KR101357497B1

KR101357497B1 - 맥문아재비 속에서 유래된 ｅｓｔ-ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101357497B1
Application number: KR1020110109942A
Authority: KR
Inventors: 박용진; 리강; 라원희; 박재완; 윤민영; 박춘근; 박충범; 권순욱
Original assignee: 공주대학교 산학협력단
Priority date: 2011-10-26
Filing date: 2011-10-26
Publication date: 2014-02-03
Also published as: KR20130045618A

Abstract

본 발명은 맥문동에서 분리한 EST-SSR 프라이머 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로 서열번호 1 내지 44로 이루어진 군에서 선택되는 2 개의 핵산서열을 갖는 EST-SSR 프리이머쌍 및 상기 EST-SSR 프라이머쌍을 포함하는 맥문동의 품종을 판별하기 위한 키트 및 상기 EST-SSR 프라이머쌍을 이용하여 맥문동의 품종을 판별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 제공되는 EST-SSR 프라이머쌍은 맥문동의 DNA 다형성을 효과적으로 검출할 수 있으며, 맥문동의 DNA 프로파일을 작성하는데 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 이를 통해 맥문동의 유전자원을 효율적으로 평가함으로써, 신규 유전자원 도입시 기존 보유자원과의 중복성 분석 및 신규성 확립을 효과적으로 수행할 수 있다.

Description

맥문아재비 속에서 유래된 ＥＳＴ-ＳＳＲ 프라이머 및 이의 용도{EST-SSR primer derived from Ophiopogon japonicus and use thereof}

본 발명은 맥문아재비 속에서 분리한 EST-SSR 프라이머 및 이의 용도에 관한 것이다.

육종에 이용되고 있는 대부분의 주요 작물 및 소재배 작물에서 해마다 많은 양의 유전자원이 수집되고 있다. 그러나, 이에 반해 유전자원에 대한 평가는 충분히 이루어지지 않고 있는 실정이다. 수집된 유전자원의 종간 및 아종간 품종의 신속한 판별은 정확한 유전자원의 관리 및 보호를 위하여 매우 중요하다. 또한, 품종의 판별과 함께 유전자원의 유용 형질 탐색과 분류, 그리고 유연관계의 규명은 유전자원의 보존이나 신품종의 창출 및 작물의 개량에 있어서 매우 중요하다.

최근 분자생물학의 급속한 발전으로 핵산(DNA) 수준에서 유전자원의 다양성(bio-diversity) 연구를 가능케 하는 핵산 지문 분석 방법 및 다양한 DNA 마커들이 개발되었다. 이를 통해 유용 형질 탐색, 생물의 종 판별, 품종 분류·동정 및 집단 개체군의 유연관계 분석을 외부환경 등에 대하여 거의 영향을 받지 않고 간단하고 신속하게 수행할 수 있게 되었다. 지금까지 개발된 PCR(polymerase chain reaction)을 이용한 지문분석법(fingerprinting)에는 RAPD(randomly amplified polymorphic DNAs) 방법, AFLP(amplified fragment length polymorphic DNA) 방법, SSR(simple sequence repeat) 방법 등이 있다. 상기 방법 중 RAPD 방법은 비특이적 PCR 산물이 증폭되므로 재현성이 떨어지는 단점이 있고, AFLP 방법은 높은 DNA 다형성 검출로 각광받고 있지만 재현성이 떨어지는 밴드의 출현과 분석이 복잡하다는 단점이 있다. 이에 반해, SSR 방법은 DNA 반복 배열인 초위성체(microsatellite) 영역의 염기 배열 정보를 근거로 PCR 프라이머를 제작하여 이용하는 방법으로서 높은 재현성을 가지는 장점으로 인하여 생물종의 동정에 자주 사용되고 있다. 특히 SSR 방법은 외부 환경의 영향을 전혀 받지 않는다는 장점이 있다. 이와 같은 SSR 방법의 우수성으로 인해 여러 주요 작물 및 소면적재배 작물에서 SSR 마커를 개발하려는 연구가 활발히 진행 중에 있다.

