KR100264743B1 - Rapdmarker를이용한벼의유묘내냉성에관여하는양적형질유전자지도(qtl)와저온저항성벼품종선발방법 - Google Patents

Rapdmarker를이용한벼의유묘내냉성에관여하는양적형질유전자지도(qtl)와저온저항성벼품종선발방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 RAPD Marker를 이용하여 벼의 유묘내냉성에 관여하는 양적형질유전자 지도(QTL)와 저온저항성 벼 품종의 선발방법에 관한 것이다.
본 발명은 RAPD marker에 의해 marker간 평균 거리가 10cM이고 총 1,419.7cM인 유전자 연관지도를 제공하는 효과가 있고,본 발명에 의한 유전자 연관지도는 염색체상에 위치하고 있는 표식인자수가 많기 때문에 질·양적 형질에 관여하는 유전자 탐색의 정확도나 유전해석의 효율성을 크게 향상시킬 수 있으며, 내냉성 품종육성에 RAPD marker를 이용하면 신품종육성에 소요되는 시간과 노력을 줄일수 있어 육종의 효율을 극대화 시킬 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

Description

Ｍａｒｋｅｒ ＲＡＰＤ를 이용한 벼의 유묘내냉성에 관여하는 양적형질유전자 지도(ＱＴＬ)와 저온저항성 벼 품종 선발방법{Map QTL related to cold tolerance at seedling stage of rice using RAPD marker and selection method of cold tolerant rice variety}
본 발명은 저온저항성 벼품종을 선발하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 RAPD Marker를 이용한 벼의유묘내냉성에 관여하는 양적형질유전자지도(QTL)와 저온저항성 벼 품종 선발방법에 관한 것이다.
벼는 밀 다음의 세계 제 2의 식량작물로서 세계 인구의 반이상이 쌀을 주식으로 하고 있는 작물이다. 쌀은 아시아에서90% 이상이 생산되고 아시아에서 주로 소비되고 있다. 벼의 내냉성에 관여하는 유전자는 환경의 영향을 많이 받는 양적형질로서 그 유전양식이 복잡한 것으로 알려져 있다. 양적형질의 유전적 특성도 통계적 방법에 의해 분석될 수 있지만 질적형질과는 달리 개개 유전자의 작용에는 환경요인의 영향이 크고 그 작용효과 또한 높지 못하기 때문에 관여 유전자의 수나 염색체상의 위치를 밝힌다는 것은 사실상 불가능한 일이었다. 그러나 최근 분자생물학의 발달과 더불어 DNA marker를이용한 유전자지도의 작성법이 여러 식물에서 구체화되면서 질적형질 뿐만 아니라 양적형질에 관여하는 유전자좌 분석 및유전자 지도 작성에 대한 연구도 몇몇 식물에서 수행되어지고 있다. DNA marker를 이용한 양적형질유전자좌(quantitativetrait loci; QTL) 분석은 양적형질에 관여하는 유전자의 작용효과와 염색체상의 위치를 구체적으로 밝힐 수 있다는 장점이 있다.
DNA marker를 이용한 유전분석이나 유전자지도 작성에는 DNA를 제한효소로 절단하여 나타나는 DNA 단편 크기의 다형성을이용하는 RFLP(restriction fragmen length polymorphism)분석법과 게놈 DNA를 주형으로 여러종류의 작은 프라이머를 이용하여 DNA를 증폭시키는 PCR(polymerase chain reaction)분석법이 공지되어 있다. 초기에는 주로 RFLP법에만 의존해 왔지만 최근에는 PCR 기술은 분석과정이 복잡하지 않고, 방사선을 사용하지 않음으로서 위험성이 적으며 분석에 필요한 시료량도 적게 소요될 뿐만 아니라 PCR에 의해 증폭된 DNA의 변이성은 합성 프라이머의 염기배열을 임의로 바꾸어 이용함으로써 매우 다양한 DNA band pattern의 변이를 얻을 수도 있어서 이 방법에 대한 관심이 모아지고 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 RAPD marker를 이용한 벼의 내냉성 유전자원중에서 저온에 견디는 능력이 높은 것을 효율적으로 선발하여 이를 제공하는데 있다.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여 저온에 관련된 RAPD marker를 이용하여 벼 품종간 내냉성 정도를 조사하고, 기온조건이 18℃와 정상의 온도(25℃)와의 유묘초장단축률 정도 등에 대한 실험을 수행하였다.
