KR101546504B1

KR101546504B1 - 인삼 품종 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101546504B1
Application number: KR1020130091178A
Authority: KR
Inventors: 방경환; 김영창; 김장욱; 김동휘; 현동윤; 차선우; 김기홍
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2013-07-31
Filing date: 2013-07-31
Publication date: 2015-08-24
Also published as: KR20150015293A

Abstract

본 발명은 인삼 품종 판별용 프라이머 세트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 DNA 단편의 증폭 크기를 줄여 단시간에 인삼의 품종을 판별할 수 있는 인삼 품종 판별용 프라이머 세트에 관한 것이다.

Description

인삼 품종 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도{Primer sets for discriminating varieties of ginseng and uses thereof}

최근 유럽을 비롯한 각 나라들은 세계 무역기구의 지적재산권협정(WTO/TRIPS)에 따라 식물품종보호제도(Plant Variety Protection System, PVPS)의 시행을 의무화하고 있다. 우리나라도 국제 식물 신품종보호동맹(International Union for the Protection of New Varieties of Plants, UPOV) 가입, 종자 산업법의 발효 및 WTO 가입에 따른 수입 농산물의 개방으로 인하여 국내외 농산물에 대한 품종 구분의 필요성이 대두되고 있으며, 농가 소득 및 육종가의 지적 재산권을 보호하기 위해서도 과학적인 품종 구분 체계를 구축하는 것은 안정적으로 종자산업 분야를 발전시켜 나가는데 아주 중요한 일로 여겨지고 있다.

과학적인 품종 구분 체계 구축의 일환으로, 종래 농산물의 원산지판별을 위하여 최근에는 비파괴기술인 근적외선 분광법, 전자코, X-선 형광분석법 등이 많이 사용되고 있으며, 특히 근적외선 분광법을 이용한 비파괴 기술은 과채류의 당도, 곡류의 함수율, 아밀로오스의 함량, 우유와 유제품의 지방, 단백질 및 고형분함량 분석에 많이 응용되고 있으며, 농산물의 품종이나 원산지를 판별하기 위하여 전기영동, HPLC 분석법 등과 같은 기존의 단백질분석법을 활용할 수 있으나 시간과 비용이 많이 소요되는 단점 및 판별하고자 하는 농산물의 판별마커가 아직 개발되지 않은 단점이 있어 현장에서의 적용에 어려움이 있었다.

한편, 고려인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)은 약용식물로서의 수천 년 전부터 사용되어 왔으며, 인삼은 오랫동안 자기 환경에 알맞게 진화해왔다. 조금씩 자기가 처한 환경에서 잘 살 수 있도록 적응해 왔으며 그 환경에 맞게 자신을 변화시켜 왔고, 인삼은 가공 방법에 따라 수삼, 백삼, 홍삼 등으로 구분하고, 채굴된 자연 상태의 인삼을 수삼이라고 하며, 수삼의 껍질을 벗긴 뒤 햇빛이나 열풍에 건조시킨 것을 백삼(white ginseng)이라고 한다. 또한, 백삼을 껍질을 벗기지 않은 상태로 증기로 쪄서 건조한 것을 홍삼(red ginseng)이라 한다.

인삼은 세계적으로 한국산 고려인삼이 가장 우수한 것으로 예부터 알려져 왔다. 그러나 최근 웰빙과 천연 건강식품에 대한 관심으로 인삼 가공품 시장 규모와 원료삼의 수요가 증가함에 따라 값싼 외국삼이 밀수입되어 국내산 인삼으로 불법 유통되고 있다. 또한, 중국산 인삼이 밀무역으로 국내시장에 들어와 국내 재배 인삼의 입지를 어렵게 하고 있는 실정이고, 해외 인삼의 경우 3 ~ 4년생 인삼을 채굴하기 때문에 연근판별에 큰 의미를 두지 않으나, 국내의 경우 고년근일수록 약효가 뛰어나다는 관습적 믿음에 따라 고년근일수록 가격이 비싼 특성 때문에 유통시장에서 저년근을 6년 근으로 위장하는 사례가 빈번하여 유통질서가 교란되고 소비자 신뢰도가 떨어지는 원인이 되고 있기에 인삼의 연근판별이 큰 문제점이 되고 있는 실정이다.