이에 본 발명자들은 맥문동의 유전자원을 효율적으로 평가할 수 있는 SSR 마커를 개발하기 위하여 연구를 거듭하던 중, 맥문동에서 다형성 변이를 많이 나타내는 SSR 프라이머쌍을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

국내 공개번호 10-2011-0019265호

본 발명은 EST-SSR 프라이머쌍을 이용하여 맥문동의 유전적 다양성과 유연관계를 분석하였고, 맥문동의 품종에 대한 유전자형을 분석하여 품종 판별에 대한 가능성을 검토하고, 효율적인 품종 판별법을 제시하고자 한다.

서열번호 1 내지 44에서 선택되는 2개의 핵산서열로 이루어진 22개 EST-SSR 프라이머쌍을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 EST-SSR 프라이머쌍을 포함하는 맥문동속과 맥문아재비 속의 품종을 판별하기 위한 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 EST-SSR 프라이머쌍을 이용하여 맥문동속과 맥문아재비 속의 품종을 판별하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 제공되는 EST-SSR 프라이머쌍은 맥문동의 DNA 다형성을 효과적으로 검출할 수 있으며, 맥문동의 DNA 프로파일을 작성하는데 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 이를 통해 맥문동의 유전자원을 효율적으로 평가함으로써, 신규 유전자원 도입 시 기존 보유자원과의 중복성 분석 및 신규성 확립을 효과적으로 수행할 수 있다.

도 1은 UPGMA 계통수는 22 EST-SSR 마커에 기초한 공유 대립인자의 거리를 사용하여 68 accessions 사이의 유전적 관계를 보여준다. Group I 및 II는 각각 Liriope 및 Ophiopogon를 나타낸다.
도 2는 세 그룹(K=3)의 진정한 K값을 탐지하기 위한 사용된 모델값 가진 ΔK의 값을 나타낸다.
도 3은 혼합물 모델을 사용하여 STRUCTURE 2.2로 산출된 22 EST-SSR 마커에 기초한 68 accessions의 유전자 구성의 막대 그래프이다. 각각의 패널의 그룹은 K = 3 모델 하에 주요 할당에 기초한 컬러에 의해서 대표된다. 표 1에서 언급된 것처럼, 숫자는 샘플 accessions을 참조한다.

본 발명은 서열번호 1 내지 44에서 선택되는 2개의 핵산서열로 이루어진 22개 EST-SSR 프라이머쌍을 제공한다.

상기 EST-SSR 프라이머쌍은 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 5 및 6으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 9 및 10으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 13 및 14로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 15 및 16으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 17 및 18로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 19 및 20으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 21 및 22로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 23 및 24로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 25 및 26으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 27 및 28로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 29 및 30으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 31 및 32로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 33 및 34로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 35 및 36으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 37 및 38로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 39 및 40으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 41 및 42로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 43 및 44로 표시되는 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

또한, 상기 EST-SSR 프라이머쌍은 맥문동으로부터 유래된 것 일 수 있다. 상기 맥문동은 백합과의 산과 들의 그늘진 곳에서 자라는 여러해살이풀이다. 백합과의 맥문동속은 동아시아에 수 종이 있으며 우리나라에는 맥문동과 개맥문동(좀맥문동), 실맥문동이 있다. 맥문동은 잎맥이 11~15개인 점이 개맥문동과는 다르며, 잎 사이에서 자란 꽃줄기 윗부분의 술 모양의 꽃차례에 보라색 꽃이 촘촘하게 핀다. 개맥문동은 맥문동에 비해 잎의 너비가 좁고 꽃 전체가 작으며 잎맥이 7~11개이다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

또한, 본 발명은 상기EST-SSR 프라이머쌍; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 맥문동의 품종을 판별하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

