KR102126809B1 - 참당귀 품종 구별을 위한 ssr 마커 및 이의 용도 - Google Patents

참당귀 품종 구별을 위한 ssr 마커 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 5개의 SSR 프라이머 쌍을 포함하는 참당귀 품종을 구별하기 위한 SSR 프라이머 세트, 상기 SSR 프라이머 세트를 포함하는 참당귀 품종을 구별하기 위한 키트, 및 상기 SSR 프라이머 세트를 이용하여 참당귀 품종을 구별하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 참당귀 품종 판별용 SSR 프라이머를 통하여 참당귀 품종의 효율적인 식별이 가능할 뿐만 아니라, 참당귀의 분자육종 연구 및 선발에 유용한 정보를 제공할 수 있다.

Description

참당귀 품종 구별을 위한 SSR 마커 및 이의 용도{SSR molecular markers for discriminating of Angelica gigas Nakai and uses thereof}
본 발명은 참당귀 품종 및 자원 구별용 SSR 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
육종에 이용되고 있는 대부분의 작물에서 해마다 많은 양의 유전자원이 수입되고 있으며, 수입된 유전자원의 종내 혹은 아종내 자원구분은 정확한 유전자원의 관리를 위하여 필요하며 출원되는 품종의 신속한 판별은 신품종 보호를 위하여 매우 중요하다. 또한 국제 식물 신품종 보호동맹(International Union for the Protection of New Varieties of Plants, UPOV)에 우리나라가 가입하고 종자산업법이 발효되면서 육종가의 권리 보호 및 농가 소득 증대를 위하여 과학적인 국내외 농산물 품종 구분 필요성이 대두되었다.
참당귀(Angelica gigas Nakai)는 미나리과(Umbelliferae)에 속하는 여러해살이 식물로 한국과 일본, 중국 등에 분포하며 약용자원으로 널리 사용되고 있다. 당귀 속 식물의 기원정립을 위한 연구에는 형태학적 연구, 세포분류학적 연구 및 분자생물학적 연구가 꾸준히 진행되어 왔다 (Gil et al., 2016). 하지만 대부분 한약재는 가공처리 후 절편이나 분말형태로 사용하기 때문에 기원식물을 감정할 수 있는 다양한 분자생물학적 연구가 필요하다.
최근 개발된 분자생물학적 판별법은 형태적 및 이화학적 판별에서의 한계를 보완하고 종판별 결과의 신뢰도를 향상시켜 종 분류 및 계통분석에 관한 연구에 널리 활용되고 있다 (Williams et al., 1990; Moon et al., 2013; Kim et al., 2014). 특히 polymerase chain reaction (PCR) 기법을 이용한 random amplified polymorphic DNA (RAPD), single nucleotide polymorphism (SNP), simple sequence repeat (SSR) 등은 소량의 DNA를 이용하여 식물의 생장과 관계없이 모든 조직에서 안정적으로 탐색할 수 있으며 비교적 적은 비용으로 빠른 시간 안에 분석할 수 있다는 장점을 가진다 (Jo et al., 2013). 이들 중에서도 SSR을 이용하여 품종별 유전적 다양성을 분석하는 방법은 분자마커들 중 재현성이 가장 높고 분석이 비교적 쉬우며 간편하기 때문에 연구자들에게 선호도가 높다. 선행연구자들은 SSR 마커를 활용하여 약용작물인 인삼 (Panax ginseng), 도라지 (Platycodon grandiflorum)에서 유전다양성, 유연관계, 군집 구성 등에 관한 결과를 보고하였다 (Um et al., 2016ab; Song et al., 2012). 당귀 속 식물에서 분자마커를 사용하여 종식별에 대해 연구한 사례는 ITS, RAPD, ISSR 등이 보고되었다(Lee et al., 2001; Liao et al., 2013; Mei et al., 2015).
기존의 타작물의 연구에서 SSR 마커가 RAPD 마커에 비해 보다 효율적으로 자원의 변이를 탐색할 수 있다고 보고 되었음을 고려하였을때, 다양한 참당귀 자원 및 품종에 대한 변이 분석에 SSR 마커가 효율적일 것으로 생각된다.
당귀의 자원구분 및 품종을 구별할 수 있는 적절한 마커의 조합은 아직까지 국내외적으로 확립되지 못한 상태이며, 참당귀에서 적용 가능한 SSR 마커의 수도 제한적인 실정이다.