향후 중국, 미국, 캐나다 등 인삼산업 경쟁국과의 자유무역협정이 발효되면 더욱 더 그 피해가 심각해질 것으로 전문가들은 예상하고 있다. 나아가, 홍콩 등 해외시장에서 한국산 고려인삼에 대한 소비자 인식이 좋아 국내 인삼 제품의 모조품까지 유통되고 있는 실정이다. 따라서 국내 인삼 재배농가들의 안정적인 소득 보장과 인삼의 유통질서를 바로잡기 위해 인삼의 과학적인 판별시스템 개발이 필요한 실정이다.

현재 농림부령 연근판별 검사기준은 수확시 검사담당직원이 입회하여 연근을 판정하며, 세부기준으로는 머리, 몸통 및 표피 형태, 다리 발달 정도, 절단시 나이테 등을 육안 또는 발색시켜 판별(농림부, 인삼산업법, 법률 제8조, 2004)하도록 되어 있는데, 재배 이력이 확인되는 현장에서 보조적인 판별법으로 사용되지만 관능평가 수준이라 논란의 여지가 많고, 더욱이 재배이력이 불분명한 유통시장에서는 적용하기 힘든 실정이라고 할 수 있다. 그 동안 연구 보고된 연근판별법으로는 뇌두경흔, 나이테, 지근발달, 기계건조법, 분비도관 조직염색, 진세노사이드 함량 분석법 등이 보고된 바 있으나 분비도관 조직염색법이 정확한 판별법으로 평가되고, 그 외 방법들은 신뢰도가 낮아 보조적으로 활용되는 수준이다. 그러나 분비도관 조직염색법은 주근의 뿌리 단면으로 판별하기 때문에 재배인삼의 경우에 한정되고 인삼분말에는 적용 불가능하고, 가공된 홍삼의 경우에는 적용하기 힘든 방법이다.

따라서, 식물의 종을 정확하고 신속하게 판별하기 위해 외부요소에 영향을 받지 않는 DNA 마커를 활용한 방법이 최근 주요작물을 대상으로 활발히 연구되고 있다. DNA 마커를 이용한 방법은 식물체의 모양과 크기 등 형태적 특성과 달리 외부환경의 영향을 받지 않고 식물의 종을 구분할 수 있으며, 사용할 수 있는 마커 수의 제한이 없어 정확한 판별이 가능하다.

그러나, 종래의 DNA 마커를 활용한 식물 종의 판별은 식물체 자체의 종 판별에 사용되는 DNA 마커에 관한 연구에 집중되어 있을 뿐, 식물체를 가공한 식품에 관한 연구는 미비한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 인삼의 품종을 과학적으로 판별할 수 있는 시스템에 사용될 수 있는 DNA 마커를 제공하려는데 목적이 있다.

또한, 다량의 인삼원료제품을 대상으로 단위시간당 처리 능력(through put)이 향상된 종 판별 시스템을 구축에 사용되며, DNA 단편의 증폭 크기를 줄인 효율적인 마커를 제공하려는데 목적이 있다.

본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 각각의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 각각의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트;로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 인삼 품종 판별용 프라이머 세트 조성물을 제공한다.

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본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 인삼 품종 판별용 프라이머 세트는 고려인삼(Panax ginseng C. A. Meyer), 중국삼(Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen) 및 미국삼(Panax quinquefolius L.)으로 이루어진 군 중 1개 이상의 품종을 판별할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 인삼 품종 판별용 프라이머 세트는 애기장대의 미토콘드리아 DNA를 사용하여 구축된 염기서열(consensus primer) 라이브러리로부터 얻어진 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상술한 본 발명의 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약; 을 포함하는 인삼 품종 판별용 키트를 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dTNPs 및 버퍼를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 인삼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 1단계; 상기 1단계의 DNA를 주형으로, 상술한 바에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응을 수행하여 증폭 산물을 제조하는 2단계; 및 상기 2단계의 증폭 산물을 검출하는 3단계; 를 포함하는 인삼 품종 판별방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 3단계의 증폭 산물 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 인삼 품종 판별방법은 고려인삼(Panax ginseng C. A. Meyer), 중국삼(Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen) 및 미국삼(Panax quinquefolius L.)으로 이루어진 군 중 1개 이상의 인삼 품종을 판별할 수 있다.

이하, 본 발명의 용어를 설명한다.

본 발명의 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3'-hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사 효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형이 가능하다. 이러한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 당업계에 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제작하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 "프라이머(primer)"는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로서, 적합한 조건(4가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도 및 적합한 버퍼하에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다.