또한, 본 발명은 (a)맥문동으로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; (b)추출된 게놈 DNA를 주형으로 상기 EST-SSR 프라이머쌍을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (c)상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 맥문동의 품종을 판별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 맥문동 시료에서 게놈(genomic) DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 EST-SSR 프라이머쌍을 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지 될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지 될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 프라이머쌍은 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABI Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구를 이용하여 측정할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 >

1. 재료 및 방법

(1) 식물 재료와 DNA 추출

전체적으로, 4종 맥문동(Liriope platyphylla, 52), 개맥문동(Liriope spicata, 9), 소엽맥문동(Ophiopogon japonicus, 6) 및 맥문아재비(Ophiopogon jaburan, 1)을 대표하는 68 수집종(accessions)을 얻었다. 두 개의 개맥문동 accessions(no. 67, 68)은 사천, 절강, 중국으로부터 얻었으며, 그 외 재료들은 농촌진흥청(RDA)에서 얻었다.

DNA를 DNA 추출 키트(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 신선한 잎으로부터 추출했다. 추출된 DNA의 순도와 농도는 NanoDrop ND-1000(NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE, USA) 를 이용하여 확인하였고, 최종 DNA 농도는 20 ng/μL로 만들었다.

(2) SSRs 탐색 및 프라이머 제작 ( Primer design )

국립생물정보센터(NCBI, (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbest/))에서 EST 데이터베이스의 ENTREZ 검색 도구로부터 Ophiopogon japonicus EST 염기서열을 얻었다. 전체적으로, 두 개의 cDNA libraries로부터 545개의 사용 가능한 ESTs을 획득했다. SSRIT (http://www.gramene.org/db/markers/ssrtool)을 사용하여 SSRs를 탐색하였다.

Primer 3 software(Rozen and Skaletsky, 2000)을 사용하여 프라이머들을 제작하였다. 매개변수들은 다음과 같다: 프라이머 길이는 18-28 bases 범위이며, 최적에서 20 bases이고, PCR에 의한 DNA 단편의 길이는 100-400 bp 범위, 어닐링 온도는 50°C-60°C 및 GC 함량은 40%-70% 범위이며, 최적으로는 50%로 설정하였다.

(3) SSR 분석

PCR 증폭은 형광물질 6-FAM, NED, VIC 또는 PET 중의 하나로 표지된 universal M13 올리고 뉴클레오티드(5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′)를 포함하는 three-primer 시스템(Schuelke, 2000)을 사용했다. 주형 DNA 50 ng, M13-tailed forward primer 0.2 μM, reverse primer 0.6 μM, 형광 M13 primer 0.5 μM, dATP, dGTP, dCTP, dTTP를 각각 200 μM, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, 1.5 mM MgCl2, 0.25 unit Taq DNA polymerase를 사용하였다. 형광물질로는 6-FAM, HEX, NED를 사용하였으며, PCR 반응은 PTC-200 thermocycler (MJ Research, USA)를 이용하였다. 유전자형을 분석하기 위하여 PCR 산물 1.2㎕, internal size standard 500 ROX (ABI, Foster city, CA) 0.3㎕, Hidi formamid (ABI, Foster City, CA) 9㎕을 첨가 후 ABI 3130xl Genetic Analyzer(ABI, Foster City, CA)를 이용하여 DNA, 1×PCR 버퍼, 0.2 mM 의 각각의 dNTP, 1U Taq DNA 폴리머라제, 8.0 pmol의 각각의 역방향 및 형광 표지된 M13 프라이머 및 2.0 pmol의 5′-end 부위에 M13 꼬리를 갖는 정방향 프라이머를 함유하고 있는 총 20 μL의 부피 안에서 실행되었다. 증폭 반응을 위한 PCR 조건은 다음과 같다: 94°C에서 3분, 1 단계(94°C에서 30초, 60°C에서 40초, 72°C에서 40초)를 30회 반복하고, 2 단계(94°C에서 30초, 56°C에서 40초, 72°C에서 40초)를 10회 반복하고, 최종 72°C에서 5분간 연장반응을 수행하였다. 샘플들은 자동화된 DNA Sequencer 3500 Genetic Analyzer(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)에서 실행되었다. 산출된 파일들을 GeneMapper 4.1 software (Applied Biosystems)을 사용하여 분석하였다. 각 각의 유전자 좌를 위해서 Bins을 한정하였고, 유전자형은 수동으로 기록되었다. Accessions은 동일 대립인자를 위해 가장 큰 피크에 해당하는 각 각의 유전자 좌에서 기록되었다(Duminil et al., 2009).

