KR102019966B1 - 황기의 품종을 구분하기 위한 특이 ssr 프라이머 및 이의 용도 - Google Patents

황기의 품종을 구분하기 위한 특이 ssr 프라이머 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 황기 판별을 위한 SSR 마커에 대한 프라이머 세트 및 이를 이용한 황기의 판별 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 황기 판별을 위한 SSR 마커에 대한 프라이머 세트, 이를 포함하는 황기 판별용 조성물, 이를 포함하는 황기 판별용 키트 및 이를 이용한 황기를 구별하는 방법에 관한 것이다.

Description

황기의 품종을 구분하기 위한 특이 SSR 프라이머 및 이의 용도 {Specific SSR primer for discrimination of Astragalus membransis and uses thereof}
본 발명은 황기 품종을 구분하기 위한 특이 SSR 프라이머 세트 및 이를 이용한 황기의 판별 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 황기 판별을 위한 SSR 마커에 대한 프라이머 세트, 이를 포함하는 황기 판별용 조성물, 이를 포함하는 황기 판별용 키트 및 이를 이용한 황기를 구별하는 방법에 관한 것이다.
육종에 이용되고 있는 대부분의 주요 작물 및 소재배 작물에서 해마다 많은 양의 유전자원이 수집되고 있다. 그러나, 이에 반해 유전자원에 대한 평가는 충분히 이루어지지 않고 있는 실정이다. 수집된 유전자원의 종간 및 아종간 품종의 신속한 판별은 정확한 유전자원의 관리 및 보호를 위하여 매우 중요하다. 또한 품종의 판별과 함께 유전자원의 유형 형질 탐색과 분류, 그리고 유연관계의 규명은 유전자원의 보존이나 신품종의 창출 및 작물의 개량에 있어서 매우 중요하다. 최근 분자생물학의 급속한 발전으로 핵산(DNA) 수준에서 유전자원의 다양성(bio-diversity) 연구를 가능케 하는 핵산 지문 분석 방법 및 다양한 DNA 마커들이 개발되었다. 이를 통해 유용 형질 탐색, 생물의 종 판별, 품종 분류, 동정 및 집단 개체군의 유연관계 분석을 외부환경 등에 대하여 거의 영향을 받지 않고 간단하고 신속하게 수행할 수 있게 되었다. 지금까지 개발된 PCR(polymerase chain reaction)을 이용한 지문분석법(fingerprinting)에는 RAPD(randomly amplified polymorphic DNAs) 방법, AFLP(amplified fragment length polymorphic DNA) 방법, SSR(simple sequence repeat) 방법 등이 있다. 상기 방법 중 RAPD 방법은 비특이적 PCR 산물이 증폭되므로 재현성이 떨어지는 단점이 있고, AFLP 방법은 높은 DNA 다형성 검출로 각광받고 있지만 재현성이 떨어지는 밴드의 출현과 분석이 복잡하다는 단점이 있다. 이에 반해, SSR 방법은 DNA 반복 배열인 초위성체(microsatellite) 영역의 염기 배열 정보를 근거로 PCR 프라이머를 제작하여 이용하는 방법으로서, 초위성체 분석이 용이하고 높은 재현성을 가지는 장점으로 인하여 생물종의 동정에 자주 사용되고 있다. 특히 SSR방법은 외부 환경의 영향을 전혀 받지 않는다는 장점이 있다. 이와 같은 SSR 방법의 우수성으로 인해 여러 주요작물 및 소재배 작물에서 SSR 마커를 개발하려는 연구가 한창 진행 중에 있다.
세계적으로 황기 속에는 약 3000여종이 포함되어 있고 최근 연구자들은 A. membranaceus var. nakaianus 종에서 published enrichment protocol 기법을 이용하여 10개 초위성체(SSR) 마커를 보고하였고 종 다양성 판별 및 품종구분 등에 이용될 수 있다고 제시하였다 (Choi and Choi. 2013). 그러나 국내 및 중국을 포함한 다수의 황기종 분류에 대한 초위성체(SSR) 마커는 전혀 개발된 바 없으며, 외국의 경우 이와 관련된 연구가 극히 드문 실정이다.
