KR101636110B1

KR101636110B1 - 배추과 작물의 종 식별을 위한 범용 프라이머 세트 cos0420 및 이를 포함하는 분자마커

Info

Publication number: KR101636110B1
Application number: KR1020130020089A
Authority: KR
Inventors: 정영민; 문정환; 유희주
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2013-02-25
Filing date: 2013-02-25
Publication date: 2016-07-06
Also published as: KR20140106068A

Abstract

본 발명은 배추과(Brassicaceae family) 작물의 종(species) 식별을 위한 범용 프라이머 세트 및 이를 포함하는 분자마커에 관한 것으로, 자세하게는 애기장대, 무, 순무, 배추, 양배추, 흑겨자, 갓, 에디오피아 겨자, 유채 및 브로콜리 등과 같은 배추과 작물의 종을 식별할 수 있는 범용 프라이머 세트와 이를 포함한 분자마커에 관한 것이다. 본 발명의 범용 프라이머 세트는 배추, 양배추 및 애기장대의 유전체 분석 및 단일 카피 유전자 탐색한 후, 종간 단일 카피 유전자 비교를 통해 도출된 COS를 기반으로 제작한 프라이머로서, 이를 이용하여 분석하고자 하는 배추과 작물의 DNA를 증폭한 후 전기영동을 통해 증폭된 산물의 크기를 분석하는 과정을 통해 배추과 작물의 종(species)을 효과적으로 식별할 수 있다. 또한 본 발명은 상기와 같은 범용 프라이머 세트를 포함하는 애기장대, 배추 및 양배추 각각의 보존된 이종상동성 유전자(orthologous gene) 염기서열을 규명함으로써, 이를 애기장대, 배추 및 양배추 각각의 종을 식별하는 분자마커로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

배추과 작물의 종 식별을 위한 범용 프라이머 세트 COS0420 및 이를 포함하는 분자마커{Universal primer set COS0420 for discrimination of Brassicaceae sp. and molecular marker comprising the same}

본 발명은 배추과(Brassicaceae family) 작물의 종(species) 식별을 위한 범용 프라이머 세트 및 이를 포함하는 분자마커에 관한 것으로, 자세하게는 애기장대, 무, 순무, 배추, 양배추, 흑겨자, 갓, 에디오피아 겨자, 유채 및 브로콜리 등과 같은 배추과 작물의 종을 식별할 수 있는 범용 프라이머 세트와 이를 포함한 분자마커에 관한 것이다.

배추과 작물은 분류학적으로 애기장대와 같은 과에 속하는 작물로서, 유지공급원, 채소와 양념 등 다양한 범위의 용도를 가지고 있는 작물들이 포함되어 있어 작물로서 그 경제적 가치가 높다. 이들 배추과 작물들은 각각 극대화된 기관의 형태에 의해 분류되는데, 대표적으로 꽃봉오리가 발달한 꽃양배추(Brassica oleracea ssp. botrytis)와 브로콜리(B. oleracea spp. italica), 줄기조직이 발달한 콜라비(B. oleracea ssp. gongylodes), 뿌리 기관이 발달된 순무(B. rapa ssp. rapifera), 구불구불한 잎 조직이 발달한 박쵸이(B. rapa ssp. chinensis)와 배추(B. rapa ssp. pekinensis), 단일 정단 봉오리가 발달한 양배추(B. oleracea ssp. capitata) 및 다양한 측아조직이 발달된 방울다다기양배추(B. oleracea ssp. gemmifera) 등을 들 수 있다. 또한 겨자 양념으로 이용되는 흑겨자(B. nigra)도 배추속 작물에 속한다.