다형성 부위를 포함하는 22개 SSR-ESTs을 사용하여 NCBI 데이터베이스 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 의 BLASTS 검색을 실행하였다.

(4) 데이터 및 통계

각 유전자 부분의 변이성은 POPGENE version 1.31을 사용하여 대립인자의 수, 이형접합성 관찰치(observed heterozygosity), 이형접합성 기대치(expected heterozygosity) 및 각각 수집자원(accessions) 사이의 유전적 거리 등을 측정되었다. 총 대립인자의 수, 주 대립인자의 빈도(Major allele frequency), 유전자의 다양성(Gene Diversity), 및 다형성 정보 (Polymorphic Information Content)을 측정하기 위해 PowerMarker version 3.25 (Liu and Muse 2005)를 사용하였다. UPGMA 알고리즘은 PowerMarker에 포함된 MEGA4 software(Tamura et al., 2007)을 사용하여 distance matrix로부터 unrooted phylogram을 그리기 위해 사용되었다.

수집종의 집단 구조 분석은 model-based clustering algorism(STRUCTRE ver. 2.22)를 활용하여 분석하였다. 1) 집단 (K) 은 2에서 10까지 분석하였으며, 각각의 K에 대하여 200,000 interaction과 100,000 burn-in을 실시 후 각각의 K에 대한 log likelyhood 값을 분석 후 최고 log likelyhood 값을 나타내는 집단을 결정하고, 2) 분석된 각각의 집단에 대한 log likelyhood 값이 최고 값을 나타내지 않고 집단이 증가하면 log likelyhood 값도 함께 증가 할 경우, Evanno 등(2005)이 제안한 K를 분석하여 정확한 집단을 결정하였다.

2. 결과

(1) O. japonicus 내의 SSRs 의 분포 및 빈도

총 545개 ESTs 중에서 SSRIT 프로그램으로 사용하여 89개 SSRs를 포함하는 73 SSR-ESTs를 분리했다. 이는 SSRs을 함유한 시퀀스들의 13.75%에 해당된다. 분석된 O. japonicus cDNA 라이브러리 내에서 5.21kb 마다 평균 1개의 SSR을 보였고, 7.27 ESTs에 대해 평균적으로 하나의 SSR을 나타낸다. 89 SSR-ESTs 중에서 12(13.5%)는 하나 이상의 SSR를 포함하고 있었고, SSRs의 평균 길이는 18.0bp였다. 이하, 표 1은 본 실험에서 사용된 68 수집종(accessions)에 대한 정보이다. 표 2는 소엽맥문동의 ESTs 내의 유니진 시퀀스 및 SSR 빈도의 요약에 관한 것이다.