이에 본 발명자들은 황기 유전자원을 효율적으로 평가할 수 있는 SSR 마커를 개발하기 위하여 노력하였다. 그 결과, 지역적으로 격리된 황기계통에서 다형성 변이를 나타내는 SSR 프라이머쌍을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20의 프라이머 세트; 서열번호 23 및 27의 프라이머 세트; 및 서열번호 33 및 34의 프라이머 세트; 로 이루어진 군으로부터 선택된, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기, 및 아성 황기 중에 길림 황기를 판별하기 위한 황기 판별용 SSR(simple sequence repeat) 프라이머 세트을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 프라이머 세트; 및 서열번호 31 및 32의 프라이머 세트; 로 이루어진 군으로부터 선택된, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기, 및 아성 황기 중에 산청 황기를 판별하기 위한 황기 판별용 SSR(simple sequence repeat) 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 프라이머 세트; 및 서열번호 31 및 32의 프라이머 세트; 로 이루어진 군으로부터 선택된, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기, 및 아성 황기 중에 제천 황기를 판별하기 위한 황기 판별용 SSR(simple sequence repeat) 프라이머 세트을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 프라이머 세트; 서열번호 31 및 32의 프라이머 세트; 및 서열번호 33 및 34의 프라이머 세트; 로 이루어진 군으로부터 선택된, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기, 및 아성 황기 중에 풍성 황기를 판별하기 위한 황기 판별용 SSR(simple sequence repeat) 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 프라이머 세트; 서열번호 31 및 32의 프라이머 세트; 및 서열번호 33 및 34의 프라이머 세트; 로 이루어진 군으로부터 선택된, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기, 및 아성 황기 중에 아성 황기를 판별하기 위한 황기 판별용 SSR(simple sequence repeat) 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 프라이머 세트; 서열번호 31 및 32의 프라이머 세트; 및 서열번호 33 및 34의 프라이머 세트; 로 구성된, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기, 및 아성 황기로 이루어진 군으로부터 어느 하나 이상의 황기를 판별하기 위한 황기 판별용 SSR(simple sequence repeat) 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 서술한 프라이머 세트를 포함하는, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기, 및 아성 황기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 황기를 판별용 조성물를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 서술한 프라이머 세트를 포함하는 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기, 및 아성 황기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 황기를 판별용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 황기로부터 분리한 DNA에 대하여, 상기 서술한 프라이머 세트를 이용하여 PCR를 수행하는 단계를 포함하는 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기, 및 아성 황기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 황기를 구별하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20의 프라이머 세트; 서열번호 23 및 27의 프라이머 세트; 및 서열번호 33 및 34의 프라이머 세트; 로 이루어진 군으로부터 선택된, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기 및 아성 황기 중에 길림 황기를 판별하기 위한 황기 판별용 SSR(simple sequence repeat) 프라이머 세트, 황기 판별용 조성물 내지 키트를 제공할 수 있다.
본 발명은 또한, 황기로부터 분리한 DNA에 대하여, 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계를 포함하는 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기 및 아성 황기 중에 길림 황기를 구별하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명은 또한, 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 프라이머 세트; 및 서열번호 31 및 32의 프라이머 세트; 로 이루어진 군으로부터 선택된, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기 및 아성 황기 중에 산청 황기를 판별하기 위한 황기 판별용 SSR(simple sequence repeat) 프라이머 세트, 황기 판별용 조성물 내지 키트를 제공할 수 있다.
본 발명은 또한, 황기로부터 분리한 DNA에 대하여, 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계를 포함하는 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기 및 아성 황기 중에 산청 황기를 구별하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명은 또한, 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 프라이머 세트; 및 서열번호 31 및 32의 프라이머 세트; 로 이루어진 군으로부터 선택된, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기 및 아성 황기 중에 제천 황기를 판별하기 위한 황기 판별용 SSR(simple sequence repeat) 프라이머 세트, 황기 판별용 조성물 내지 키트를 제공할 수 있다.
본 발명은 또한, 황기로부터 분리한 DNA에 대하여, 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계를 포함하는 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기 및 아성 황기 중에 제천 황기를 구별하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명은 또한, 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 프라이머 세트; 서열번호 31 및 32의 프라이머 세트; 및 서열번호 33 및 34의 프라이머 세트; 로 이루어진 군으로부터 선택된, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기 및 아성 황기 중에 풍성 황기를 판별하기 위한 황기 판별용 SSR(simple sequence repeat) 프라이머 세트, 황기 판별용 조성물 내지 키트를 제공할 수 있다.