이하, 본 발명의 구체적인 구성 및 작용을 설명한다.
도 1은 10개 수도품종의 유묘기 4℃(24시간) 저온처리 결과를 나타낸 RNA 수준을 보인 Dot blot Analysis 결과이다.
도 2는 RFLP Marker중 하나인 G309와 게놈 DNA간의 서던 하이브리다이제이션 결과를 보인 사진이다.
도 3은 공시품종 Dular/Toyohatamochi 조합 F2집단의 게놈 DNA와 프라이머 OPXO3와의 PCR 분석결과를 보인 사진도이다.
도 4는 공시품종 Dular/Toyohatamochi 조합 F2집단에서의 다양한 band를 나타낸 54개의 RFLP marker와의 연관분석에서염색체 번호가 확인된 84개의 RAPD marker를 이용하여 전체 게놈의 크기가 1419.7cM이고 marker간 평균거리가 10cM인 유전자 연관지도를 나타낸 것이다.
도 5는 공시품종 Dular/Toyohatamochi 조합 F2집단의 18℃에서의 유묘초장에대한 빈도분포도를 나타낸 것이다.
도 6은 MAPL-MQTL 프로그램의 LOD값에 근거하여 QTL 분석을 실시한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 공시품종 Dular/Toyohatamochi 조합 F2집단의 18℃에서의 유묘 내냉성에 관여하는 양적형질유전자(QTL)지도를 나타낸 그림이다.
도 8은 인디카형 품종 K-sen4/자바니카형 품종 Silewah 조합의 F3291계통의 18℃ 유묘기의 초장에 대한 빈도분포(연속변이)를 나타낸 그림이다.
본 발명은 내냉성이 상이한 벼품종 및 잡종집단을 공시하여 4℃와 18℃에서의 품종간 내냉성정도를 분석하는 단계; 저온처리된 벼의 전해물질 축적정도와 내냉성과의 관계를 분석하는 단계; RFLP 및 RAPD marker를 이용한 벼 유전자지도 작성과 내냉성 관련 양적형질유전자좌의 분석하는 단계로 구성된다.
이하, 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 실시예와 실험예를 들어 구체적으로 설명한다.
실험예 1. 내냉성 검정
4℃에서의 벼 품종별 내냉성 정도를 조사하기 위하여 "花嶺벼"외 9품종을 상토를 넣은 프라스틱 사각상자(40×60×10cm)에 품종당 63립의 종자를 파종하고, 25℃의 온실에서 2주 동안 재배한 후 4℃로 조절된 생장상(4,000lux, 습도 100%, 12시간/일)에서 2일간 처리하였다. 저온처리된 유묘상자를 28℃로 조절된 생장상에서 1주일간 경과시킨 후 품종별 고사개채수를 조사하여 저온감수성값(0: 고사개체가전혀 없음, 1: 1∼20% 고사, 2: 21∼40% 고사, 3: 41∼60% 고사, 4: 61∼80% 고사, 5: 81∼100% 고사)으로 나타내었다.