본 발명은 인삼뿐만 아니라 상기 인삼을 가공한 인삼분말도 과학적으로 판별할 수 있는 시스템에 사용될 수 있는 DNA 마커를 제공하는 효과가 있다. 또한, 향후 다량의 인삼원료제품을 대상으로 단위시간당 처리 능력(through put)이 향상된 종 판별 시스템을 구축하고자 DNA 단편의 증폭 크기를 줄인 효율적인 DNA 마커를 제공하는 효과가 있다. 이로 인해, 국내 인삼 재배농가들의 안정적인 소득 보장과 인삼의 유통질서를 바로잡을 수 있는 과학적인 판별 시스템을 제공하는 효과가 있다.

또한, 본원 발명의 인삼품종 판별방법을 이용하여, 산업체에서는 품종과 원산지 보증된 원재료를 사용하여 신뢰할 수 있는 제품을 만들 수 있어, 국내산을 선호하는 소비자의 신뢰도 향상에도 기여할 수 있다.

도 1은 실시예 2-2에서 측정한 cox1 부위의 삽입 또는 결실에 의한 다형성 평가 결과이다.
도 2는 실시예 2-2에서 측정한 nad1/2-3 부위의 삽입 또는 결실에 의한 다형성 평가 결과이다.
도 3은 실시예 2-2에서 측정한 nad2/1-2 부위의 삽입 또는 결실에 의한 다형성 평가 결과이다.
도 4는 실시예 2-3에서 PCR 증폭반응을 통해 염기서열분석한 결과이다.
도 5는 실험예 1에서 본 발명의 PQ91 프라이머를 이용하여 고려인삼, 미국삼 및 중국삼의 PCR 반응을 수행한 결과이다.
도 6은 실험예 1에서 본 발명의 PN418 프라이머를 이용하여 고려인삼, 미국삼 및 중국삼의 PCR 반응을 수행한 결과이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 종래 널리 사용되었던 형태적 형질을 이용한 종의 구분은 주관적 요소가 배제되기 힘들고 동위효소 변이와 성분적 차이를 이용하는 방법은 재배환경의 영향을 받을 수 있으므로 정확하게 종을 구분하기 어려운 문제점이 있었다. 또한, 종래 DNA 마커들은 제한적인 품종의 적용과 PCR 이후의 추가적인 실험으로 인한 오랜 시간 소요와 임의 프라이머를 이용함으로써 발생하는 재현성 등의 문제점이 제기되어, 다양하게 가공된 다량의 인삼원료제품을 대상으로 단위시간당 처리 능력(through put)이 향상된 종 판별 시스템에 사용되는 새로운 DNA 마커의 제공이 필요한 실정이다.

이에 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 각각의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 각각의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 인삼 품종 판별용 프라이머 세트 조성물을 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 다량의 인삼제품의 품종을 신속하고 정확하며 간단하게 판별할 수 있는 신규 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 판별방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2의 각각의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 각각의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 인삼 품종 판별용 프라이머 세트 조성물을 제공한다.

상기 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

상기 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 80 내지 500bp의 길이로 사용할 수 있다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybridcomplex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적인 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 통상적으로 프라이머를 선별하기 위해 구축할 수 있는 라이브러리에서 얻어진 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 애기장대의 미토콘드리아 DNA를 사용하여 구축된 염기서열(consensus primer) 라이브러리로부터 얻어진 것일 수 있다.

나아가, 본 발명의 인삼 품종 판별용 프라이머 세트는 통상적으로 판별이 필요한 인삼 품종이라면 특별히 제한없이 판별할 수 있으나, 바람직하게는 고려인삼(Panax ginseng C. A. Meyer), 중국삼(Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen) 및 미국삼(Panax quinquefolius L.)으로 이루어진 군 중 어느 1개 이상의 품종을 판별할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 고려인삼과 중국삼 및/또는 고려인삼과 미국삼을 판별하는 것일 수 있다.

나아가, 본 발명은 상술한 바와 같은 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는 인삼 품종 판별용 키트(kit)를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 통상적으로 인삼 품종 판별용 키트에 포함되는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함할 수 있다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함할 수 있다.