본 발명은 또한, 황기로부터 분리한 DNA에 대하여, 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계를 포함하는 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기 및 아성 황기 중에 풍성 황기를 구별하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명은 또한, 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 프라이머 세트; 서열번호 31 및 32의 프라이머 세트; 및 서열번호 33 및 34의 프라이머 세트; 로 이루어진 군으로부터 선택된, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기 및 아성 황기 중에 아성 황기를 판별하기 위한 황기 판별용 SSR(simple sequence repeat) 프라이머 세트, 황기 판별용 조성물 내지 키트를 제공할 수 있다.
본 발명은 또한, 황기로부터 분리한 DNA에 대하여, 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계를 포함하는 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기 및 아성 황기 중에 아성 황기를 구별하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명은 또한, 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 프라이머 세트; 서열번호 31 및 32의 프라이머 세트; 및 서열번호 33 및 34의 프라이머 세트; 로 구성된, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기 및 아성 황기로 이루어진 군으로부터 어느 하나 이상의 황기를 판별하기 위한 황기 판별용 SSR(simple sequence repeat) 프라이머 세트, 황기 판별용 조성물 내지 키트를 제공할 수 있다.
본 발명은 또한, 황기로부터 분리한 DNA에 대하여, 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계를 포함하는 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기 및 아성 황기로 이루어진 군으로부터 어느 하나 이상의 황기를 구별하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에서는 황기에서 처음으로 SSR 마커를 개발하였으며, 본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 황기의 DNA 다형성을 효과적으로 검출하여 황기의 DNA 프로파일을 작성하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다. 이를 통해 황기의 유전자원을 효율적으로 평가함으로써 신규 유전자원 도입시 기존 보유자원과의 중복성 분석 및 신규성 확립을 효과적으로 수행할 수 있으며, 황기의 품종을 판별할 수 있다.
도 1은 길림, 산청, 제천, 풍성 및 아성의 황기로부터 추출한 DNA에 (a) Am-gSSR1, (b) Am-gSSR2, (c) Am-gSSR4, (d) Am-gSSR6, (e) Am-gSSR8, (f) Am-gSSR11, (g) Am-gSSR12, (h) Am-gSSR14, (i) Am-gSSR16 및 (j) Am-gSSR17을 이용하여 PCR한 뒤 겔 로딩하여 PCR 결과물의 fragment 결과를 이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
상술한 바와 같이, 수많은 식물품종에 관해 지금까지 SSR 프라이머쌍에 관해 보고된 바 있음에도 불구하고, 황기에서 유래된 SSR 프라이머쌍에 관한 연구는 없었다.
본 발명은 지역적으로 격리된 황기(Astragalus membransis)로부터 유래된 SSR 프라이머쌍 및 이의 용도를 밝혀냄으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 황기의 유전자원을 효율적으로 평가할 수 있는 효과가 있다.
본 발명은 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20의 프라이머 세트; 서열번호 23 및 27의 프라이머 세트; 및 서열번호 33 및 34의 프라이머 세트; 로 이루어진 군으로부터 선택된, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기, 및 아성 황기 중에 길림 황기를 판별하기 위한 황기 판별용 SSR(simple sequence repeat) 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명은 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 프라이머 세트; 및 서열번호 31 및 32의 프라이머 세트; 로 이루어진 군으로부터 선택된, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기, 및 아성 황기 중에 산청 황기를 판별하기 위한 황기 판별용 SSR(simple sequence repeat) 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명은 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 프라이머 세트; 및 서열번호 31 및 32의 프라이머 세트; 로 이루어진 군으로부터 선택된, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기, 및 아성 황기 중에 제천 황기를 판별하기 위한 황기 판별용 SSR(simple sequence repeat) 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명은 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 프라이머 세트; 서열번호 31 및 32의 프라이머 세트; 및 서열번호 33 및 34의 프라이머 세트; 로 이루어진 군으로부터 선택된, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기, 및 아성 황기 중에 풍성 황기를 판별하기 위한 황기 판별용 SSR(simple sequence repeat) 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명은 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 프라이머 세트; 서열번호 31 및 32의 프라이머 세트; 및 서열번호 33 및 34의 프라이머 세트; 로 이루어진 군으로부터 선택된, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기, 및 아성 황기 중에 아성 황기를 판별하기 위한 황기 판별용 SSR(simple sequence repeat) 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명은 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 프라이머 세트; 서열번호 31 및 32의 프라이머 세트; 및 서열번호 33 및 34의 프라이머 세트; 로 구성된, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기, 및 아성 황기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 황기를 판별하기 위한 황기 판별용 SSR(simple sequence repeat) 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에서 제공되는 프라이머쌍 및 이들에 의해 증폭되는 초성위체의 크기, Tm(℃) 및 초성위체가 존재하는 염색체 대립인자에 대한 정보를 하기 표 1에 나타내었다.