이에 본 발명자들은 참당귀의 유전자원을 효율적으로 평가할 수 있는 SSR 마커를 개발하기 위해 지속적으로 연구하던 중, 다양한 참당귀 계통들에서 다형성을 많이 나타내는 SSR 프라이머쌍을 선발함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 참당귀의 품종 구별용 SSR 프라이머 세트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용한 참당귀의 DNA 다형성 검출 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용한 참당귀의 품종 구별방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 참당귀 DNA 다형성 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 참당귀 품종 구별용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명은 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 포함하는 참당귀의 품종 구별용 SSR(Simple sequence repeat) 프라이머 쌍을 제공한다.
상기 서열번호 1 내지 10으로 표시된 5쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍은 각각 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 이루어져 있으며, 홀수로 표시된 서열번호가 정방향 프라이머이고, 짝수로 표시된 서열번호가 역방향 프라이머이다. 바람직하게는 AGNtri0012(열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 쌍), AGNtri0123(서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머 쌍); AGNtri0508(서열번호 5 및 6으로 표시되는 프라이머 쌍); AGNtri0746(서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머 쌍); AGNtri0968(서열번호 9 및 10으로 표시되는 프라이머 쌍);으로 이루어진 군에서 선택된다. 이들 모든 프라이머의 조합은 다형성이 가장 많이 생성되는 단순반복서열(simple sequence repeat)의 주변서열로부터 제작하였으며, 중합효소연쇄반응을 통해 증폭하여 전기영동을 통해 산물을 확인함으로써 품종 간, 개체 간 또는 종간 DNA 다형성을 검출하여 참당귀의 품종을 구별하는 데 적용될 수 있다.
상기 SSR 프라이머는 각 SSR 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 내지서열번호 10의 서열 내의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 SSR 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 10의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 10으로 표시된 5 쌍의 프라이머 쌍을 모두 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, “프라이머”는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 DNA 삽입(intercalating) 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질을 더 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 FAN, HEX 또는 NED이다. 표적 서열의 증폭 시 프라이머의 5'-말단에 FAN, HEX 또는 NED를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지물질로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍는 상기에 기재된 바와 같다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍을 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하는 것을 포함하는 참당귀의 DNA 다형성 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 참당귀의 품종판별용 프라이머쌍은 국내 다양한 재래자원 및 품종을 포함하는 199점의 자원에 대하여 다형성을 보이는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 “DNA 다형성”이라 함은 유전자좌 변이로 인한 DNA 염기서열의 차이를 말한다. 본 발명에서 DNA 다형성은 일정한 길이의 염기서열이 반복되는 횟수 등의 차이로 인해 DNA 염기서열 차이를 보이는 부분을 말한다(simple sequence repeat, SSR). “DNA 다형성 검출”이라 함은 DNA 염기서열의 차이를 나타내는 유전자좌의 부분을 확인하는 것이다. 즉, 본 발명에서 “DNA 다형성 검출”은 SSR 부위를 PCR 방법을 통해 검출하는 것을 말한다.
구체적으로 참당귀의 DNA 다형성 검출 방법은,
a) 참당귀로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
b) 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명의 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
c) PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계;
를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 참당귀 시료에서 게놈 DNA를 추출하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA의 추출은 발명의 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법 (Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res.,4321-4325,1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 발명의 기술 분야에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 발명의 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 PCR 산물 또는 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 P 또는 S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍은 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계로서, PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 P 또는 S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
아울러, 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 참당귀의 품종 구별방법을 제공한다.
구체적으로 참당귀의 품종 구별 방법은,
a) 참당귀 및 대조군 참당귀 품종으로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
b) 추출된 각 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명의 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계;
c) 각 PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계; 및
d) 상기 참당귀 및 대조군 참당귀 품종의 크기별 분리 결과를 비교하는 단계;
를 포함할 수 있다.
상기 a) 내지 c) 단계의 게놈 DNA 추출, PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리는 상기에서 기재한 바와 같으며, 상기 d) 단계에서 참당귀 및 대조군 참당귀 품종에 대한 비교는 동일한 조합의 SSR 프라이머쌍에 대한 시료가 되는 참당귀와 대조군 참당귀 품종의 각각의 PCR 산물의 크기를 서로 비교하는 방법으로 수행된다. 각 SSR 프라이머쌍을 적용한 PCR 산물에 대한 크기 비교 결과를 종합하여 시료가 되는 참당귀과 대조군 참당귀 품종의 결과와 모두 일치하면 시료가 되는 참당귀는 대조군 참당귀 품종과 동일한 품종으로 동정할 수 있다. 이와 같은 품종의 구별 방법은 신규 유전자원 도입시 중복여부 판단 및 원산지 확인을 통한 원산지 표시 위반 여부의 판정 등 품종의 구별이 필요한 경우에 유용하게 이용될 수 있다.