배추과 작물은 종간, 아종간, 아종내 다형성이 매우 높은데, 이는 식물 게놈내에 가장 빈번하면서 빠른 염색체 대단위 변화를 초래하는 현상을 다배체화(polyploidy)에서 그 원인을 찾을 수 있다. 현재 존재하는 피자식물 중 80%가 넘는 식물종이 1회 또는 여러 회 염색체의 배가가 이루어진 다배체화 게놈 형태인 것으로 알려져 있다(Masterson 1994; Stebbinson 1996). 다배체화는 광범위한 염색체 재구성(Ahn and Tanksley, 1993; Reinsch et al., 1994; Song et al., 1995a, 1995b; Lagercrantz and Lydiate, 1996; Bubaker et al., 1999) 및 레트로-트란스포존(retro-transposon) 증폭을 가능하게 할 뿐만 아니라(Matzke and Matske, 1998; Zhao et al., 1998), 염색체간 유사한 영역을 공통으로 갖고 있어 세대를 거듭하고 진화함에 따라 상동성 있는 영역간 재조합을 일으키게 하고, 부가적인 유전자 중복을 가져오게 하여 더 복잡한 염색체 재구성의 기본 요인이 된다.

생물의 종 및 품종을 식별함에 있어서 종래에는 형태적, 이화학적 방법이 사용되어 왔으나, 상기 배추과 작물은 염색체 구성이 복잡하여 분속지표가 확립되기 어렵기 때문에 거의 주관적으로 품종 및 종 판별이 이루어지고 있는 실정에 있다.

최근에 핵산지문법(DNA fingerprint)에 의한 품종 및 종의 유전적 감식법이 광범위하게 이용되고 있는데, 핵산지문법에는 제한효소단편장다형(restriction fragment length polymorphism: RFLP)법과 PCR법이 있다. RFLP법은 제한효소 (restriction enzyme)에 의해 DNA를 절단한 다음 절단 단편들을 나이론막에 전사한 후, 방사성 동위원소 등으로 표지한 프로브(probe)를 이용해 DNA 다형성을 검출하는 방법이고, PCR(polymerase chain reaction)법은 프라이머라고 불리는 10∼20bp로 구성된 특정 DNA 단편을 생물체로부터 분리한 게놈 유전자(genomic DNA)에 접촉(annealing)시킨 후, 내열성 DNA 중합효소 (Taq polymerase)를 첨가하여 합성반응을 반복적으로 행하여 프라이머가 결합된 영역을 증폭시킨 후, 그 PCR 증폭산물을 아가로스겔(agarose gel) 또는 아크릴아마이드겔(acrylamide gel)에서 전기영동하고, 에티듐브로마이드(ethidium bromide) 및 은염색(silver stain)으로 DNA를 염색하여 DNA 다형성을 검출하는 방법이다. 또한, 최근에 사용되는 다른 유전자 감식법으로 AFLP법 및 RAPD법이 있다. AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)법은 인식부위가 많지 않은 제한효소로 절단된 DNA의 단편들에 어댑터(임의로 합성한 DNA 조각)를 붙인 다음, 표식 부위의 DNA 염기서열을 바탕으로 작성한 프라이머를 PCR의 프라이머로 사용하여 특정 제한효소 단편을 증폭시켜 그 산물에서 얻어지는 밴드 차이의 유무를 비교하는 것이다. RAPD(Random Amplified Polymorphic DNAs)법은 PCR을 이용하는 방법으로서 종간 및 종 내의 유전적 근원관계를 연구하는데 많이 활용되는데, 대개 9~11bp의 짧은 임의의 프라이머(random primer)를 이용하여 2개의 염기서열(상보적인 염기서열)에 의해 맞추어지는 유전체 부위만을 증폭시켜 아가로스겔에 전기영동하여 단편들의 형태를 분석하는 방법이다.

그러나 상기 두 가지 방법으로 나타나는 표지인자는 대부분이 유전자가 극히 드문 헤테로크로마틴(heterochromatin) 지역으로부터 생성되어 표지인자가 유전체 전반에 골고루 분포하지 못하고, 일부 지역으로만 편중되는 단점이 지적되어 새로운 표지인자의 개발이 필요하다는 문제가 있다.