프라이머명 서열 서열번호 SSR종류 증폭되는 초성위체의 크기(bp) Tm(℃)
Am-gSSR1 CCATCGCAGTTGGACAAT 1 AAC 474 58
GGATTTGGTCTCAGCAGAGTAG 2
Am-gSSR2 CCCTCTATCTCTAGTCACATCGG 3 AAC 465 58
AGAGGATTGAAGGTAGAGTGGG 4
Am-gSSR3 GGTAGCCACCACCGTTAGTT 5 AAC 468 57
TGAGTAGAACTGCCTTTGGG 6
Am-gSSR4 GCTTGGAACACAAGCAATGG 7 AAC 441 58
GATGTAAGTGCTGCTGCCA 8
Am-gSSR5 ATTGTATACCAGCACGCAGC 9 AAG 471 58
CCATGGCAAGAGAAGATGTC 10
Am-gSSR6 CGGAAGACGACCAATGTGTA 11 AAT 465 59
GGAGCTCCTCCACTTGAATATC 12
Am-gSSR7 GTAGACAAACCCGCCTCAAT 13 AAT 480 58
GGTGGACTTGGTATGAGAGAGA 14
Am-gSSR8 CACGTTGCTGCTCAATCTGT 15 AAT 471 57
AGTTGCTTGCGAGCTTTG 16
Am-gSSR9 ACCACTTCTCGACTCATCTCC 17 ACA 471 60
CCATAGTCAAAAGAGGAGGCTG 18
Am-gSSR10 CTGCTAGAGAAACCCTTGCTTC 19 ACA 465 58
CCTCAATCACAAGTGCCTTC 20
Am-gSSR11 GGGTTCAGATGGCTGAACTAAC 21 CAA 471 58
AGAGAAGGAGTTCCACGTGTC 22
Am-gSSR12 GCAACAACCACAACTACTGAGG 23 GAT 471 57
AAGCCAAAACAGGGAACC 24
Am-gSSR13 CCACTATTGACAACATCGCC 25 TCT 486 57
GTGGAAGGACTTTGAACCTG 26
Am-gSSR14 ACTAGCACCAACAGGTCTGA 27 TGA 492 58
ACCTCCGCCACTAGTTAAGAAC 28
Am-gSSR15 GGAGCAGGAATTGTCAGAGA 29 TGT 474 57
ACAGTGTGTGAGAGTGGGAAG 30
Am-gSSR16 GCAGAGAAGAAGGATGGAGAAG 31 GAGG 474 59
CTAACACGTTCTCTCACTCCCA 32
Am-gSSR17 GTGTAACAGCTGGGGGATAAAG 33 TCAC 470 59
GATGGCCATGTCGAAGGTA 34
상기 SSR 프라이머쌍은 황기(Astragalus membransis)로부터 유래된 것일 수 있다. 본 발명의 황기는 국립원예특작과학원 인삼특작부 시험포장에서 재배중인 풍성, 아성과 지역수집종인 제천, 산청 및 해외수집종인 중국 길림을 사용하였으며, 각 계통의 잎 100mg에서 DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)을 이용하여 DNA를 추출하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 SSR(Simple Sequence Repeat)은 미세부수체(Microsatellites) 또는 Short Tandem Repeats (STRs)라고도 불리는 DNA 다형성의 일종이다. SSR은 일반적으로 중립이고 공우성(co-dominant)이며, 혈통이나 군집에서 표현형과 유전형을 매개할 수 있는 유전학적인 마커로 사용되는 유전체 내의 1-6개의 반복되는 염기서열을 의미한다.
본 발명에서 용어, '프라이머'란 상보적인 주형과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.