대조군 참당귀 품종에 대한 게놈 DNA 추출, PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리는 시료가 되는 참당귀와 동시에 수행될 수도 있으나, 시료가 되는 참당귀 보다 이전에 수행되어 동정의 기준표(reference)로 작성될 수도 있다. 이러한 기준표를 이용하면 시료가 되는 참당귀에 대한 게놈 DNA 추출, PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리만을 수행하여 기준표와 비교할 수 있어 유용하게 이용할 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 프라이머쌍을 포함하는 참당귀의 DNA 다형성 검출용 키트를 제공한다.
상기 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있으며, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 내열성 DNA 중합효소, dNTPs, 및 버퍼를 포함할 수 있다. 상기 dNTP 혼합물은 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하며, 내열성 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소, Tth DNA 중합효소 등 시판되는 내열성 중합효소를 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
또 다른 측면에서 본 발명은, 본 발명에 따른 프라이머쌍을 포함하는 참당귀의 품종 구별용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 SSR 프라이머 세트를 이용하여 참당귀의 자원 구분 및 품종 판별이 가능하다. 본 발명에 사용된 SSR 프라이머 세트는 참당귀 원산지에 따른 품종판별, 순도 검정, 품종보호와 종자 관리체계 확립을 위한 품종의 구별성, 균일성 및 안정성 검정에 활용될 수 있다. 또한 우리나라 육성 품종에 대한 참당귀 품종 등록시 품종 보증의 표지 인자로 활용될 수 있다.
도 1은 5개의 SSR 마커 세트에 판별되는 품종을 포함하는 199점의 참당귀 유전자원의 계통수를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[실시예]
시료 수집 및 DNA 추출
참당귀 시료는 강원 평창 7개소 42점, 충북 제천 5개소 25점, 경북 봉화 3개소 15점을 재배지에서 수집하였다. 또한 자생지에서의 참당귀는 강원도 인제 점봉산에서 3지점의 해발고도별 자원 117개를 수집하였다. 수집된 참당귀 자원은 하기 [표 1]에 정리하였다.
DNA추출을 위하여 수집된 개체의 잎 100mg을 동결건조하여 분쇄 후 사용하였다. 분쇄된 시료는 DNA 추출 직전까지 -80℃ 초저온 냉동고에 보관하였다. 유전다양성 검정을 위한 DNA는 Biomedic Plant gDNA Extraction Kit (Biomedic, Bucheon, Korea)의 방법에 따라 추출하였으며 추출된 DNA는 DeNovix DS-11+spectrophotometer (DeNovix, Wilmington, DE, USA)으로 정량하였고 농도를 10ng/㎕로 조정하여 사용하였다.
[표 1]
본 발명에 이용된 199개 참당귀 자원 정보
Figure 112018108984328-pat00001
Figure 112018108984328-pat00002
Figure 112018108984328-pat00003
Figure 112018108984328-pat00004
참당귀 SSR (Simple sequence repeat) 마커 선발
참당귀 SSR마커를 발굴하기 위하여 참당귀 유전체 염기서열 정보를 수집하고, CLC Genomics Workbench version 8.0. 프로그램을 통해 조립하였다. 참당귀 유전체 염기서열에서 SciRoKo version 3.4 software (http://kofler.or.at/bio- informatics/SciRoKo; Kofler et al., 2007)를 이용하여 SSR 구간을 탐색하였다. Primer 3 프로그램을 이용하여 각 구간을 증폭시킬 수 있는 PCR 프라이머를 제작하였다. 프라이머 조건은 길이 18～25bp, 온도는 48～60℃, G/C 비율 50% 이상으로 하였다.
PCR을 이용한 DNA 증폭 및 유전자형 결정
PCR 반응은 10 ng 게놈 DNA, 1 × Ex 버퍼, 1 μM 프라이머, 0.2 mM dNTPs, 및 0.5 unit Ex Taq DNA 중합효소 (Takara Bio, Otsu, Japan)를 포함하는 50 μL의 부피의 반응액과 C1000 Touch™ Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 수행하였다. PCR 증폭을 위한 조건은 95℃에서 5분간 예비변성(pre-denaturation)한 후, 95℃ 에서 45초, 55~60℃에서 45초, 72℃에서 45초로 35 cycles로 수행하였고, 최종 신장(final extention) 과정은 72℃에서 10분간 반응시켰다. 증폭된 DNA 산물은 증폭여부를 확인하기 위하여 1.5% 아가로스 겔에서 100V로 전기영동한 후, Safe Gel Stain (Inclone, Seoul, Korea)으로 염색하여 gel documentation system (Gel Doc™ XR + System, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에서 PCR증폭 산물을 확인하였다.