18℃에서 내냉성 검정에는 "花嶺벼"외 11품종을 공시하여 4℃ 내냉성 검정에서와 같은 방법으로 파종하고, 18℃와 25℃의 온실(4,000lux, 12시간/일)에서 15일간 재배한 다음 두 온도 조건간의 품종별 초장을 조사하여 18℃의 초장단축율을 구하였다. 내냉성이 다른 두품종이 교잡된 잡종집단에서 내냉성의 분리양상을 조사하기 위하여 "Dular/Toyohatamochi" 조합의 F2집단을 그들의 양친과 함께 공시하여 앞 실험에서와 같은 방법으로 파종하고 18℃, 4,000 lux(12시간/일)로 조절된 온실에서 3주간 재배한 다음 초장에 대한 빈도분포를 조사하고 양친 및 F2집단의 초장을 QTL 분석자료로 이용하였다. QTL분석에서 18℃ 내냉성과 관련성이 높은 것으로 판명된 RAPD marker의 검증을 위하여 내냉성이 약한 "K-sen4"와 내냉성이강한 "Silewah"가 교배된 후대 291 계통(F3)을 그들의 양친과 함께 최아된 종자를 프라스틱 상자(40×60×10cm)에 파종하여 25°/20℃(주/야)로 조절되는 온실에서 1주 동안 성장시켰다. 그후 육묘상자를 수온이 18℃(깊이 10cm)이고 기온이 24°/20℃(주/야)로 유지되는 냉수처리상자(50×70×30cm)로 옮겨 3주동안 처리한 다음 계통별로 초장을 조사하여 초장의변이분포 조사와 QTL 분석에 이용하였다.
실험결과 표 1에서 보듯, 일본에서 재배되고 있는 "Hayayuki", "Mitak", "Nipponbare", "Toyohatamochi"등의 저온감수성값은 1.0∼1.5로 나타났고, 우리나라 품종인 "花嶺벼", "一品벼", "盈德벼"의 저온 감수성 값은 2.0∼3.0으로 나타난데 비해 "Dular", "Er Jiu Qing", "Kele"등의 인디카 품종들은 저온감수성값이 4.0∼5.0으로 높게 나타나, 4℃ 조건에서는 인디카형 품종에 비해 자포니카형 품종들의 내냉성이 높게 나타났다.
10개 수도품종의 유묘기 내냉성에 대한 품종간 차
품 종 원산지 내냉성(O∼5)
Exp.Ⅰ Exp.Ⅱ 평균
Hayayuki Japen 1 1 1.0
Mitak Japen 1 2 1.5
Nipponbare Japen 2 1 1.5
Toyohatamochi Japen 1 2 1.5
Hwayeongbyeo Korea 3 3 3.0
Ilpoombyeo Korea 2 2 2.0
Yeongdeogbyeo Korea 3 2 2.5
Dular India 5 3 4.0
Er Jiu Qing China 5 5 5.0
Kele India 5 5 5.0
주: 내냉성은 2주 정도된 묘목을 냉처리(4℃에서 2일간)후 7일후에기록하였다.
한편, "花嶺벼"외 11품종을 공시하여, 18℃와 25℃로 조절되는 온실에서 15일동안 재배한 후 두처리 간의 품종별 초장과초장단축율을 비교한 실험결과는 하기 표 2와 같다. 공시품종중에서 "Silewah"와 "Toyohatamochi"의 초장단축율이 각각18%와 25%로 다른 품종에 비해 낮았고, 그외 품종들은 품종의 유형에 관계없이 38∼59%의 비교적 높은 단축율을 나타내었다.