또 다른 양태로서, 상기 프라이머 세트를 포함하는 황기 판별용 조성물을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 황기 판별용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 황기 판별용 키트는 상기 프라이머 세트 외에도 시료 내에서 황기 판별을 위하여 필요한 반응완충용액, 중합효소, dNTP, 안정화제 및 모든 생물학적 또는 화학적 시약, 사용설명서 등을 포함할 수 있다. 이러한 키트의 다른 구성은 당업자에 의하여 적절히 선택될 수 있다.
또 다른 양태로서, 황기로부터 분리한 DNA에 대하여, 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR를 수행하는 단계를 포함하는 황기를 구별하는 방법을 제공한다.
상기 구별은 PCR을 통해 수득한 PCR 산물의 전기영동 패턴을 분석하는 것으로 수행하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다
본 발명의 상기 개체는 판별하고자 하는 대상 황기이다.
본 발명의 PCR 수행은, 개체로부터 얻어진 핵산 시료를 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 프라이머 세트; 서열번호 31 및 32의 프라이머 세트; 및 서열번호 33 및 34의 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택된 프라이머 세트를 갖는 황기 판별용 SSR 프라이머를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, PCR 수행은 90 내지 100℃에서 1분 내지 5분간 preheating을 거친 후, 90 내지 100℃에서 1분 내지 5분(denaturation), 45 내지 60℃에서 10초 내지 50초(annealing), 72℃에서 30초 내지 2분(extension)간의 반응을 30 내지 40회 실시하고, 최종 extension 과정으로 72℃에서 1 내지 10분간하는 과정을 30 내지 40 cycle 반복하여 반응시키는 과정을 통해 이루어질 수 있다.
상기 PCR 수행을 통해 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 하나의 구체적 예로서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사선을 발하는 물질일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 표지 물질은 에티디움브로마이드(Ethidium Bromide: EtBr), Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭 시 프라이머의 5′말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사선 물질을 이용한 표지는 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사선 동위원소를 PCT 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사선이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사선으로 표지될 수 있다.
상기 증폭된 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사선 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5′말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사선 측정 방법은 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사선 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사선 측정기구, 예를 들면, 가이어 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사선을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
게놈 DNA 추출
황기 유식물체 1g을 취하여 액체질소로 급랭시켜 막자사발을 이용하여 분말상태가 되도록 마쇄한 후, DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)을 이용하여 제조사가 제시한 실험방법에 따라 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA) 기기를 이용하여 농도를 측정하였다. 각각의 DNA 최종농도는 멸균된 증류수를 이용하여 5 ng/μL로 조정하였다.
초성위체를 포함하는 DNA를 증폭하는 프라이머 선발
황기 유전체 염기서열에서 SciRoKo version 3.4 software (http://kofler.or.at/bioinformatics/SciRoKo; Kofler et al., 2007)를 이용하여 SSR 구간을 탐색하였다. Primer 3 프로그램을 이용하여 각 구간을 증폭시킬 수 있는 PCR 프라이머를 제작하였다. 프라이머 조건은 길이 18~5bp, 온도는 48~60℃, G/C 비율 50% 이상으로 하였다.
PCR 반응
PCR 반응액의 총 부피는 50 μL로서, 10 ng genomic DNA, 1 × Ex buffer, 1 μM primer, 0.2 mM dNTPs, 그리고 0.5 unit Ex Taq DNA polymerase (Takara Bio, Otsu, Japan)로 반응하였다. PCR 반응은 C1000 Touch™ Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 pre-denaturation한 후, 95℃ 에서 45초, 57℃에서 45초, 72℃에서 1분으로 35 cycles로 수행하였고, final extention 과정은 72℃에서 10분간 반응시켰다. 증폭된 DNA 산물은 1.5% agarose gel에서 100 V로 전기영동한 후, Safe Gel Stain (Inclone, Seoul, Korea)로 염색하여 gel documentation system (Gel Doc™ XR + System, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에서 PCR증폭 산물을 1차적으로 확인하였다.
증폭된 DNA 단편의 분석
상기 실시예 3에서 분리된 초성위체를 함유하고 있는 PCR 증폭된 산물을 DNA Fragment Analyzer Automated CE System (Advanced Analytical Technologies, Ames, IA, USA)으로 분석하였다. 분석시약은 dsDNA 905 Reagent kit (Geneer, Daejeon, Korea)를 사용하였다. 분석된 서열을 기초로 하여 2개 이상의 반복 유닛(repeat unit)을 포함하고 있는 단편만을 선발하였다. 반복 유닛을 포함하는 부분을 기준으로 하여 초성위체를 증폭할 수 있는 양 방향의 프라이머를 디자인하였다.