[표 2]
참당귀 SSR 마커 증폭을 위한 프라이머 세트 정보
Figure 112018108984328-pat00005
참당귀 SSR (Simple sequence repeat) 마커 선발
참당귀 SSR마커를 발굴하기 위하여 참당귀 유전체 염기서열 정보를 수집하고, CLC Genomics Workbench version 8.0. 프로그램을 통해 조립하였다. 참당귀 유전체 염기서열에서 SciRoKo version 3.4 software (http://kofler.or.at/bio- informatics/SciRoKo; Kofler et al., 2007)를 이용하여 SSR 구간을 탐색하였다. Primer 3 프로그램을 이용하여 각 구간을 증폭시킬 수 있는 PCR 프라이머를 제작하였다. 프라이머 조건은 길이 18～25bp, 온도는 48～60℃, G/C 비율 50% 이상으로 하였다.
PCR을 이용한 DNA 증폭 및 유전자형 결정
PCR 반응은 10 ng 게놈 DNA, 1 × Ex 버퍼, 1 μM 프라이머, 0.2 mM dNTPs, 및 0.5 unit Ex Taq DNA 중합효소 (Takara Bio, Otsu, Japan)를 포함하는 50 μL의 부피의 반응액과 C1000 Touch™ Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 수행하였다. PCR 증폭을 위한 조건은 95℃에서 5분간 예비변성(pre-denaturation)한 후, 95℃ 에서 45초, 55~60℃에서 45초, 72℃에서 45초로 35 cycles로 수행하였고, 최종 신장(final extention) 과정은 72℃에서 10분간 반응시켰다. 증폭된 DNA 산물은 증폭여부를 확인하기 위하여 1.5% 아가로스 겔에서 100V로 전기영동한 후, Safe Gel Stain (Inclone, Seoul, Korea)으로 염색하여 gel documentation system (Gel Doc™ XR + System, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에서 PCR증폭 산물을 확인하였다.
[표 3]
SSR 마커의 정보
Figure 112018108984328-pat00006
실시예 2. SSR 마커의 다형성 및 유전적 다양성 분석
선발된 5개의 마커를 사용하여 PCR증폭하고 Fragment AnalyzerTM Automated CE system을 활용하여 각 유전자원 199개체를 분석하였다. 각 밴드 크기를 데이터화 하였다(표 4).
[표 4]
199개 참당귀 유전자원에 대한 SSR 마커의 대립유전자 크기 데이터
Figure 112018108984328-pat00007
(이어서)
Figure 112018108984328-pat00008
(이어서)
Figure 112018108984328-pat00009
(이어서)
Figure 112018108984328-pat00010
(이어서)
Figure 112018108984328-pat00011
(이어서)
Figure 112018108984328-pat00012
이 분석 시스템은 SSR분석을 위하여 형광 dye가 결합된 프라이머를 제작하고 증폭산물을 만들어 형광물질의 양을 측정하던 방법에 비해 실험단계를 축소시킬 수 있으며 실험실 내에서 빠른 시간 내에 결과물을 작성 할 수 있다는 장점이 있다(Park et al., 2016). GeneMaker software를 사용하여 각각의 마커들에 PCR fragment analyzer 분석 결과를 [표 5]에서 정리하였다.
각 마커별 주요 위치에서 증폭되는 대립유전자가 나타나는 빈도수 (major allele frequency, MAF)를 분석한 결과 0.27～0.39 값을 나타냈다. 다형성을 보이는 마커에서 검출된 대립인자의 수 (NA)는 AGNtri0012는 12개, AGNtri0123는 8개, AGNtri0508는 9개, AGNtri0746는 15개, AGNtri0968는 14개의 대립유전자가 있는 것으로 나타났다. 따라서 본 연구에서 개발된 참당귀 유전체 기반 SSR 마커에서는 총 58개의 대립유전자가 감지되었고, 평균적으로 11개의 대립유전자가 나타나는 것으로 분석되었다. 이형접합성 기대치(Expected heterozygosity, H E )는 전체 개체 중에서 이형접합을 보일 것으로 예상되는 개체의 비율을 뜻하는데 AGNtri0012, AGNtri0746 > AGNtri0968 >AGNtri0508 > AGNtri0123 순으로 분석되었다. 전체적인 이형접합도 분석값은 0.72 내지 0.83를 나타냈다. 분석한 샘플 중에서 이형접합성을 보이는 샘플의 비율을 나타내는 이형접합성 관찰치(oserved heterozygosity, H O )값은 평균 0.59로 분석되었다.
