KR20160086177A

KR20160086177A - 담배 품종 판별용 rapd 프라이머

Info

Publication number: KR20160086177A
Application number: KR1020150003588A
Authority: KR
Inventors: 이이; 조남수; 유제민; 김예진; 엄유리
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2015-01-09
Filing date: 2015-01-09
Publication date: 2016-07-19
Also published as: KR102283638B1

Abstract

본 발명은 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA) 분석에 의한 담배의 품종 판별 방법 및 그 방법에 사용되는 프라이머에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 서열번호 1 내지 서열번호 14로 이루어진 군에서 선택되는 특정 염기서열을 갖는 RAPD 프라이머 및 이를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 담배의 DNA 다형성 검출 방법 및 담배의 품종 판별 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 담배 품종 판별용 RAPD 마커는 담배의 DNA 다형성을 효과적으로 검출하여 담배의 DNA 프로파일을 작성하는데 매우 유용하게 이용될 수 있으며, 이를 통해 담배의 유전자원을 효율적으로 평가함으로써 신규 유전자원 도입 시 기존 보유자원과의 중복성 분석 및 신규성 확립을 효과적으로 수행할 수 있으며, 담배의 품종을 판별할 수 있는 효과가 있다. 또한, 국내에 산재해 있는 토종 품종(계통)간의 구분을 명확히 할 수 있을 뿐만 아니라 이름 없는 품종들의 신품종 등록이 가능하여 우리의 소중한 유전자원을 보호할 수 있으며, 국내산과 수입산의 식별이 가능해져 국내 담배 시장의 유통질서를 확립하는데 기여할 수 있다.

Description

담배 품종 판별용 RAPD 프라이머{Random Amplified Polymorphic DNA primer for discrimination of tobacco cultivars}

본 발명은 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA) 분석에 의한 담배의 품종 판별 방법 및 그 방법에 사용되는 프라이머에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 서열번호 1 내지 서열번호 14로 이루어진 군으로부터 선택되는 특정 염기서열을 갖는 RAPD 프라이머 및 이를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 담배의 DNA 다형성 검출 방법 및 담배의 품종 판별 방법에 관한 것이다.

3,000 여종에 달하는 가지과 (Solanaceae)작물 중 담배(Nicotiana tabacum L.)는 세계 5대 기호품으로 이용되어지며 경제적 가치가 매우 클 뿐 아니라, 유전학에서도 중요한 모델식물이기도 하다. 담배가 가지는 게놈(genome)의 크기는 인간 genome의 1.5배인 4.5×10⁹ bp(base pair)이다. 미국의 노스캐롤라이나주립대학교(North Carolina State University)에서 주도적으로 Tobacco Genome Initiative (TGI)를 설립하여 담배 게놈(genome)의 초안을 완성하였지만, 아직 다른 주요작물에 비해 유전학적인 측면에서 많은 연구결과가 밝혀지지 않은 상태이다.

최근 들어 분자생물학 분야의 급진적인 발전과 더불어 식물의 속, 종간 또는 종내 품종간 분류에 분자생물학적인 방법들이 다양하게 사용되고 있다. 이를 위하여 핵산(DNA) 수준에서 유전자원의 다양성(genetic diversity) 연구를 가능케 하는 핵산 지문 분석 방법 및 다양한 DNA 마커들이 개발되고 있다. 분자생물학 수준에서의 DNA 분석에 의한 변종의 감별은 그 변종의 양적수준과 더불어 다수의 특성을 파악하여 알 수 있으며 환경의 영향을 배제할 수 있는 장점이 있다. 그 중에서 RFLP(제한효소 단편 장다형, Restriction Fragment Length Polymorphism)는 일련의 DNA 사슬을 제한효소로 처리했을 때 생기는 DNA 단편들이 개체간의 유전적 조성의 차이 즉, 염기 서열상의 차이에 따라서 그 수나 길이가 서로 다르게 나타난다는 사실에 기초한 것으로써 다양하게 이용되고 있다. 하지만 RFLP는 순도가 높은 DNA가 다량으로 필요하며 시간과 노력과 비용이 많이 소요될 뿐 아니라 시험과정이 복잡하고 방사성 동위원소를 이용해야 하는 단점이 있다.