한편, 유전학에서 분자표지는 특정 유전자 혹은 좌위와 연관된 DNA 서열을 일컫는다. 생물의 표현형은 유전자와 밀접한 관련이 있기 때문에, 특정 유용 형질을 결정하는 유전자가 정확하게 밝혀지기 전이나 혹은 찾은 과정에서 형질과 밀접하게 연관된 분자표지가 매우 유용하게 사용된다. 따라서 분자표지의 개발 및 분자표지로 이루어진 유전연관지도의 작성은 유전학 및 육종 연구에서 매우 중요한 부분이며, 상당한 시간과 비용을 요하는 과정이기 때문에, 분자표지의 효율적인 개발을 위한 연구가 활발하게 진행되고 있다.

최근 분자생물학, 생물정보학의 발전과 함께 유전체 정보가 축적됨에 따라 분자 표지의 개발이 과거에 비해 용이하게 되었으며, 이를 통해 기존 분자표지에 비해 정확도 및 다형성이 높으며, 다양한 종에 적용 가능한 분자표지가 개발 가능하게 되었다. 특히, 최근에 그 개념이 제시된 conserved ortholog set(이하 하기에서는 간략하게 ‘COS'라 표기함)은 이러한 분자표지를 개발할 수 있는 기반이 되고 있다. COS는 대상으로 하는 종들에서 그 유전적 서열 및 기능이 보존된 상동유전자들 중, 단일 카피(copy) 혹은 low copy인 것들을 목록화한 것이다.

이러한 COS는 유전자의 서열이 보존되어 있기 때문에 여러 종에 사용가능한 분자표지의 개발이 가능할 뿐만 아니라, 단일 카피인 것들이 대다수이기 때문에 자료 분석이 용이한 분자표지를 만들 수 있다. 현재 COS와 관련하여 토마토, 가지와 같은 가지과 식물에서 활발히 연구가 진행되고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 채소작물에서 매우 중요한 위치를 차지하고 있는 배추과 작물에서 종 및 품종 구분이 가능한 분자표지를 COS를 이용하여 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국공개특허 제10-2012-0001457호

따라서 본 발명의 목적은 배추과 작물의 종을 효과적으로 식별할 수 있는 COS 기반의 범용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 배추과 작물의 종을 효과적으로 식별할 수 있는 COS 기반의 애기장대 식별용 분자마커를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 배추과 작물의 종을 효과적으로 식별할 수 있는 COS 기반의 배추 식별용 분자마커를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 배추과 작물의 종을 효과적으로 식별할 수 있는 COS 기반의 양배추 식별용 분자마커를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 배추과 작물의 종을 효과적으로 식별할 수 있는 COS 기반의 범용 프라이머 세트를 이용하여 배추과 작물의 종을 식별하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 배추과(Brassicaceae family) 작물의 종(species) 식별을 위한 범용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배추과 작물은 애기장대, 무, 순무, 배추, 양배추, 흑겨자, 갓, 에디오피아 겨자, 유채 및 브로콜리로 이루어진 군으로부터 선택된 1종일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 배추과(Brassicaceae family) 작물 중 애기장대를 식별할 수 있는 서열번호 3으로 이루어진 애기장대 식별용 분자마커를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 배추과(Brassicaceae family) 작물 중 배추를 식별할 수 있는 서열번호 4로 이루어진 배추 식별용 분자마커를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 배추과(Brassicaceae family) 작물 중 양배추를 식별할 수 있는 서열번호 5로 이루어진 양배추 식별용 분자마커를 제공한다.

또한, 본 발명은 배추과 작물 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 게놈 DNA를 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 산물을 전기영동하여 증폭된 산물의 크기(size)를 분석하는 단계를 포함하는 배추과 작물의 종(species) 식별 방법을 제공한다.