다형성 정보 함량(polymorphism information content, PIC) 평균값은 0.76이며 0.68 내지 0.82을 나타냈는데 Kim 등 (2016)에 의하면 PIC값이 0.5이상이면 다형성 분석에 유익한 마커라고 보고된 바 있으며 선행 연구된 결과에 따르면 인삼과 감초 그리고 참당귀의 SSR마커에서도 PIC값이 0.5이상인 마커에서 종 및 품종의 다형성 분석에 유익한 마커임을 증명한 바 있다(Um et al., 2016a; Um et al., 2016b; Park et al., 2016).
[표 5]
선발된 참당귀 SSR 마커의 분석결과
Figure 112018108984328-pat00013
실시예 3. 수집한 참당귀 자원들간의 유전적 다형성 분석
선발된 참당귀 SSR 마커를 활용한 절편 분석결과를 토대로 [도 1]과 같이 계통도를 작성하고 유연관계를 분석하였다. 참당귀 유전자원은 주산지인 강원 평창, 충북 제천, 경북 봉화 및 자생지인 강원도 인제 점봉산의 해발고 3지점에서 수집된 199개체의 유연관계를 분석한 결과 개체간 변이로 인해 재배지별 군집이 형성되지는 않았다. 그러나, 점봉산 내 자생지 3개소에서 수집된 참당귀 개체들은 해발고별로 군집이 형성되어 있음을 알 수 있었다.
작물의 유전적 다양성과 유전적 관계에 대한 연구는 품종 개발 및 육종에 있어 경제적이며 효율적이다. SSR 마커는 linkage map 개발, QTL 매핑, MAS(marker-assisted selection), cultivar fingerprinting, 유전적 다양성 분석, 유전자 합성경로 및 진화 연구를 포함하여 많은 식물 과학 분야에서 사용되어 왔다(Cavagnaro et al., 2010; Zhu et al., 2011, Shedure, 2008). 본 발명에서는 5개의 SSR마커를 선발하여, 4개 지역 18개소에서 수집된 199개 참당귀 유전자원의 유전다양성을 평가하고 유연관계를 분석하였으며, 이를 통해 국내 재배종과 자생종 참당귀의 유전적 다양성과 유연관계를 확인할 수 있었다. 본 연구결과를 바탕으로 차후 당귀의 분자육종을 위한 선발마커로의 활용이 기대된다.
<110> National Institute of Forest Science <120> SSR molecular markers for discriminating of Angelica gigas Nakai and uses thereof <130> 1064434 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AGNtri0012-F <400> 1 gttccgcaac atcaaggac 19 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AGNtri0012-R <400> 2 taccatccct gttgttctct cc 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AGNtri0123-F <400> 3 acttcaccta tcccattcct cc 22 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AGNtri0123-R <400> 4 caagctggcc ttgagaaaac 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AGNtri0508-F <400> 5 tcttcttctc cagagctcct c 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AGNtri0508-R <400> 6 acgaatcaga tacgagtcct gc 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AGNtri0746-F <400> 7 gtagcttgcg aaatcagagc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AGNtri0746-R <400> 8 gtgtaagatc ttggaggcca 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AGNtri0968-F <400> 9 aatctttcct ccgtggtctc 20 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AGNtri0968-R <400> 10 ctaatgattc ctcctccact gc 22

Claims (5)

  1. 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 6으로 표시되는 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머 쌍; 및 서열번호 9 및 10으로 표시되는 프라이머 쌍;을 포함하는, 참당귀의 품종 구별용 SSR(Simple Sequence Repeat) 프라이머 세트.
  2. a) 참당귀 품종으로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
    b) 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항의 SSR 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계; 및
    c) 상기 참당귀 품종 각각의 증폭산물을 크기별로 분리하는 단계;를 포함하는 포함하는 참당귀의 DNA 다형성 검출 방법.
  3. a) 참당귀 품종으로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
    b) 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항의 SSR 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계; 및
    c) 상기 참당귀 품종 각각의 증폭산물을 크기별로 분리하는 단계; 및
    d) 제1항의 SSR 프라이머 세트에 의한 상기 참당귀 품종의 크기별 분리 결과를 비교하는 단계;를 포함하는 포함하는 참당귀 품종을 구별하는 방법.
  4. 제1항의 SSR 프라이머 세트를 포함하는, 참당귀 품종의 DNA 다형성 검출용 키트.
  5. 제1항의 SSR 프라이머 세트를 포함하는, 참당귀 품종 구별용 키트.
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