SSR 마커의 선발
상기 실시예 4에서 디자인된 프라이머쌍 중에서 황기 계통에서 명확한 변이가 추정되는 99개 SSR마커를 우선선발 하였고, 이들 중 17개 SSR 마커에 대해 프라이머를 제작하였으며 그 결과, Am-gSSR1(서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머쌍), Am-gSSR2(서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머쌍), Am-gSSR3(서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머쌍), Am-gSSR4(서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머쌍), Am-gSSR5(서열번호 9와 10으로 표시되는 프라이머쌍), Am-gSSR6(서열번호 11과 12로 표시되는 프라이머쌍), Am-gSSR7(서열번호 13과 14로 표시되는 프라이머쌍), Am-gSSR8(서열번호 15와 16으로 표시되는 프라이머쌍), Am-gSSR9(서열번호 17과 18로 표시되는 프라이머쌍), Am-gSSR10(서열번호 19와 20으로 표시되는 프라이머쌍), Am-gSSR11(서열번호 21과 22로 표시되는 프라이머쌍), Am-gSSR12(서열번호 23과 24로 표시되는 프라이머쌍), Am-gSSR13(서열번호 25와 26으로 표시되는 프라이머쌍), Am-gSSR14(서열번호 27과 28로 표시되는 프라이머쌍), Am-gSSR15(서열번호 29와 30으로 표시되는 프라이머쌍), Am-gSSR16(서열번호 31과 32로 표시되는 프라이머쌍), Am-gSSR17(서열번호 33과 34로 표시되는 프라이머쌍)을 선별하였다(표 1 참조). 상기 17쌍의 프라이머에 의해 증폭된 PCR 단편의 각각의 크기는 다음 표 2와 같다.
SSR 번호 위치 개시 프라이머 종결 프라이머 크기(bp)
Am-gSSR1 8 226 168 350 184
Am-gSSR2 5 226 174 326 154
Am-gSSR3 6 226 136 329* 195
Am-gSSR4 7 196 144 340 198
Am-gSSR5 7 226 120 308 190
Am-gSSR6 5 226 111 305 196
Am-gSSR7 10 226 137 315 180
Am-gSSR8 7 226 167 357 192
Am-gSSR9 7 226 176 374 200
Am-gSSR10 5 226 158 309 153
Am-gSSR11 7 226 156 321 167
Am-gSSR12 7 226 157 355 200
Am-gSSR13 12 226 124 321 199
Am-gSSR14 14 226 131 319 190
Am-gSSR15 8 226 162 342 182
Am-gSSR16 6 226 145 325 182
Am-gSSR17 5 226 155 307 154
PCR을 이용한 DNA 증폭 및 황기의 감별.
국립원예특작과학원 인삼특작부 시험포장에서 재배중인 풍성, 아성과 지역수집종인 제천, 산청 및 해외수집종인 중국 길림의 황기를 1g을 취하여 액체질소로 급랭시켜 막자사발을 이용하여 분말상태가 되도록 마쇄한 후, DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)을 이용하여 제조사가 제시한 실험방법에 따라 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA) 기기를 이용하여 농도를 측정하였다. 각각의 DNA 최종농도는 멸균된 증류수를 이용하여 5 ng/μL로 조정하였다. 상기 길림, 산청, 제천 지역의 황기, 및 풍성 및 아성 품종의 각각 3개의 지역 및 2개 품종의 DNA를 5 pmol로 희석하여 DNA 10ng, 하기 표 1에 정리된 서열번호 1 내지 34의 SSR 프라이머 세트를 10ng을 넣어 20㎕의 PCR 반응 혼합물을 만든다. PCR 과정은 preheating 95℃180초, denaturation 95℃60초, annealing 52℃30초, extension 72℃60초, post extension 72℃300초, 35 cycle을 반복하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 DNA 산물은 1.5% agarose gel에서 100 V로 전기영동한 후, Safe Gel Stain (Inclone, Seoul, Korea)로 염색하여 gel documentation system (Gel Doc™XR + System, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에서 PCR증폭 산물을 확인하였다. 그 결과는 도 1과 같으며, 도 1의 결과를 하기 표 3으로 정리하였다. Am-gSSR 3, Am-gSSR 5, Am-gSSR 7, Am-gSSR 9, Am-gSSR 10, Am-gSSR 13, Am-gSSR 15, Am-gSSR 17은 동일한 크기의 밴드 사이즈를 보여 하기 품종의 간의 구별하지 못하였으므로, 표에 기재하지 않았다.
