的下游引物；
5μL 2×Taq PCR预混试剂；
反应体系用ddH2O补至总量为10μL。
（ii）PCR扩增程序具体如下：
95℃预变性5min；
95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸40s，循环34次；
72℃延伸5min；结束扩增，12℃保存。
将得到的PCR扩增产物用质量浓度为6.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行稳压电泳分离，每块胶需50mL质量浓度为6.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，向每50mL非变性聚丙烯酰胺凝胶中再添加20μL四甲基乙二胺（TEMED）和200μL质量浓度为10%的过硫酸铵溶液，搅拌均匀，接下来进行凝胶制备和电泳，具体步骤如下：
（i）将玻璃板水平放置，平板放下边，凹板放上面，中间放上封条，试插梳子是否合适；
（ii）用玻璃棒引流灌胶，灌胶完毕后将梳子插上；
（iii）待凝胶凝固后拔下梳子，用去离子水冲洗胶孔，将凝固好的玻璃板放置于电泳槽中，凹槽朝里，用夹子夹住；
（iv）电泳缓冲液为1×TBE，点样0.3μL，然后于147V恒压电泳2.5h；
（v）电泳完毕后进行硝酸银染色，具体的：取下胶块，在固定液中固定3min；用去离子水快速冲洗2-3次，每次30-40s；于银染液中染色5-7min，用水快速冲洗；放入显影液中显影至扩增条带出现；放入去离子水中停影，拍照，得到非变性聚丙烯酰胺凝胶图片，记录带型。
小麦品种科农9204的PCR扩增片段的大小为455bp，小麦品种京411的PCR扩增片段的大小为505bp（图2）。
二、利用分子标记Ssnps-7D7对188个KJ-RIL家系进行基因型分析
利用上述开发的InDel标记Ssnps-7D7对所述188个KJ-RIL家系进行基因型分析，获得RIL群体的基因型值。PCR扩增反应体系的组成、PCR扩增程序以及非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法均与前述相同。
如图2所示，科农9204的PCR扩增片段的大小为455bp，京411的PCR扩增片段的大小为505bp。经筛选，在所述188个KJ-RIL家系中，带型与科农9204相同的有85个，相应的小麦品种（系）的不育小穗数相对较多，预测这些小麦品种（系）含有增加小麦不育小穗数的等位基因；带型与京411相同的有79个，相应的小麦品种（系）的不育小穗数相对较少，预测这些小麦品种（系）含有减少小麦不育小穗数的优异等位基因。
三、分析不同环境下不育小穗数主效QTL-qSsnps-7D的不育小穗数遗传效应
利用分子标记Ssnps-7D7与不育小穗数主效QTL-qSsnps-7D的连锁关系，根据第二部分的条带读取结果对所述188个KJ-RIL家系进行基因型分型，分析不同环境下不育小穗数主效QTL-qSsnps-7D的不育小穗数效应。利用SPSS 25.0对所述188个KJ-RIL家系的不育小穗数进行差异显著性分析。分析结果见图3。结果表明，在所有环境中，来自京411的等位基因均能减少不育小穗数，其中有5个环境达到显著水平。
以上结果说明本发明提供的分子标记Ssnps-7D7可以应用于小麦不育小穗数的分子标记辅助选择育种，例如：选育具有减少不育小穗数基因型的小麦、鉴定或辅助鉴定小麦不育小穗数性状等。
需要说明的是，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，并非对本发明实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。凡属于本发明技术方案所引申出的显而易见变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (1)
1.由SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物组成的引物对在鉴定小麦科农9204和京411及其子代不育小穗数性状中的应用。
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