10개 쌀 품종중 유묘기에서 냉처리와 비처리에서의 식물 생장비교
Cultivars Plant height(mm) Rate of shoot reduction(b-a/b×100)
18℃(a) 25℃(b)
Hayayuki 42 79 47
Mitak 29 70 59
Nipponbare 36 67 46
Toyohatamochi 81 108 25
Hwayeongbyeo 40 71 44
Ilppombyeo 21 35 40
Yeongdeogbyeo 55 89 38
Dular 97 177 45
Er Jiu Qing 30 55 46
Kele 86 160 46
K-sen4 83 168 51
Silewah 225 311 18
실험예 2. RNA 추출과 dot blot 분석
저온처리하에서 벼 전해물질의 축적과 내냉성과의 관계를 조사하기 위하여, 공시품종(표 1)의 종자를 4℃ 내냉성 검정실험에서와 같은 방법으로 파종하고 25℃ 온실에서 2주간 재배한 다음 4℃에서 24시간 처리한 후 일부과정이 부분적으로 수정된 Pawlowski 등의 방법에 따라 RNA를 추출하였다. dot blot 분석을 위하여 저온처리된 벼 잎에서 추출되어 nylonmembrane상에 blotted 시킨 RNA와 이미 저온 유도성 유전자로 밝혀진 RC167과 RC235의 cDNA 프로브와 하이브리다이제이션시킨 결과를 Bio Imagine Analyzer(Fujix, BAS 1000MAC)에 의해 전해물질의 축적정도를 조사하였다.
저온처리된 벼의 전해물 축적 여부를 RNA 수준에서 검정하기 위하여, 공시품종의 종자를 포트에 파종하고 28℃의 온실에서 2주간 성장시켜 4℃의 생장상에서12시간 처리한 후 각 식물체의 잎 1g 채취하여 전체 RNA를 추출한 다음, cDNA(RC167, RC235)를 프로브로 하여 dot blot 분석을 실시한 결과는 도 1에 나타낸 바와 같다. RC167 프로브를 이용한것에서 자포니카형 품종들은 거의 동일하게 뚜렷한 반응을 나타내었지만 인디카형 품종들의 경우에는 반응이 나타나지 않았다. RC235 프로브에서는 10품종 모두 반응이 나타났지만 자포니카형에 비해 인디카형 품종들의 반응이 뚜렷하였다.
실험예 3. DNA 추출
PCR 반응과 서던 하이브리다이제이션을 위하여, "Dular/Toyohatamochi" 조합의 양친과 F2집단 및 "K-sen4/Silewah" 조합의 F3세대를 각각 18℃와 25℃에서 3주간 재배한 후 CTAB법에 따라 다음과 같이 DNA를 추출하였다. 각 식물체의 건전한잎 1g을 막자사발에 넣고 액체질소로 급냉동시킨 상태에서 미세한 분말로 마쇄하고 2xCTAB buffer 1㎖과 1xCTAB 0.5㎖를넣어 혼합한 다음, 50㎖ cap tube에 옮겨서 55℃에 30분동안 반응시키면서 2∼3회 가볍게 혼합하였다. 여기에 동일한 양의chloroform을 넣어 30분간 둔 다음 원심분리(4,000rpm, 7분, 15℃)한 후 상층액을 15㎖의 폴리프로필렌튜브에 옮겨서,10% CTAB-NaCl 325㎕와 chloroform 3.5㎕을 넣고 잘 혼합하여 원심분리(4,500rpm, 10분, 15℃)하여 상층액을 15㎖의 새로운 폴리프로필렌튜브에 옮겼다. ppt(precipitation) CTAB 용액(1% CTAB, 50mM Tris pH 8.0, 10mM EDTA) 3.5㎖을 넣어 12시간 이상 상온에 방치한 다음 0.7㎖와isopropanol 0.42㎖를 넣어 DNA를 엉키게 한 다음 회수하였다. 이렇게 회수된 DNA를 80% 에탄올로 세척하여 건조시키고 TE buffer로 100배 희석한 다음 0.8% 아가로즈 겔에 전기영동하고 260nm UV 하에서Ethidium Bromide(EtBr)에 의해 나타난 염색정도로서 DNA 농도를 조절하여 PCR과 서던 하이브리다이제이션에 이용하였다.