상기 키트에 포함되는 프라이머 세트는 인삼 품종 판별을 위한 증폭용 프라이머 세트이며, 상기 키트에 포함되는 프라이머 세트는 본 발명의 인삼 품종 판별용 프라이머 세트를 이용하여 당업자가 용이하게 디자인할 수 있으며, 이와 같이 디자인된 프라이머 세트는 본 발명의 범위 내에 포함된다. 바람직하게는, 상기 인삼 품종을 대상으로 삽입 또는 결실(In/Del)에 의한 다형성 분석을 실시하고, 품종 특이적인 In/Del DNA 마커를 선발하여, 선발된 In/Del DNA 마커의 염기서열 분석 결과를 토대로 프라이머 세트를 디자인할 수 있다. 상술한 바와 같이, 디자인된 프라이머 세트는 선발 In/Del DNA 마커 4개의 염기를 포함하거나 포함하지 않는 DNA 프라이머 세트가 제작될 수 있다.

나아가, 상기 인삼 품종 판별용 키트는 통상적으로 인삼의 품종을 판별하는데 사용되는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 고려인삼(Panax ginseng C. A. Meyer), 중국삼(Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen) 및 미국삼(Panax quinquefolius L.)으로 이루어진 군 중 1개 이상의 품종을 판별하는데 사용될 수 있다.

더불어, 본 발명은 인삼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 1단계; 상기 1단계의 DNA를 주형으로, 상술한 바에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응을 수행하여 증폭 산물을 제조하는 2단계; 및 상기 2단계의 증폭 산물을 검출하는 3단계; 를 포함하는 인삼 품종 판별방법을 제공한다.

먼저, 1단계는 인삼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계이다. 상기 인삼 시료는 통상적으로 판별이 필요한 인삼이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 고려인삼(Panax ginseng C. A. Meyer), 중국삼(Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen) 및 미국삼(Panax quinquefolius L.)으로 이루어진 군 중 어느 1종 이상일 수 있다.

게놈 DNA 분리는 통상적으로 식물체에서 게놈 DNA를 분리하는데 사용되는 방법이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 인삼 시료를 분쇄 및/또는 파쇄하여 분말상태로 제조한 후 식물체 DNA 추출에 사용되는 키트를 사용하여 게놈 DNA를 분리할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 식물체 DNA 추출에 사용되는 키트는 독일에 소재한 퀴아젠(QIAGEN)사의 DNeasy Plant Mini Kit를 사용할 수 있다.

다음으로, 2단계는 상기 1단계의 DNA를 주형으로 상술한 바와 같은 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계이다.

상기 표적 서열을 증폭하는 방법은 통상적으로 식물의 품종 판별방법에서 표적 서열을 증폭하는 방법이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법을 사용할 수 있다.

상기 방법 중 중합효소연쇄반응(PCR)이란, 중합효소를 이용하여 표적 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트로부터 표적 서열을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수 있다.

또한, 상기 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 통상적으로 프라이머 표지 물질로 사용되는 것이라면, 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 브롬화에티디움(ethidium bromide) 또는 훽스트(Hoechst) 33258 염료를 사용할 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다.

나아가, 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군 중 어느 2종 이상의 염기서열을 포함하는 것을 사용할 수 있다.

다음, 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 설명한다.

상기 증폭 산물을 검출하는 방법은 통상적으로 증폭된 산물을 검출하는 방법이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있다.

상기 모세관 전기영동은 예를 들면, 에이비 시퀀서(ABi Sequencer)를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 상기 증폭 산물의 방사성을 측정할 수 있다.

또한, 본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 인삼 품종 판별방법은 검출된 증폭 산물을 인삼 품종 표준의 증폭 산물과 비교하여 품종을 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.

나아가, 상기 인삼 품종 판별방법은 통상적으로 재배 및/또는 판매되는 인삼의 판별이라면 특별히 제한없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 고려인삼(Panax ginseng C. A. Meyer), 중국삼(Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen) 및 미국삼(Panax quinquefolius L.)으로 이루어진 군 중 어느 1개 이상의 품종을 판별할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

[ 실시예 ]

실시예 1. DNA 추출

본 발명에 이용된 인삼 품종은 하기 표 1에 나타내었다.

상기 표 1의 모든 인삼은 농촌진흥청 국립원예특작과학원 인삼특작부 시험포장에 보존·증식된 것으로 고려인삼(Korean cultivar) 10품종, 중국삼(Chinese accession) 1품종 및 미국삼(American accession) 1품종의 4년생 잎을 각각 채취하여 인삼 시료로 사용하였다.