이러한 문제점을 극복하기 위한 방법으로 기술적으로 단순하고 다형상성(Polymorphism)의 추적이 용이한 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA) 방법이 개발되었다. RAPD 방법은 신속하게 결과를 도출하며 적용하기 쉽고 사전에 염기 서열 정보를 가질 필요가 없다. 이를 이용한 기술로서, 대한민국 등록특허 제10-0264743호에 “marker RAPD를 이용한 벼의 유묘 내냉성에 관여하는 양적 형질 유전자 지도(QTL)와 저온저항성 벼품종 선발 방법”이 개시되어 있고, 대한민국 등록특허 제10-0215084호에 “RAPD 표식에 의한 고려인삼의 산지 판별방법 및 그 방법에 사용되는 프라이머”가 개시되어 있으며, 대한민국 등록특허 제10-0764561호에 “RAPD 표지인자를 이용한 양파의 웅성불임회복 유전자판별 방법”이 개시되어 있다.

하지만 담배 품종에 대한 RAPD 마커는 아직 국내에서 전혀 개발된 바 없으며, 특히 국내 재래종 담배 품종 유전자원이 포함된 연구는 외국에서도 전혀 다루어지지 않은 실정이다.

이에 본 발명자들은 분자생물학적인 접근 중 분자마커를 활용하여 RAPD분석을 통해 담배의 품종간의 차이를 비교 분석하고자 수행하고자, 총 80개의 RAPD 프라이머 세트를 제작하였으며, 이 중 특정 프라이머를 이용한 PCR 증폭 결과 국내에서 재배되는 서로 다른 5개의 담배 품종(청주엽, 향초, NC82, KF118, TA03)에서 특이적인 밴드가 형성되는 것을 통해, 국내 재배하는 다양한 담배 품종을 판별할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국등록특허 제10-0264743호 한국등록특허 제10-0215084호 한국등록특허 제10-0764561호

따라서 본 발명의 목적은 국내에서 재배되는 담배의 품종을 효과적으로 판별할 수 있는 RAPD 프라이머를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 RAPD 프라이머를 포함하는 담배 품종 판별용 조성물을 제공하는 것이다.

또한 상기 조성물을 포함하는 담배 품종 판별용 키트를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 RAPD 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함으로써 담배 품종을 효과적으로 판별하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 14로 구성된 군으로부터 선택된 염기서열을 갖는 담배 품종 판별용 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA) 프라이머를 제공한다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 담배 품종은 청주엽, 향초, NC82, KF118 및 TA03으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 14는 담배 품종 중 청주엽을 판별할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 서열번호 6 또는 서열번호 13은 담배 품종 중 향초를 판별할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 서열번호 1, 서열번호 8, 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택된 1종은 담배 품종 중 NC82를 판별할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 9 및 서열번호 12로 이루어진 군으로부터 선택된 1종은 담배 품종 중 NF118을 판별할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 7로 이루어진 군으로부터 선택된 1종은 담배 품종 중 TA03을 판별할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머를 포함하는 담배 품종 판별용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 담배 품종 판별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 개체로부터 얻어진 핵산 시료를 상기 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 단계를 포함하는, 담배 품종 판별 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 담배 품종 판별용 RAPD 마커는 담배의 DNA 다형성을 효과적으로 검출하여 담배의 DNA 프로파일을 작성하는데 매우 유용하게 이용될 수 있으며, 이를 통해 담배의 유전자원을 효율적으로 평가함으로써 신규 유전자원 도입 시 기존 보유자원과의 중복성 분석 및 신규성 확립을 효과적으로 수행할 수 있으며, 담배의 품종을 판별할 수 있는 효과가 있다. 또한, 국내에 산재해 있는 토종 품종(계통)간의 구분을 명확히 할 수 있을 뿐만 아니라 이름 없는 품종들의 신품종 등록이 가능하여 우리의 소중한 유전자원을 보호할 수 있으며, 국내산과 수입산의 식별이 가능해져 국내 담배 시장의 유통질서를 확립하는데 기여할 수 있다.

도 1은 본 발명에서 사용한 담배 품종별 육종 과정을 나타낸 사진이다.
도 2는 본 발명의 프라이머(서열번호 1 내지 14)를 이용하여 5개의 담배 품종에서 분리된 DNA를 주형으로 PCR 증폭 후 반응산물의 전기영동 사진을 나타낸 것이다(A: 프라이머 OPA17, B: 프라이머 OPA19, C: 프라이머 OPA20, D: 프라이머 OPB03, E: 프라이머 OPB18, F: 프라이머 OPC07,lane 1: 청주엽, lane 2: 향초, lane 3: NC82, lane 4: NF118, lane 5: TA03).

하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 14로 구성된 군으로부터 선택된 염기서열을 갖는 담배 품종 판별용 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA) 프라이머를 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명에 있어서, 상기 담배 품종은 청주엽, 향초, NC82, KF118 및 TA03으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종일 수 있다.