실험예 4. RFLP marker 선발
벼에서 이미 각 염색체상의 위치가 알려져 있는 RFLP marker를 이용하여 "Dular"와 "Toyohatamochi"간에 다형성 band를나타내는 marker를 선발하고자, "Dular"와 "Toyohatamochi"의 잎으로부터 추출한 게놈 DNA 2㎍를 BamH I, Bgl Ⅱ, EcoRV, Hind Ⅲ와 같은 4종류의 제한효소에 6∼12시간 처리한 다음 0.8%의 아가로즈 겔상에서 전기영동한 후 nylon membranefilters(Nytran, S＆S)에 전이시키고, Sambrook등의 방법에 의하여32PdCTP로 표지된 프로브 DNA로 하이브리다이제이션하여 다형성 band를 나타내는 marker를 선발하였다. 실험에 사용된 프로브 DNA는 일본 벼게놈연구팀(Rice Genome ResearchProgram, RGP)에서 제공받은 Set Ⅰ의 72개와 SetⅡ의 95개 및 게놈 DNA로부터 제작한 프로브 49개를 포함해서 총 218개의 marker를 이용하였다.
실험결과, 총 218개의 RFLP marker중 "Dular"와 "Toyohatamochi"의 게놈 DNA와의 서던 하이브리다이제이션에 의해 다형성을 보인 marker는 54개로 나타났다. 표 3에서 보는 바와 같이, 선발된 RFLP marker 54개중 45개는 자방친("Dular")과화분친("Toyohatamochi")에 모두 band를 나타내었으나 9개의 marker(G165B, G1314B, G282, G124B, G260, G122, G1314B,G2132, G1125)는 양친중 어느 편친에서만 band를 나타냈다.
54개의 RFLP marker중의 하나인 G309와 게놈 DNA간의 서던 분석결과는 도 2와 같다.
실험예 5. RAPD marker 선발
유전자지도 작성에 필요한 RAPD marker를 선발하기 위한 DNA 증폭용 시료 준비는 500㎕ PCR reaction tube에 공시품종인"Dular"와 "Toyohatamochi"의 게놈 DNA 1ng, 프라이머 25ng, dATP, dTTP, dGTP, dCTP를 각각 2.5mM, buffer(10mM Tris pH8.3, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2), Taq-polymerase 0.5unit를 섞은 다음 반응용액이 총 10㎕되게 한 후 PCR 분석에 이용하였다. Thermo Cycler(Gene Amp PCR System 9600)를 이용한 첫 변성은 96℃에 5분간, 그후의 변성은 96℃에서 15초,annealing은 38℃에서 15초, 그리고 DNA 합성은 72℃에서 7분으로 하였다. 합성된 DNA는 1.2% 아가로즈 겔로 전기영동(50volts, 2시간)하고 EtBr에 염색하여 UV 램프에서 band를 확인하였다. PCR에서 두 품종간에 다형성으로 나타나는 band를 RAPD marker로 사용하였다. 본 실험에서 사용 10-mer 프라이머는 일본 농림수산성 북해도 농업시험장에서 1995년Operon사(Operon Technologies, Inc. Alameda, CA)로부터 구입산 800개중에서 662개를 사용하였다. 그리고 18℃에서 벼의chlorosis 반응과 밀접하게 연관되어 있고 이미 sequence가 밝혀진 RFLP marker L442와 C609를 프라이머 sequence가 20-mer되게 제작한 다음 각각 PL442와 PC609라 명명하여 RAPD marker로 이용하였다.
RAPD marker를 선발하기 위해 공시품종인 "Dular"와 "Toyohatamochi"의 게놈DNA와 664개의 프라이머를 PCR로 증폭시킨결과, 다형성 band를 포함하고 있는 프라이머는 하기 표 4에 나타낸 바와 같이 전체의 11%에 해당하는 74개로 나타났다.
이들 프라이머에 의해 나타난 band 수는 총 289개로 증폭되었으며, 그 크기는 180∼4,500bp까지 다양하게 분포하였다. 이중에서 "Dular"와 "Toyohatamochi"의 어느 한쪽에서만 나타난 dominant band는 157개로 확인되었다. 1차 선발된 157개의band를 대상으로 PCR 분석을 연속적으로 3회 수행하여 재현성이 뚜렷하게 나타난 85개를 RAPD marker로 최종적으로 선발하였다.