본 발명의 범용 프라이머 세트는 배추, 양배추 및 애기장대의 유전체 분석 및 단일 카피 유전자를 탐색한 후, 종간 단일 카피 유전자 비교를 통해 도출된 COS를 기반으로 제작한 프라이머로서, 이를 이용하여 분석하고자 하는 배추과 작물의 DNA를 증폭한 후 전기영동을 통해 증폭된 산물의 크기를 분석하는 과정을 통해 배추과 작물의 종(species)을 효과적으로 식별할 수 있다. 또한 본 발명은 상기와 같은 범용 프라이머 세트를 포함하는 애기장대, 배추 및 양배추 각각의 보존된 이종상동성 유전자(orthologous gene) 염기서열을 규명함으로써, 이를 애기장대, 배추 및 양배추 각각의 종을 식별하는 분자마커로 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 우장춘의 삼각형(Triangle of U)을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 배추과 작물의 종 식별을 위한 범용 프라이머 세트를 이용하여 6개의 배추과 작물 시료에서 분리된 게놈 DNA를 주형으로 PCR 증폭 후 반응 산물의 전기영동 사진을 나타낸 것이다(At: Arabidopsis thaliana, Rs: Raphanus sativus, A: Brassica rapa, B: Brassica nigra, C: Brassica oleracea, AB: Brassica juncea, AC: Brassica napus, BC: Brassica carinata. A+B: A와 B 게놈 혼합 주형, A+C: A와 C 게놈 혼합 주형, B+C: B 와 C 게놈 혼합 주형).
도 3은 Multalin (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)을 통한 COS0420 유전자들(애기장대: AT5G14140.1, 배추: Bra006240, 양배추: Bol034272)의 아미노산 서열 alignment 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 Arabidopsis eFP browser를 통해 애기장대 AT5G14140.1 유전자의 발현 양상을 분석한 결과이다.
도 5는 본 발명의 배추과 작물의 종 식별을 위한 범용 프라이머 세트를 이용하여 11개의 배추속 작물 시료에서 분리된 게놈 DNA를 주형으로 PCR 증폭 후 반응 산물의 전기영동 사진을 나타낸 것이다( 1. B. balearica 2. B. macrocarpa 3. B. barreilieri 4. B. repanda 5. B. bivoniana 6. B. rupestris 7. B. depranensis 8. B. spinescens 9. B. desnottesii 10. B. villosa 11. B. frutoiculosa).

하나의 양태로서, 본 발명은 배추과(Brassicaceae family) 작물의 종(species)을 식별하기 위한 범용 프라이머 세트를 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명자들은 배추과 작물의 종을 식별하기 위한 범용 분자표지를 개발하기 위해, 먼저 배추과에 속하는 애기장대, 배추 및 양배추의 유전체 분석 및 COS (conserved ortholog set) 유전자를 탐색하였으며, COS 중 공통된 부분을 찾아 본 발명의 배추과 작물의 종 식별을 위한 범용 프라이머 세트를 디자인하였다.

자세하게는, 본 발명자들은 배추과에 속하는 식물 중 애기장대, 배추 및 양배추의 유전체 분석을 통해 총 1,202개의 COS 후보 유전자를 1차 선별하였으며, 다시 서열 길이가 1kb 이하이며, 배추, 양배추, 애기장대에서 각각 그 증폭 길이가 10% 이상 차이나는 것을 탐색하여 152개의 유전자를 2차 선별하였고, 모든 시험된 식물에서 다형성이 존재하여 각 종을 효과적으로 구분할 수 있는 COS 유전자를 최종적으로 선별하였다.

본 발명에서 용어, COS(conserved ortholog set)는 공통 조상으로부터 분화하여 유래된 종들(species)에서 그 유전적 서열 및 기능이 보존된 상동유전자들 중, 단일 카피(copy) 혹은 low copy를 갖는 유전자들을 목록화한 개념으로, 최근에 그 개념이 제시되어 분자표지를 개발할 수 있는 기반이 되고 있다.

본 발명에서는 최종 선별된 COS 유전자를 ‘COS0420’로 명명하였으며, COS0420가 애기장대, 배추 및 양배추에서 각각 AT5G14140.1, Bra006240 및 Bol034272임을 최초로 규명하였다. 즉, 애기장대의 AT5G14140.1 유전자, 배추의 Bra006240 유전자 및 양배추의 Bol034272 유전자가 『보존된 이종상동성 유전자』로서, 이들 종들의 식별에 유용한 분자마커로 사용될 수 있다. 또한, 상기 COS0420 유전자(애기장대: AT5G14140.1, 배추: Bra006240, 양배추: Bol034272) 중 공통되는 서열을 기초로 배추과(Brassicaceae family) 작물의 종(species)을 식별하기 위한 범용 프라이머 세트를 디자인하였다.