상기 인삼 시료는 액체 질소로 급랭시켜 막자사발을 이용하여 분말상태가 되도록 마쇄한 후, DNeasy Plant Mini Kit(독일 소재 퀴아젠(QIAGEN)사 제품)를 이용하여 제작사가 제공한 실험방법에 따라 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 Nanodrop(미국 소재 서모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)사 제품) 기기를 이용하여 농도를 측정하였는데, DNA 각각의 최종농도는 멸균된 증류수를 이용하여 5 ng/㎕로 조정하였다.

실시예 2. PCR 분석, 다형성 탐색 및 염기서열 분석

실시예 2-1: PCR 분석

상기 실시예 1에서 추출한 DNA로부터 중합효소연쇄반응(PCR)은 Biometra Tprofessional thermal cycler(독일 소재 와트만(Whatman)사 제품)에서 수행하였다.

PCR 반응액의 총 부피는 50 ㎕로서, 10 ng의 실시예 1의 DNA, 0.5 unit Taq DNA polymerase(한국 소재 인클론(Inclone)사 제품), 2.5 mM MgCl₂, 20 pmole primer 및 0.25 mM dNTPs를 혼합하여 제조하였다.

또한, PCR의 프라이머는 종래 Dumimil et al., 2002에 기재되어 있는 방법과 동일한 방법으로, 애기장대(Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.)의 미토콘드리아 DNA를 바탕으로 디자인된 30개의 프라이머 세트를 합성하여 사용하였다.

나아가, PCR 반응은 95 ℃에서 5분 동안 초기 변성(pre-denaturation)과정을 수행한 후, 95 ℃에서 30초, 55 ∼ 60 ℃에서 30초, 72 ℃에서 2분으로 구성된 증폭(amplifying) 과정을 35 회 반복 수행하였고, 마지막 단계인 마지막 증폭(final extention) 과정은 72 ℃에서 5분 동안 진행하였다.

상기 PCR 반응으로 증폭된 DNA 산물은 1.5% 아가로스 겔(agarose gel)에서 180 V로 전기 영동한 후, 브롬화 에티디움(EtB; Ethidium Bromide)으로 염색하여 UV-illuminator에서 band를 확인한 후 현상을 사진으로 기록하였다.

실시예 2-2: 다형성 탐색

상기 실시예 2-1에서 수득한 30개의 프라이머 세트를 실시예 1의 표 1에 기재되어 있는 고려인삼 10품종과 미국인삼 1종 및 중국인삼 1종의 외국인삼에 적용시켜 종간 다형성을 나타내는 삽입 또는 결실(In/Del, Insertion or Deletion) 프라이머를 선발하였다. 선발된 PCR 산물은 Mega Quick-spin Kit (Intron Bio, Korea)를 사용하여 정제한 후 마크로젠사(한국소재, Macrogen Co., Ltd)에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다. 염기서열은 바이오에디트 프로그램(Bioedit program)을 이용하여 편집하였고, 노 갭(no gap)으로 저장한 후 Cluster X(ver. 1.83, BioEdit, lbis Biosciences, Carlsbad, USA)로 염기서열을 정렬하였다.

상기 실시예 2-1에서 수득한 애기장대의 미토콘드리아 DNA를 바탕으로 합성한 30개의 염기서열(consensus primer)을 고려인삼 10품종과 외국삼 2품종(미국인삼 및 중국인삼)에 적용시킨 결과 cox1, nad1/2-3, nad2/1-2 부위에서 삽입 또는 결실(In/Del)에 의한 다형성이 확인되었다. 3쌍의 프라이머(cox1, nad1/2-3 및 nad2/1-2) 모두 고려인삼의 품종 간 다형성은 없었으나, 고려인삼과 외국삼(중국삼 및 미국삼) 간의 다형성을 확인할 수 있었다. 상기 다형성 분석에 사용된 PCR 사진은 도면 1 내지 3에 나타내었다.

도면 1 내지 3의 1~2번 레인은 천풍(Chunpoong), 3~4번 레인은 연풍(Yunpoong), 5~6번 레인은 고풍(Gopoong), 7~8번 레인은 금풍(Gumpoong), 9~10번 레인은 선풍(Sunpoong), 11~12번 레인은 선운(Sunwoon), 13~14번 레인은 선원(Sunwon), 15~16번 레인은 천선(Chungsun), 17~18번 레인은 선향(Sunhyang), 19~20번 레인은 천량(Cheonryang), 21~22번 레인은 미국인삼(P. quinquefolius), 23~24번 레인은 중국인삼인 삼칠인삼(P. notoginseng)이고, M은 2-로그 DNA 래더(ladder)(미국 메사추세츠주 소재 NewEnglandBiolab(NEB)사 제품)를 나타냈다.