사용한 프라이머중의 하나인 OPX03와 공시품종의 게놈 DNA와의 PCR 분석결과는 도 3에 나타낸 바와 같이 "Dular"에서는2,400bp와 750bp에서, "Toyohatamochi"에서의 경우는 2,400bp에서만 각각 band가 나타났고, 1번에서 94번까지 F2개체군에서는 750bp에서는 band가 나타나는 것과 나타나지 않는 것으로 구분되었다.
실험예 6. 유전자지도 작성
RFLP 및 RAPD marker를 이용한 유전자지도를 작성하기 위하여, "Dular/Toyohatamochi"의 F2집단으로부터 분리된 식물체DNA를 앞 실험에서 선발된 프라이머와 PCR을 수행한 후 藤卷등이 제안한 공식[χ2=(a-3/4n)2/3/4n+ (b-1/4n)2/1/4=(a-3b)2/3n; n: 총계체수, a, b: a, b로 분리된 개체수]에 따라 "Dular"형과 "Toyohatamochi"형을 나타내는 band의 분리비에 대한적합도 검정을 실시하였다. RAPD marker의 grouping과 연관분석은 Bernatzky와 Tanksley 방법에 의해 분석하였으며, 조환가는 Allard의 F2maximum likelihood algorithm 방법에 의해 구하였다. 여러개의 밀접한 연관 marker들에 대한 염색체상의 배열순서를 결정하기 위하여, 각각의 RFLP와 RAPD marker에서 계산된 조환가를 이용하여 삼점검정법 및 multiple test를 수행하였는데, data의 양이 많아서 주로 NEC 컴퓨터상에서 호환성이 있는 MAPL program을 이용하여 분자유전자지도를완성하였다. 본 실험에서 선발된 RFLP marker의 명명은 일본의 REG 기준에 준하였고, RAPD marker의 명명은 아라비아 숫자로 표기하였으며, RFLP marker에서 유래된 프라이머 PL442와 PC609에서 얻어진 RAPD marker는 각각 PKL442와 PKC609로명명하였다. RAPD marker와 18℃에서 처리된 "Dular/Toyohatamochi"의 F2집단으로부터 조사된 초장과의 관계분석은 t검정에 의해 실시하였다.
MAPL program 이용에 의한 LOD 값(LOD=1.3,X 2 <0.05)을 근거로 하여, 85개의 RAPD marker 상호간의 연관관계를 분석한 결과 표 5에서 보는 바와 같이, 16개의 연관된 군과 1개의 독립적인 군으로 구분되었고, 단지 2개의 marker만으로 연관되어있는 군도 7번, 8번, 11번, 12번, 15번, 16번등 6개 군으로 조사되었다.
LOD 값에 기초한 85개 RAPD marker의 그룹화
Group No. RAPD marker name
1 2, 1, 49, 43, 56, 44, 58
2 3, 24, 25, 26, 8, 62, 63, 9
3 5, 30, 31, 37, 34
4 75, 23, 64, 57, 78, 10, 82, 12, 13, 35, 14, 60, 11, 3
5 83, 15, PKC609, PKL442
6 17, 76, 59, 72, 19
7 18, 40
8 20, 29
9 36, 61, 21, 69, 38
10 22, 73, 53
11 27, 28
12 32, 45
13 47, 81, 77, 80
14 50, 51, 52, 74, 71
15 54, 55
16 6, 33
Solitary 4, 7, 16, 41, 42, 48, 65, 66, 67, 68, 69
상기 표 5에서 그룹화된 RAPD marker와 54개의 RFLP marker간의 연관관계를 분석한 결과는 하기 표 6에 나타난 바와 같이, 총 85개의 RAPD marker중 "marker 67"을 제외한 84개의 marker들은 모두 RFLP marker와 연관되어 있는 것으로 나타났고, 각 염색체별 RAPD marker의 수는 4번 염색체에서 19개로 가장 많았으며 8번과 11번은 각각 두 개, 7번은 1개의 RAPDmarker가 있는 것으로 분석되었다.