본 발명에 있어서, 배추과 작물은 애기장대, 무, 순무, 배추, 양배추, 흑겨자, 갓, 에디오피아 겨자, 유채 및 브로콜리 등을 포함한다.

본 발명에서 용어, "프라이머 세트"란 상보적인 주형과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 본 발명에서 제공하는 프라이머 세트는 배추과(Brassicaceae family) 작물의 다양한 종들에서 그 공통 조상으로부터 종분화하여 유래되는 유전자로서, 그 유전적 서열 및 기능이 보존된 이종상동성 유전자(conserved orthologous gene)를 증폭할 수 있도록 고안된 정방향과 역방향의 프라이머이다. 본 발명의 구체적인 실시에서는, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드를 가지는 프라이머 세트를 사용하였다. 상기 서열번호 1의 프라이머는 편의상 COS0420-F로 표시하며, 상기 서열번호 2의 프라이머는 편의상 COS0420-R로 표시한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트(서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드)를 포함하는 배추과 작물 중 애기장대를 식별할 수 있는 분자마커를 제공한다.

상기 애기장대 식별용 분자마커는 서열번호 3으로 이루어진 염기서열 또는 상기 염기서열의 변이체를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 서열번호 3의 염기서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 “서열 상동의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트(서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드)를 포함하는 배추과 작물 중 배추를 식별할 수 있는 분자마커를 제공한다.

상기 배추 식별용 분자마커는 서열번호 4로 이루어진 염기서열 또는 상기 염기서열의 변이체를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 서열번호 4의 염기서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트(서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드)를 포함하는 배추과 작물 중 양배추를 식별할 수 있는 분자마커를 제공한다.

상기 양배추 식별용 분자마커는 서열번호 5로 이루어진 염기서열 또는 상기 염기서열의 변이체를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 서열번호 5의 염기서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 배추과 작물 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 게놈 DNA를 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭된 산물을 검출하는 단계를 포함하는 배추과 작물의 종(species) 식별 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 (a) 단계에서, 시료는 십자화과(배추과) 작물의 어느 부분이라도 가능한데, 예를 들면, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃 등이 있다.

본 발명의 상기 (b) 단계에서, 게놈 DNA 증폭은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplificatoin), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 통상적인 조건을 취할 수 있으며, 본 발명의 일구체예에서는, 초기 변성(pre-denaturation)을 95℃에서 5분간 수행한 후, 변성(denaturation, 95℃에서 30초), 결합(annealing, 55℃에서 30초), 연장(extension, 72℃에서 30초)을 총 30회 실시하고, 마지막으로 연장(extension, 72℃에서 5분)을 실시하는 조건을 취할 수 있다. 또한, 이러한 PCR 방법은 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 상기 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 하나의 구체적 예로서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사선을 발하는 물질일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 표지 물질은 에티디움브로마이드(Ethidium Bromide: EtBr), Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭 시 프라이머의 5′-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사선 물질을 이용한 표지는 PCR 수행 시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사선 동위원소를 PCT 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방산선이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사선으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드로 이루어진다.

본 발명의 상기 (c) 단계에서, 증폭된 산물을 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방산선 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5′-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사선 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사선 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사선 측정기구, 예를 들면, 가이어 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사선을 측정할 수 있다.

본 발명의 일구체예에서, 상기 (c) 단계의 증폭된 산물 검출은 겔 전기영동을 통해 증폭된 산물의 크기(size) 분석을 통해 이루어질 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

애기장대, 배추, 양배추에서 COS 유전자의 탐색

<1-1> 애기장대, 배추, 양배추의 유전체 분석 및 single copy 유전자 탐색

COS 유전자를 탐색하기 위해, 유전체 데이터베이스에서 애기장대 (Arabidopsis thaliana), 배추 (Brassica rapa), 양배추 (Brassica oleracea)의 유전체 정보를 획득하였다. 이 후, 단일 카피(single copy) 유전자를 찾기 위하여 각 종의 유전자를 전체 유전체를 대상으로 self BLASTp 분석을 실시하여 E-value가 1e-4 이상인 것을 단일 카피(single copy) 유전자라 간주하고 이를 목록화 하였다.