도 1은 cox1 부위의 삽입 또는 결실에 의한 다형성 평가 결과이고, 도 2는 nad1/2-3 부위의 삽입 또는 결실에 의한 다형성 평가 결과이고, 도 3은 nad2/1-2 부위의 삽입 또는 결실에 의한 다형성 평가 결과이다.

도 1에서 확인되는 바와 같이, cox1에서는 고려인삼과 중국삼의 증폭된 DNA 단편의 크기가 약 1.3 kb로 확인되었으며 나머지 미국삼의 DNA 단편의 크기는 약 2.1 kb로 800 bp의 In/Del 다형성(polymorphisms)을 확인할 수 있었다.

또한, 도 2에서 확인되는 바와 같이, nad1/2-3에서는 고려인삼과 미국삼의 DNA 단편의 크기는 약 1.3 kb로 비슷하였으나 미국삼의 DNA 단편이 조금 더 작은 것으로 확인되었다. 반면, 중국삼의 DNA 단편은 약 1.5 kb로 종간 약 200 ~ 300 bp의 In/Del polymorphisms이 확인되었으며 동시에 3종의 인삼을 식별할 수 있었다.

나아가, 도 3에서 확인되는 바와 같이, nad2/1-2에서는 고려인삼과 미국삼의 DNA 단편의 크기는 동일하게 1.1 kb로 확인되었으나 중국삼의 DNA 단편은 1.2 kb로 약 100 bp의 삽입 또는 결실에 의한 다형성을 확인할 수 있었다.

상기 다형성 분석 결과를 토대로 다형성을 확인한 3쌍(cox1, nad1/2-3, nad2/1-2)의 프라이머 중 고려인삼과 중국삼 및 미국삼을 모두 식별할 수 있고, 종 간 In/Del의 차이가 크지 않아 마커로 전환이 용이한 nad1/2-3 프라이머를 선발하였다.

실시예 2-3: 염기서열분석

상기 실시예 2-2에서 선발한 nad1/2-3 프라이머를 이용하여 실시예 1에서 추출한 DNA를 실시예 2-1의 PCR과 동일한 방법으로 PCR 증폭반응을 수행하였고, 상기 PCR 증폭반응으로 수득한 PCR 증폭산물에 대해 염기서열 분석을 수행하였다. 상기 염기서열 분석 결과는 도면 4에 나타내었다.

도 4를 통해 확인되는 바와 같이, 고려인삼 10품종의 염기서열 길이는 모두 1,355 bp였으며, 미국삼은 1,334 bp, 중국삼은 1,587 bp로 각각 다르게 확인하였다. 고려인삼 10품종의 염기서열 길이는 모두 같았고 1,150∼1,370 bp 위치에서 10품종 모두 237 bp의 염기 결실이 확인하였다. 그러나 10품종 중 '천량'은 염기서열 80∼90 bp 위치에서 4개의 염기치환 (T→C, G→T, A→T, G→A)이 확인하여 고려인삼 9품종과 2종의 외국삼(미국인삼 및 중국인삼)과 확연한 차이를 나타내었다.

미국삼의 경우 360∼380 bp, 985∼995 bp, 1,150∼1,370 bp 위치에서 각각 14 bp, 7 bp, 237 bp의 염기서열 결실을 보였으며 염기치환은 확인되지 않았다.

중국삼은 가장 많은 변이를 보였으며 7곳(326 bp, 458 bp, 504 bp, 1,077 bp, 1,288 bp, 1,290 bp, 1,373 bp)에서 염기치환 (A→T, G→C, A→G, C→T, C→A, C→G, G→T)이 확인되었고 700∼710 bp 위치에서 5 bp의 염기서열 결실이 확인하였다.