실험결과 도 4와 표 7에 나타낸 바와같이, 85개의 RAPD marker와 54개의 RFLP marker를 이용하여 marker간의 평균거리가10cM이고 전체 게놈의 크기가 1419.7cM인 유전자 연관지도를 작성하였다.
실험예 7. QTL 분석
벼 염색체상의 QTL 탐색에는 MAPL-MQTL program을 이용하였으며 이때 QTL에 대한 신뢰도를 높이기 위하여 4.0의 LOD 값(logarithm score)을 선택하였다. 한 개의 염색체에서 1개 또는 그 이상의 LOD peak를 조사하여 각각 single 또는multiple QTL을 가지고 있는가를 분석하였다.
실험결과 도 6에서 보는 바와같이, LOD 값이 4.0이상인 영역은 5번 염색체의 15∼42cM 범위에서만 나타났다. 5번 염색체상의 RAPD marker 20, 29와 인접하게 위치하고 있는 3개의 RFLP marker(G292, G396, G337)와 두품종의 초장과의 관계를 t검정한 바 표 8에서 보는 바와같이 RFLP marker G396에서 고도의 유의성이 나타났고, 그외의 marker G292와 G337에서는 유의성이 인정되지 않았다.
또한, "Dular/Toyohatamochi" 조합 F2집단의 18℃에서의 유묘 초장에 대한 빈도분포를 조사한 결과 도 5에서 보는 바와같이, 18℃에 20일 동안 자란 "Dular"의 평균초장은 126±8mm이고, "Toyohatamochi"는 평균 117±2mm로 나타났으며, F2집단의 평균치는 140±17mm로 양친의 평균치보다 높게 나타났다.
유전자가 이입된 단편에 대한 RFLP marker와 쌀 묘목단계에서 내냉성 사이의 관계
RFLPmarker Average value ofplant height in each genotype(mm) t-value Degree offreedom
Dular type Toyohatamochi type
G292 133.6(31)a 161.8(6) 1.937 35
G396 138.0(29) 163.9(8) 3.095** 35
G337 141.6(30) 152.3(7) 1.097 35
주: a; line의 수,*,**; Significant at 5% and 10% levels, respectively.
한편, 표 9에서 보는 바와같이, RAPD marker 29와 RFLP marker G396 사이에 위치한 것으로 확인된 내냉성 관련 QTL(29)의최대 LOD 값은 5.71, 상위성은 2.55, 표현형 상관은 0.81로 나타났다.
"Dular/Toyohatamochi"의 F2population내 낮은 온도하에서 식물성장에 대하여 검출된 QTL 특성
DNAmarker Marker borderingthe QTL Total length(cM) Peak LOD Epistasis Phenotypecorrelation
G396 G292∼G396 13.5 2.62 0.67 0.443
29 G396∼29 10.4 5.71 2.55 0.810
20 29∼20 21.2 4.34 4.28 0.772
또한 RAPD marker 20과 29사이에 위치한 QTL(20)에서도 비교적 높은 표현형 상관(0.772)을 보였다. 이상의 확인된 유묘내냉성 관련 QTL을 염색체지도상에 나타낸 결과는 도 7과 같다.
인디카형 품종인 "K-sen 4"와 자바니카형 품종인 "Silewah" 조합의 F3291 계통의 18℃에서의 초장을 조사하여 변이분포를 조사한 바, 유묘의 초장은 82∼382mm의 넓은 변이분포를 나타내었으며, "K-sen 4"의 평균초장은 225±12mm이고,"Silewah"의 평균값은 355±17mm이며, F3계통의 평균치는 228±42mm로 나타났고, 최빈수(77계통)는 216∼249mm이었다. 도 8에서 보는 바와 같이, F3계통들의 초장에 대한 빈도분포는 연속적인 변이분포를 나타냈다.