그 결과 총 1,202개의 COS 후보 유전자를 1차 선별하였다.

<1-2> 종간 single copy 유전자 비교를 통한 COS 유전자 탐색

각 종에서 선별된 single copy 유전자들을 상호 비교하여, 3개의 종(애기장대, 배추, 양배추)에서 공통적으로 보존되어 있는 유전자를 탐색하였다. 이때, BLASTp 분석을 통해 E-value가 1e-10이하이고 공통되는 부분이 50% 이상인 COS 유전자를 선별하였다.

그 결과, 총 1,202개의 COS 후보 유전자 중, 서열 길이가 1kb 이하이며, 배추, 양배추, 애기장대에서 각각 그 증폭 길이가 10% 이상 차이나는 152개의 유전자를 2차 선별하였다.

<1-3> 최종 COS 유전자 선별

상기 실시예 <1-2>에서 선별된 152개의 COS 후보 유전자들을 애기장대, 무, 배추, 흑겨자, 양배추, 갓, 에디오피아 겨자, 유채에서 적용하여 다형성을 아가로오스 겔에서 분석하였다. PCR상의 오류를 확인하기 위해, 잡종의 게놈 DNA와 배추, 흑겨자, 양배추 게놈 DNA를 혼합하여 PCR 증폭을 수행하고 이 결과를 상호 비교하였다. 그 결과, 모든 시험된 식물에서 다형성이 존재하여 각 종을 효과적으로 구분할 수 있는 COS 유전자를 최종적으로 선별하였다.

본 발명에서는 최종 선별된 COS 유전자를 ‘COS0420'로 명명하였으며, COS0420가 애기장대, 배추 및 양배추에서 각각 AT5G14140.1, Bra006240 및 Bol034272 임을 최초로 규명하였다.

< 실시예 2>

배추과 종 식별용 프라이머 세트 제작

상기 실시예 1을 통해 선별된 COS0420 유전자(애기장대: AT5G14140.1, 배추: Bra006240, 양배추: Bol034272) 중 공통되는 서열을 기초로 배추과(Brassicaceae family) 작물의 종(species)을 식별하기 위한 범용 프라이머 세트를 제작하였다(하기 표 1 참조).

자세하게는, COS중 공통되는 부분을 찾기 위해 ClustalW2를 통하여 multiple alignment를 실시하였다. 이후, 정렬된 유전자 부위에서 Primer3를 이용하여 프라이머를 제작하였다. 제작된 프라이머들 중, 증폭 길이가 200~1000bp이며 길이 24 ± 1 bp, Tm 60℃, GC content 40%~60%인 것을 선택하였다.

< 실시예 3>

본 발명의 프라이머 세트를 이용한 배추과 식물의 게놈 DNA 분리 및 다형성 분석

배추속의 대표적인 6개의 작물인 배추, 흑겨자, 양배추, 갓, 에디오피아 겨자, 유채를 주 대상으로 하여 다형성을 조사하였다. 이들 6개의 배추속 작물들은 우장춘의 삼각형 (Triangle of U)라 알려진 도식에 의해서 유전적 연관관계가 잘 알려져 있다. 즉, 이배체인 배추(A 게놈), 흑겨자 (B 게놈), 양배추 (C 게놈)의 잡종에 의해서 갓 (AB 게놈), 에디오피아 겨자 (BC 게놈), 유채 (AC 게놈)가 만들어 진다는 것이다(도 1 참조).

자세하게는, 애기장대, 배추, 양배추, 흑겨자 (B. nigra), 갓 (B. juncea), 유채 (B. napus), 에디오피아 겨자 (B. carinata), 그리고 무 (Raphanus sativus)의 잎 조직을 채취한 후, Qiagen DNeasy Plant Mini Kit을 이용하여 게놈 DNA를 순수 분리하였다. 이후 순수 분리된 DNA를 주형으로 하여, 본 발명의 배추과 종 식별용 프라이머 세트(상기 표 1 참조)를 이용, PCR을 수행하였다. PCR 반응은 95℃ 5분간 pre-denaturation 하고, 이 후 95℃ 30 초, 55 ℃ 30초, 72 ℃ 30초의 조건으로 30회 반복한 후, 마지막으로 72 ℃ 5분간 신장시켰다. 반응 산물은 3% Sodium Borate buffer에서 전기 영동하여 다형성을 확인하였다.