실시예 3. 신규 프라이머 제작

고려인삼 10품종과 미국삼 및 중국삼의 미토콘드리아 nad1/2-3 지역을 PCR 증폭한 결과 삽입 및 결실에 의한 다형성으로 3종을 모두 구별할 수 있었다. 그러나 종 특이적인 염기결실의 차이가 너무 작아 육안으로 DNA 단편 길이의 차이를 식별하기에 무리가 있었으며, 타겟 DNA의 증폭구간도 길어 반응시간이 많이 소요되고 이로 인해 정확성과 재현성이 떨어지는 단점이 발생하였다.

따라서, 상기 실시예 2-2의 염기서열 분석을 통해 종간 삽입 및 결실(In/Del)의 다형성이 확인된 프라이머(nad1/2-3 프라이머)를 선별하였으며, 염기서열 변이를 토대로 보다 정확하고 빠른 분석을 위해 PCR 산물의 증폭사이즈를 500 bp 미만으로 하여 신속한 실험이 가능하도록 primer3(http://primer3.wi.mit.edu/)를 이용하여 프라이머를 디자인하였다. 상기에서 디자인한 프라이머는 증폭구간을 짧게 설계하여 기존의 프라이머 보다 반응 시간을 단축시켰으며 종 간 DNA 증폭 밴드 길이의 차이를 명확하게 식별할 수 있도록 제작하였다.

도 4에서 확인되는 바와 같이, 종 특이적인 염기서열 결실 부위를 타겟으로 2쌍의 프라이머 (PQ91, PN418)를 제작하였다. PQ91은 미국삼을 식별할 수 있는 마커로써 미국삼의 360∼380 bp 사이에 존재하는 14 bp의 염기서열 결실 부위를 타겟으로 설계하였다. PN418은 중국삼을 식별할 수 있는 마커로써 중국삼을 제외한 고려인삼 10품종과 미국삼의 1,110∼1,370 bp 위치에 존재하는 237 bp의 염기결실 부위를 타겟으로 설계하였다. 설계된 프라이머 두 세트는 하기 표 2에 나타내었다.

클론 정보	프라이머 이름	Sequence(5'→3')		PCR product size(bp)	Anneal Temp.(℃)
nad1/2-3	PQ91	GAGCAAACACTCGAACGTGA	서열번호 1	91 bp	60 ℃
		CGCCACTTCTCTGAAAGCAT	서열번호 2
	PN418	TGATGAAAGCACTCCAGTCG	서열번호 3	418 bp	60 ℃
		AACCACACGTGCAAGTTTCC	서열번호 4

실험예 1. 신규 프라이머를 이용한 고려인삼과 외국삼 판별

실시예 3에서 설계한 2개의 프라이머, PQ91과 PN418을 사용하여 고려인삼 10품종과 2종의 외국삼의 판별을 위하여, PCR 분석을 수행하였다.

상기 PCR 반응은 95 ℃에서 5분 동안 초기 변성(pre-denaturation) 과정을 수행한 후, 95 ℃에서 30초, 60 ℃에서 30초, 72 ℃에서 30초로 구성된 증폭(amplifying)과정을 35 회 반복하여 수행하였고, 마지막 증폭(final extention) 과정은 72 ℃에서 5분 동안 수행하였다. 상기 PCR 반응으로 증폭된 DNA 산물은 1.5% 아가로스 겔(agarose gel)에서 180 V로 전기 영동한 후, 브롬화 에티디움(EtB; Ethidium Bromide)으로 염색하여 UV-illuminator에서 band를 확인한 후 현상을 사진으로 기록하였다. 상기 PCR 반응으로 수득한 DNA 산물 band 사진은 도면 5 내지 6에 나타내었다.

도면 5 내지 6의 1~2번 레인은 천풍(Chunpoong), 3~4번 레인은 연풍(Yunpoong), 5~6번 레인은 고풍(Gopoong), 7~8번 레인은 금풍(Gumpoong), 9~10번 레인은 선풍(Sunpoong), 11~12번 레인은 선운(Sunwoon), 13~14번 레인은 선원(Sunwon), 15~16번 레인은 천선(Chungsun), 17~18번 레인은 선향(Sunhyang), 19~20번 레인은 천량(Cheonryang), 21~22번 레인은 미국인삼(P. quinquefolius ), 23~24번 레인은 중국인삼인 삼칠인삼(P. notoginseng)이고, M은 2-로그 DNA 래더(ladder)(미국 메사추세츠주 소재 NewEnglandBiolab(NEB)사 제품)를 나타냈다.