이상 실험예를 통하여 설명한 바와같이, 본 발명은 DNA marker에 의해 marker간 평균 거리가 10cM이고 총 1,419.7cM인 유전자 연관지도를 제공할 수 있는 효과가 있다. 또한, 본 발명에 의한 유전자 연관지도는 염색체상에 위치하고 있는 표식인자수가 많기 때문에 질·양적 형질에 관여하는 유전자 탐색의 정확도나 유전해석의 효율성을 크게 향상시킬 수 있고,내냉성 품종육성에 RAPD marker를 이용하면 신품종 육성에 소요되는 시간과 노력을 줄일수 있어 육종의 효율을 극대화 시킬 수 있는 효과가 있어 육종산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (2)

  1. 인디카형인 Dular와 자포니카형인 Toyohatamochi에서 85개의 RAPD 마커와 54개의 RFLP 마커간의 연관관계를 이용하여 Dular/Toyohatamochi의 F2집단으로부터 분리된 게놈 DNA로부터 제작된 마커간의 평균거리가 10cM이고 전체 게놈의 크기가 1419.7cM인 도 4에 도시된 유전자 연관 지도.
  2. 목적으로 하는 양적 형질과 이들 DNA 마커들과의 연관성 분석으로 멘델식 유전자좌가 복합적으로 관여하는 양적형질에 대한 유전적 특성을 파악할 수 있는 양적유전자좌(QTL) 분석방법에 있어서, 벼의 유묘 내냉성에 관여하는 QTL이 5번 염색체에 위치하는 도 7에 도시된 유전자 연관 지도를 이용하는 것을 특징으로 하는 벼의 유묘 내냉성 관련 QTL 분석방법.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101395645B1 (ko) * 2012-09-05 2014-05-19 동국대학교 산학협력단 고온 스트레스 저항성 배추의 선별을 위한 ｒａｐｄ 프라이머 및 이를 이용한 고온 스트레스 저항성 배추의 선별방법
CN105441457A (zh) * 2015-12-16 2016-03-30 中国农业科学院深圳生物育种创新研究院 一种与低氮条件下水稻千粒重相关的基因qTGW2-1及其分子标记方法
KR20160086177A (ko) 2015-01-09 2016-07-19 충북대학교 산학협력단 담배 품종 판별용 rapd 프라이머

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101696679B1 (ko) * 2014-10-31 2017-01-17 대한민국 벼의 간장 관련 양적형질 유전자좌 결정 및 이를 위한 ｃａｐｓ 마커
CN109880930A (zh) * 2019-04-10 2019-06-14 广西大学 一种水稻耐冷主效QTL qCTS12的分子标记及其鉴定方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Genetics 1994 Dec, 138(4)</p> *
Nucleic Acids Res 1997 Dec 15, 25(24) *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101395645B1 (ko) * 2012-09-05 2014-05-19 동국대학교 산학협력단 고온 스트레스 저항성 배추의 선별을 위한 ｒａｐｄ 프라이머 및 이를 이용한 고온 스트레스 저항성 배추의 선별방법
KR20160086177A (ko) 2015-01-09 2016-07-19 충북대학교 산학협력단 담배 품종 판별용 rapd 프라이머
CN105441457A (zh) * 2015-12-16 2016-03-30 中国农业科学院深圳生物育种创新研究院 一种与低氮条件下水稻千粒重相关的基因qTGW2-1及其分子标记方法
CN105441457B (zh) * 2015-12-16 2019-04-16 中国农业科学院深圳生物育种创新研究院 一种与低氮条件下水稻千粒重相关的qtl分子标记方法

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