Figure 112018064151347-pat00001
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Specific SSR primer for discrimination of Astragalus membransis and uses thereof <130> 1064140 <160> 34 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Am-gSSR1 <400> 1 ccatcgcagt tggacaat 18 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Am-gSSR1 <400> 2 ggatttggtc tcagcagagt ag 22 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Am-gSSR2 <400> 3 ccctctatct ctagtcacat cgg 23 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Am-gSSR2 <400> 4 agaggattga aggtagagtg gg 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Am-gSSR3 <400> 5 ggtagccacc accgttagtt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Am-gSSR3 <400> 6 tgagtagaac tgcctttggg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Am-gSSR4 <400> 7 gcttggaaca caagcaatgg 20 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Am-gSSR4 <400> 8 gatgtaagtg ctgctgcca 19 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Am-gSSR5 <400> 9 attgtatacc agcacgcagc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Am-gSSR5 <400> 10 ccatggcaag agaagatgtc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Am-gSSR6 <400> 11 cggaagacga ccaatgtgta 20 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Am-gSSR6 <400> 12 ggagctcctc cacttgaata tc 22 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Am-gSSR7 <400> 13 gtagacaaac ccgcctcaat 20 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Am-gSSR7 <400> 14 ggtggacttg gtatgagaga ga 22 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Am-gSSR8 <400> 15 cacgttgctg ctcaatctgt 20 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Am-gSSR8 <400> 16 agttgcttgc gagctttg 18 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Am-gSSR9 <400> 17 accacttctc gactcatctc c 21 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Am-gSSR9 <400> 18 ccatagtcaa aagaggaggc tg 22 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Am-gSSR10 <400> 19 ctgctagaga aacccttgct tc 22 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Am-gSSR10 <400> 20 cctcaatcac aagtgccttc 20 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Am-gSSR11 <400> 21 gggttcagat ggctgaacta ac 22 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Am-gSSR11 <400> 22 agagaaggag ttccacgtgt c 21 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Am-gSSR12 <400> 23 gcaacaacca caactactga gg 22 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Am-gSSR12 <400> 24 aagccaaaac agggaacc 18 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Am-gSSR13 <400> 25 ccactattga caacatcgcc 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Am-gSSR13 <400> 26 gtggaaggac tttgaacctg 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Am-gSSR14 <400> 27 actagcacca acaggtctga 20 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Am-gSSR14 <400> 28 acctccgcca ctagttaaga ac 22 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Am-gSSR15 <400> 29 ggagcaggaa ttgtcagaga 20 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Am-gSSR15 <400> 30 acagtgtgtg agagtgggaa g 21 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Am-gSSR16 <400> 31 gcagagaaga aggatggaga ag 22 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Am-gSSR16 <400> 32 ctaacacgtt ctctcactcc ca 22 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Am-gSSR17 <400> 33 gtgtaacagc tgggggataa ag 22 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Am-gSSR17 <400> 34 gatggccatg tcgaaggta 19

Claims (24)

  1. 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 프라이머 세트; 서열번호 31 및 32의 프라이머 세트; 및 서열번호 33 및 34의 프라이머 세트;를 포함하는, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기 및 아성 황기 중에 길림 황기를 판별하기 위한 황기 판별용 SSR(simple sequence repeat) 프라이머 세트.
  2. 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 프라이머 세트; 서열번호 31 및 32의 프라이머 세트; 및 서열번호 33 및 34의 프라이머 세트;를 포함하는, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기 및 아성 황기 중에 산청 황기를 판별하기 위한 황기 판별용 SSR(simple sequence repeat) 프라이머 세트.
  3. 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 프라이머 세트; 서열번호 31 및 32의 프라이머 세트; 및 서열번호 33 및 34의 프라이머 세트;를 포함하는, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기 및 아성 황기 중에 제천 황기를 판별하기 위한 황기 판별용 SSR(simple sequence repeat) 프라이머 세트.