도 5는 PQ91 프라이머를 이용하여 고려인삼, 미국삼 및 중국삼의 PCR 반응을 수행한 결과이고, 도 6은 PN418 프라이머를 이용하여 고려인삼, 미국삼 및 중국삼의 PCR 반응을 수행한 결과이다.

도 5에서 확인되는 바와 같이, PQ91에서 미국삼은 91 bp의 DNA 단편이 고려인삼 10품종과 중국삼은 각각 105 bp의 DNA 단편이 확인되어 미국삼을 명확하게 판별할 수 있었다.

도 6에서 확인되는 바와 같이, PN418에서는 중국삼이 418 bp, 고려인삼 10품종과 미국삼의 밴드는 179 bp로 확인되어 중국삼을 명확하게 식별할 수 있었다.

또한, 상기 PCR 반응을 토대로 종 특이적인 2쌍의 마커(PQ91, PN418)를 이용하여 고려인삼과 미국삼 및 중국삼(전칠삼)을 판별한 결과는 하기 표 3과 같다. 표 3에서 나타낸 A와 B는 유전양상을 알파벳을 바코드 방식으로 정의한 것이다. 예를 들어 PQ91를 이용하여 PCR 반응을 수행하면 고려인삼과 전칠삼(중국삼)은 같은 유전양상을 보여 A의 유전자형으로, 미국삼은 고려인삼과 전칠삼과 다른 유전양상을 보여 B로 표시한 것이다.

상기 표 3에서 확인되는 바와 같이, 고려인삼과 미국삼 및 중국삼을 구별하기 위해 종 특이적인 2쌍의 마커(PQ91, PN418)의 조합으로 고려인삼과 2종의 외국삼(미국삼 및 전칠삼)을 완벽하게 판별할 수 있었다.

실시예 및 실험예를 통해 알 수 있듯이, 본 발명의 프라이머 세트는 통상적으로 널리 사용되는 3종의 인삼인 고려인삼, 미국삼 및 중국삼을 단시간 내에 판별할 수 있는 마커로써, 밀수 인삼, 국내 인삼 제품의 모조품 등의 부정유통 방지를 위한 현장 단속기술로 활용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 발명은 DNA 단편의 증폭 크기를 효과적으로 줄인 프라이머 세트를 제공하여 다량의 인삼을 대상으로 단위시간당 처리능력이 향상된 인삼 판별방법을 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명은 국내 인삼 재배농가들의 안정적인 소득 보장과 인삼의 유통질서를 바로잡을 수 있는 과학적인 판별 시스템을 제공하는 효과가 있다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT:RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Primer sets for discriminating varieties of ginseng and uses thereof <130> 1039892 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 gagcaaacac tcgaacgtga 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 cgccacttct ctgaaagcat 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 3 tgatgaaagc actccagtcg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 4 aaccacacgt gcaagtttcc 20

Claims

서열번호 1 및 서열번호 2의 각각의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 및
서열번호 3 및 서열번호 4의 각각의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트;
로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 인삼 품종 판별용 프라이머 세트 조성물.
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 고려인삼(Panax ginseng C. A. Meyer), 중국삼(Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen) 및 미국삼(Panax quinquefolius L.)으로 이루어진 군 중 1개 이상의 인삼 품종을 판별하는 인삼 품종 판별용 프라이머 세트 조성물.
제1항에 있어서, 상기 인삼 품종 판별용 프라이머 세트는 애기장대의 미토콘드리아 DNA를 사용하여 구축된 염기서열(consensus primer) 라이브러리로부터 얻어진 것인 인삼 품종 판별용 프라이머 세트 조성물.
제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트 조성물; 및
증폭 반응을 수행하기 위한 시약; 을 포함하는 인삼 품종 판별용 키트.
제6항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dTNPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 인삼 품종 판별용 키트.
인삼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 1단계;
제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트 조성물을 이용하여, 상기 1단계의 분리된 게놈 DNA의 증폭반응을 수행하여 증폭 산물을 제조하는 2단계; 및
상기 2단계의 증폭 산물을 검출하는 3단계;
를 포함하는 인삼 품종 판별방법.
제8항에 있어서, 상기 3단계의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 인삼 품종 판별방법.
제8항에 있어서, 상기 인삼 품종 판별방법은 고려인삼(Panax ginseng C. A. Meyer), 중국삼(Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen) 및 미국삼(Panax quinquefolius L.)으로 이루어진 군 중 1개 이상의 품종을 판별하는 인삼 품종 판별방법.