본 발명에서 용어, ‘프라이머 ’란 상보적인 주형과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 본 발명의 구체적인 실시에서는, 서열번호 1 내지 서열번호 14로 구성된 군으로부터 선택된 1종의 염기서열을 갖는 프라이머를 사용하였다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 14는 담배 품종 중 청주엽을 판별할 수 있으며; 상기 서열번호 6 또는 서열번호 13은 담배 품종 중 향초를 판별할 수 있고; 상기 서열번호 1, 서열번호 8, 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택된 1종은 담배 품종 중 NC82를 판별할 수 있으며; 상기 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 9 및 서열번호 12로 이루어진 군으로부터 선택된 1종은 담배 품종 중 NF118을 판별할 수 있고; 상기 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 7로 이루어진 군으로부터 선택된 1종은 담배 품종 중 TA03을 판별할 수 있다.

또 다른 양태로서, 상기 프라이머(서열번호 1 내지 서열번호 14로 구성된 군으로부터 선택된 염기서열을 갖는 담배 품종 판별용 RAPD 프라이머)를 포함하는 담배 품종 판별용 조성물을 제공한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 담배 품종 판별용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 담배 품종 판별용 키트는 상기 RAPD 프라이머 외에도 시료 내에서 담배 품종을 검출하기 위하여 필요한 반응완충용액, 중합효소, dNTP, 안정화제 및 모든 생물학적 또는 화학적 시약, 사용설명서 등을 포함할 수 있다. 이러한 키트의 다른 구성은 당업자에 의하여 적절히 선택될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 개체로부터 얻어진 핵산 시료를 RAPD 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 단계를 포함하는, 담배 품종 판별 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 개체는 판별하고자 하는 대상 담배 품종 식물이다.

본 발명의 PCR 수행은, 개체로부터 얻어진 핵산 시료를 서열번호 1 내지 서열번호 14로 구성된 군으로부터 선택된 염기서열을 갖는 담배 품종 판별용 RAPD 프라이머를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, PCR 수행은 94℃에서 15분간 초기 denaturation 과정을 거친 후, 94℃에서 1분(denaturation), 35℃에서 1분(annealing), 72℃에서 2분(extension)간의 반응을 45회 실시하고, 최종 extension 과정으로 72℃에서 10분간 반응시키는 과정을 통해 이루어질 수 있다.

상기 PCR 수행을 통해 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 하나의 구체적 예로서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사선을 발하는 물질일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 표지 물질은 에티디움브로마이드(Ethidium Bromide: EtBr), Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭 시 프라이머의 5′-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사선 물질을 이용한 표지는 PCR 수행 시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사선 동위원소를 PCT 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방산선이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사선으로 표지될 수 있다.

상기 증폭된 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방산선 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5′-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사선 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사선 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사선 측정기구, 예를 들면, 가이어 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사선을 측정할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

본 발명의 담배 품종 식별에 적합한 프라이머 선별

<1-1> 담배 품종 샘플 준비

실제 담배 품종 식별에 적합한 RAOD용 프라이머를 확인하기 위하여 서로 다른 5개의 담배 품종으로 청주엽, 향초, NC82, KF118, TA03을 3개월간 온실에서 육종한 뒤 잎을 시료(재료)로 이용하였다.

<1-2> DNA 추출

상기 실시예<2-1>을 통해 준비한 담배 품종별 샘플을 DNeasy Plant Mini Kit(QIAgen)를 이용하여 DNA를 추출한 뒤, Qubit^TM fluorometer(Invitrogen)로 가각의 DNA를 10μg/ml로 정량하였다.

<1-3> RAPD 프라이머를 이용한 PCR 수행

본 실험에서는 먼저 담배 품종 판별용 프라이머 OPA, OPB, OPC, OPD 각각 20개씩, 총 80개의 RAPD 프라이머 세트를 사용하여 PCR 분석을 실시하였다. PCR 조건은 94℃에서 15 분간 pre-denaturation, 94℃에서 1 분간 denaturation, 35℃에서 1 분간 annealing, 72℃에서 2 분간 extension 조건으로 45 cycle 증폭한 후 72℃에서 10 분간 final extension을 수행하였다.

증폭된 PCR 산물을 확인하기 위해 1.5% 아가로스젤 전기영동을 실시하고, UV Transiluminater를 이용하여 밴드를 확인하였다.

그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, 총 80개의 RAPD 프라이머 세트에서 14개의 프라이머만이 담배 품종에 따른 특이적인 밴드가 확인되었다. 자세하게는, 청주엽은 프라이머 OPA13, OPC20에서 특이적 밴드가 확인되었으며, 향초는 프라이머 OPB03, OPC19에서 특이적 밴드가 확인되었고, NC82는 프라이머 OPA13, OPC04, OPC06, OPC07에서 특이적 밴드가 확인되었으며, KF118은 프라이머 OPA19, OPA20, OPC05, OPC16에서 특이적 밴드가 확인되었고, TA03은 프라이머 OPA14, OPA17, OPB18에서 특이적 밴드가 확인되었다. 한편, OPD 프라이머 세트에서는 품종별 특이적인 밴드가 확인되지 않았다.