  4. 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 프라이머 세트; 서열번호 31 및 32의 프라이머 세트; 및 서열번호 33 및 34의 프라이머 세트;를 포함하는, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기 및 아성 황기 중에 풍성 황기를 판별하기 위한 황기 판별용 SSR(simple sequence repeat) 프라이머 세트.
  5. 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 프라이머 세트; 서열번호 31 및 32의 프라이머 세트; 및 서열번호 33 및 34의 프라이머 세트;를 포함하는, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기 및 아성 황기 중에 아성 황기를 판별하기 위한 황기 판별용 SSR(simple sequence repeat) 프라이머 세트.
  6. 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 프라이머 세트; 서열번호 31 및 32의 프라이머 세트; 및 서열번호 33 및 34의 프라이머 세트;를 포함하는, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기 및 아성 황기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 황기를 판별하기 위한 황기 판별용 SSR(simple sequence repeat) 프라이머 세트.
  7. 제 1항의 프라이머 세트를 포함하는, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기 및 아성 황기 중에 길림 황기를 판별하기 위한 황기 판별용 조성물.
  8. 제 2항의 프라이머 세트를 포함하는, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기 및 아성 황기 중에 산청 황기를 판별하기 위한 황기 판별용 조성물.
  9. 제 3항의 프라이머 세트를 포함하는, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기 및 아성 황기 중에 제천 황기를 판별하기 위한 황기 판별용 조성물.
  10. 제 4항의 프라이머 세트를 포함하는, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기 및 아성 황기 중에 풍성 황기를 판별하기 위한 황기 판별용 조성물.
  11. 제 5항의 프라이머 세트를 포함하는, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기 및 아성 황기 중에 아성 황기를 판별하기 위한 황기 판별용 조성물.
  12. 제 6항의 프라이머 세트를 포함하는, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기 및 아성 황기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 황기를 판별하기 위한 황기 판별용 조성물.
  13. 제 1항의 프라이머 세트를 포함하는, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기 및 아성 황기 중에 길림 황기를 판별하기 위한 황기 판별용 키트.
  14. 제 2항의 프라이머 세트를 포함하는, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기 및 아성 황기 중에 산청 황기를 판별하기 위한 황기 판별용 키트.
  15. 제 3항의 프라이머 세트를 포함하는, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기 및 아성 황기 중에 제천 황기를 판별하기 위한 황기 판별용 키트.
  16. 제 4항의 프라이머 세트를 포함하는, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기 및 아성 황기 중에 풍성 황기를 판별하기 위한 황기 판별용 키트.
  17. 제 5항의 프라이머 세트를 포함하는, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기 및 아성 황기 중에 아성 황기를 판별하기 위한 황기 판별용 키트.
  18. 제 6항의 프라이머 세트를 포함하는, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기 및 아성 황기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 황기를 판별하기 위한 황기 판별용 키트.
  19. 황기로부터 분리한 DNA에 대하여, 제 1항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR를 수행하는 단계를 포함하는 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기 및 아성 황기 중에 길림 황기를 구별하는 방법.
  20. 황기로부터 분리한 DNA에 대하여, 제 2항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR를 수행하는 단계를 포함하는 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기 및 아성 황기 중에 산청 황기를 구별하는 방법.
  21. 황기로부터 분리한 DNA에 대하여, 제 3항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR를 수행하는 단계를 포함하는 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기 및 아성 황기 중에 제천 황기를 구별하는 방법.
  22. 황기로부터 분리한 DNA에 대하여, 제 4항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR를 수행하는 단계를 포함하는 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기 및 아성 황기 중에 풍성 황기를 구별하는 방법.
  23. 황기로부터 분리한 DNA에 대하여, 제 5항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR를 수행하는 단계를 포함하는 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기 및 아성 황기 중에 아성 황기를 구별하는 방법.
  24. 황기로부터 분리한 DNA에 대하여, 제 6항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계를 포함하는, 길림 황기, 산청 황기, 제천 황기, 풍성 황기 및 아성 황기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 황기를 구별하는 방법.

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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN1965886B (zh) * 2005-11-14 2010-10-13 兰州大学 一种黄芪及其伪品的ssr分子标记鉴别方法
KR20140134869A (ko) * 2013-05-15 2014-11-25 인하대학교 산학협력단 한국산 황기의 마이크로새틀라이트 마커 및 이를 증폭하기 위한 프라이머 세트

Patent Citations (2)

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