그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, 각각의 증폭된 산물의 크기(size)에 따라 모든 시험된 식물에서 다형성이 존재하여 각 종을 구분 할 수 있었으며 특히 잡종인 갓, 에디오피아 겨자, 양배추에서 명확한 2개의 밴드가 증폭되어 이들 COS 기반 분자표지가 잡종을 관찰하는 데 매우 유용함을 알 수 있었다(At: 애기장대, Rs: 무, A: 유채, B: 흑겨자, C: 배추, AB: 갓, AC: 양배추, BC: 에디오피아 겨자).

< 실시예 4>

애기장대, 배추, 양배추의 COS0420 유전자의 아미노산 서열분석

본 실험에서는 애기장대, 배추, 양배추 COS0420 유전자(애기장대-AT5G14140.1, 배추-Bra006240, 양배추-Bol034272) 각각의 아미노산 서열을 비교 분석하였다.

Multalin을 통하여 아미노산 서열을 비교한 결과, 애기장대, 배추, 양배추 모두에서 전반적으로 매우 유사함을 확인할 수 있었다. 붉은색으로 표시된 부분은 모든 종에서 그 서열이 보존된 부위를 나타낸다(도 3 참조).

또한, 애기장대 AT5G14140.1 유전자의 Arabidopsis eFT browser를 통한 발현 양상을 분석하였다. 그 결과, 애기장대 AT5G14140.1 유전자는 발달중인 열매와 성숙한 종자에서 강한 발현을 보이는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 종자 발달과 성숙에 관련된 기능을 수행할 것으로 예상되었다(도 4 참조).

< 실시예 5>

본 발명의 프라이머 세트를 이용한 다양한 배추속 식물에서의 다형성 분석

본 실험에서는 또한 배추속 식물에서 COS 기반 분자 표지의 유용성을 알아보기 위해, 11개의 서로 다른 식물( 1. B. balearica 2. B. macrocarpa 3. B. barreilieri 4. B. repanda 5. B. bivoniana 6. B. rupestris 7. B. depranensis 8. B. spinescens 9. B. desnottesii 10. B. villosa 11. B. frutoiculosa ) 에서 게놈 DNA를 추출하여 분자표지를 적용해 보았다.

자세하게는, 상기 11개의 서로 다른 식물에서 각각의 조직을 채취한 후, Qiagen DNeasy Plant Mini Kit을 이용하여 게놈 DNA를 순수 분리하였다. 이후 순수 분리된 DNA를 주형으로 하여, 본 발명의 배추과 종 식별용 프라이머 세트(상기 표 1 참조)를 이용, PCR을 수행하였다. PCR 반응은 95℃ 5분간 pre-denaturation 하고, 이 후 95℃ 30 초, 55 ℃ 30초, 72 ℃ 30초의 조건으로 30회 반복한 후, 마지막으로 72 ℃ 5분간 신장시켰다. 반응 산물은 3% Sodium Borate buffer에서 전기 영동하여 다형성을 확인하였다.