담배 품종별 샘플의 RAPD 분석을 통한 특이적 분자 마커 리스트

샘플	프라이머
청주엽	OPA13, OPC20
향초	OPB03, OPC19
NC82	OPA13, OPC04, OPC06, OPC07
KF118	OPA19, OPA20, OPC05, OPC16
TA03-A	OPA14, OPA17, OPB18

따라서 상기와 같은 결과를 통해, 총 80개의 RAPD 프라이머 세트에서 실제로 담배 품종의 판별에 적합한 RAPD용 프라이머는 14개임을 실험을 통해 입증하였으며, 본 발명에서는 이들 14개의 RAPD용 프라이머를 하기 표 2에서와 같이 서열번호 1 내지 14로 나타내었다.

본 발명의 담배 품종 판별을 위한 RAPD용 프라이머

프라이머	뉴클레오티드 서열(5'-3')	서열번호
OPA13	CAGCACCCAC	서열번호 1
OPA14	TCTGTGCTGG	서열번호 2
OPA17	GACCGCTTGT	서열번호 3
OPA19	AGGTGACCGT	서열번호 4
OPA20	CAAACGTCGG	서열번호 5
OPB03	CATCCCCCTG	서열번호 6
OPB18	GGTGACGCAG	서열번호 7
OPC04	CCGCATCTAC	서열번호 8
OPC05	GATGACCGCC	서열번호 9
OPC06	GAACGGACTC	서열번호 10
OPC07	GTCCCGACGA	서열번호 11
OPC16	TGGACCGGTG	서열번호 12
OPC19	CTCACCGTCC	서열번호 13
OPC20	TGTCTGGGTG	서열번호 14

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Random Amplified Polymorphic DNA primer for discrimination of tobacco cultivars <130> PN1412-365 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPA13 primer <400> 1 cagcacccac 10 <210> 2 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPA14 primer <400> 2 tctgtgctgg 10 <210> 3 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPA17 primer <400> 3 gaccgcttgt 10 <210> 4 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPA19 primer <400> 4 aggtgaccgt 10 <210> 5 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPA20 primer <400> 5 caaacgtcgg 10 <210> 6 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPB03 primer <400> 6 catccccctg 10 <210> 7 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPB18 primer <400> 7 ggtgacgcag 10 <210> 8 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPC04 primer <400> 8 ccgcatctac 10 <210> 9 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPC05 primer <400> 9 gatgaccgcc 10 <210> 10 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPC06 primer <400> 10 gaacggactc 10 <210> 11 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPC07 primer <400> 11 gtcccgacga 10 <210> 12 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPC16 primer <400> 12 tggaccggtg 10 <210> 13 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPC19 primer <400> 13 ctcaccgtcc 10 <210> 14 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPC20 primer <400> 14 tgtctgggtg 10

Claims

서열번호 1 내지 서열번호 14로 구성된 군으로부터 선택된 염기서열을 갖는 담배 품종 판별용 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA) 프라이머.
제1항에 있어서,
상기 담배 품종은 청주엽, 향초, NC82, KF118 및 TA03으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 프라이머.
제1항에 있어서,
상기 서열번호 1 또는 서열번호 14는 담배 품종 중 청주엽을 판별하는 것을 특징으로 하는 프라이머.
제1항에 있어서,
상기 서열번호 6 또는 서열번호 13은 담배 품종 중 향초를 판별하는 것을 특징으로 하는 프라이머.
제1항에 있어서,
상기 서열번호 1, 서열번호 8, 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택된 1종은 담배 품종 중 NC82를 판별하는 것을 특징으로 하는 프라이머.
제1항에 있어서,
상기 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 9 및 서열번호 12로 이루어진 군으로부터 선택된 1종은 담배 품종 중 NF118을 판별하는 것을 특징으로 하는 프라이머.
제1항에 있어서,
상기 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 7로 이루어진 군으로부터 선택된 1종은 담배 품종 중 TA03을 판별하는 것을 특징으로 하는 프라이머.
제1항에 따른 프라이머를 포함하는 담배 품종 판별용 조성물.
제8항의 조성물을 포함하는 담배 품종 판별용 키트.
개체로부터 얻어진 핵산 시료를 제1항에 따른 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 단계를 포함하는, 담배 품종 판별 방법.