그 결과 도 5에서 나타낸 바와 같이, 거의 모든 식물에서 단일 밴드가 증폭된 것이 확인되었다. 또한 증폭산물의 크기에 다형성이 존재함이 확인되어, 본 발명의 COS 기반 분자표지가 배추속 식물의 종 구분에 유용함을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Universal primer set cos0420 for discrimination of brassicaceae sp. and molecular marker comprising the same <130> PN1212-564 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COS0420 forward primer <400> 1 gcgcgaacta ctcgctaaac 20 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COS0420 reverse primer <400> 2 gatctcatct tctgtgaagt ccaa 24 <210> 3 <211> 551 <212> DNA <213> molecular marker for discrimination of Arabidopsis thaliana <400> 3 gcgcgagcta cttgctaaac aggtactcct tatggaatct gaatcgatcg aatctgacgt 60 aatgcttttc ttagggaata aacaatctac atgatcaatt ttcagtaaaa tcggtttctt 120 gtctagacac tctcgttaat ggtccacttg aatacttgat gatgatattc gtgttagcat 180 agctcaaatc gaagcggttc tgagattttg aggtcgaatt atttctttgt ggtagtatcc 240 agaaacgatt tttggggaat tcattttctt agtgatgata actgttcggt tgctttcgat 300 ctgtttggtt attctgtaac agcgaatttt tcattttgaa gaagtcttgt aattaggtct 360 gctttgtcaa tttggattaa acgattgttt cattctcctt ctccatgtag ttatatgatg 420 cttagtaatc gttttataag tattatgctg tagattgttt atcatctaca aatatttatg 480 ctcgcaagag ttgagtcata aaggaggatt ttaatttaca ggtgacattg gacttcacag 540 aagatgaaat c 551 <210> 4 <211> 467 <212> DNA <213> molecular marker for discrimination of Brassica rapa <400> 4 gcgcgaacta ctcgctaaac aggtacgtat ggcttctgaa tcggatgctt gttctaggtt 60 ataataatac tctaccatga tccgatgttc aatctaattt agcttatcgt ttactcattg 120 atgatgatgt tgttcgtatt agcttggctg aaatcgaacg gttctgagat tttctaaggt 180 cgagattgtt tttcatagac tccgggatcg attttggaga attcatctcc gtagtgtaga 240 cagttcttcg gttgttatct tcacttggat agttggttgg aagaaacttt caatttttgg 300 tcttctaaag tttggattta tctcattgtt attttgatga aaagtatctg atgtatgacc 360 aaccgtttag catatttgtc atctacaaaa tcatatgctt gcaagagttg agttctaagg 420 aggatttgaa tatgcaggtg gctttggact tcacagaaga tgagatc 467 <210> 5 <211> 341 <212> DNA <213> molecular marker for discrimination of Brassica oleracea <400> 5 gcgcgaacta ctcgctaaac aggtacggaa cgtactcctt gtggcttctg aatcggatgc 60 tgttcttagg ttataataat actctaccat gatccgatgt tcaatctaat ttagcttatc 120 gtttactcat tgatgatgat gatgttattc gtattagctt tggctggaag aaactttcaa 180 tttttggtct tctaagtttg gatttcatct cattgttcta tttcgatttt gatgaaccgt 240 ttagcatatt tgtcatctac aaaattatat gcttgcaaga gttgagttct aaggaggatt 300 tgaatatgca ggtggctttg gacttcacag aagatgagat c 341

Claims

서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 배추과(Brassicaceae family) 작물의 종(species) 식별을 위한 범용 프라이머 세트.
제1항에 있어서,
상기 배추과 작물은 애기장대, 무, 순무, 배추, 양배추, 흑겨자, 갓, 에디오피아 겨자, 유채 및 브로콜리로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 범용 프라이머 세트.
제1항의 프라이머 세트를 포함하는 배추과(Brassicaceae family) 작물 중 애기장대를 식별할 수 있는 서열번호 3으로 이루어진 애기장대 식별용 마커 조성물.
제1항의 프라이머 세트를 포함하는 배추과(Brassicaceae family) 작물 중 배추를 식별할 수 있는 서열번호 4로 이루어진 배추 식별용 분자마커.
제1항의 프라이머 세트를 포함하는 배추과(Brassicaceae family) 작물 중 양배추를 식별할 수 있는 서열번호 5로 이루어진 양배추 식별용 분자마커.
배추과 작물 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 게놈 DNA를 증폭하는 단계; 및
상기 증폭된 산물을 전기영동하여 증폭된 산물의 크기(size)를 분석하는 단계를 포함하는 배추과 작물의 종(species) 식별 방법.
제6항에 있어서,
상기 배추과 작물은 애기장대, 무, 순무, 배추, 양배추, 흑겨자, 갓, 에디오피아 겨자, 유채 및 브로콜리로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 식별 방법.