No.	*IT No.	Species	Collection region
1	YCC13	Liriope Platyphylla	National Institute of Horticultural and Herbal Science
2	YCC15	Liriope Platyphylla	National Institute of Horticultural and Herbal Science
3	YCC23	Liriope Platyphylla	National Institute of Horticultural and Herbal Science
4	YCC22	Liriope Platyphylla	National Institute of Horticultural and Herbal Science
5	YCC8	Liriope Platyphylla	National Institute of Horticultural and Herbal Science
6	YCC16	Liriope Platyphylla	National Institute of Horticultural and Herbal Science
7	YCC36	Liriope Platyphylla	National Institute of Horticultural and Herbal Science
8	KULP008	Liriope Platyphylla	National Institute of Horticultural and Herbal Science
9	YCC25	Liriope Platyphylla	National Institute of Horticultural and Herbal Science
10	KULP010	Liriope Platyphylla	National Institute of Horticultural and Herbal Science
11	YCC30	Liriope Platyphylla	National Institute of Horticultural and Herbal Science
12	YCC29	Liriope Platyphylla	National Institute of Horticultural and Herbal Science
13	YCC31	Liriope Platyphylla	National Institute of Horticultural and Herbal Science
14	YCC34	Liriope Platyphylla	National Institute of Horticultural and Herbal Science
15	YCC10	Liriope Platyphylla	National Institute of Horticultural and Herbal Science
16	YCC28	Liriope Platyphylla	National Institute of Horticultural and Herbal Science
17	KULP018	Liriope Spicata	National Institute of Horticultural and Herbal Science
18	YCC32	Liriope Platyphylla	National Institute of Horticultural and Herbal Science
19	YCC28	Liriope Platyphylla	National Institute of Horticultural and Herbal Science
20	YCC21	Liriope Platyphylla	National Institute of Horticultural and Herbal Science
21	YCC12	Liriope Platyphylla	National Institute of Horticultural and Herbal Science
22	KULP023	Ophiopogon Japonicus	National Institute of Horticultural and Herbal Science
23	KULP024	Liriope Platyphylla	National Institute of Horticultural and Herbal Science
24	YCC19	Liriope Platyphylla	National Institute of Horticultural and Herbal Science
25	YCC27	Liriope Platyphylla	National Institute of Horticultural and Herbal Science
26	YCC35	Liriope Platyphylla	National Institute of Horticultural and Herbal Science
27	KULP028	Liriope Platyphylla	National Institute of Horticultural and Herbal Science
28	KULP029	Liriope Platyphylla	National Institute of Horticultural and Herbal Science
29	KULP030	Liriope Platyphylla	National Institute of Horticultural and Herbal Science
30	YCC7	Liriope Platyphylla	National Institute of Horticultural and Herbal Science
31	YCC24	Liriope Platyphylla	National Institute of Horticultural and Herbal Science
32	YCC14	Liriope Platyphylla	National Institute of Horticultural and Herbal Science
33	YCC33	Liriope Platyphylla	National Institute of Horticultural and Herbal Science
34	YCC11	Liriope Platyphylla	National Institute of Horticultural and Herbal Science
35	KULP036	Liriope Platyphylla	Jindo, Jeollanam-do
36	KULP037	Liriope Platyphylla	Jangseong, Jeollanam-do
37	KULP038	Ophiopogon Japonicus	Jindo , Jeollanam-do
38	KULP039	Liriope Spicata	Jindo , Jeollanam-do
39	KULP040	Ophiopogon Japonicus	Jindo , Jeollanam-do
40	KULP041	Liriope Platyphylla	Udo, Jeju
41	KULP042	Liriope Platyphylla	Jangsu-dong, Namdong-gu, Incheon
42	KULP043	Liriope Spicata	Ijak Island, Ongjin, Incheon
43	KULP044	Liriope Spicata	uninhabited Island, Ongjin, Incheon
44	KULP045	Liriope Spicata	uninhabited Island, Ongjin, Incheon
45	KULP046	Liriope Platyphylla	Sangju, Gyeongsangbuk-do
46	KULP047	Liriope Platyphylla	Gyeyang-gu, Incheon
47	KULP048	Liriope Platyphylla	uninhabited Island, Ongjin, Incheon
48	KULP049	Liriope Platyphylla	Deokjeok Island, Ongjin, Incheon
49	KULP050	Liriope Platyphylla	Wonju, Kangwon-do
50	KULP051	Liriope Platyphylla	Taebaek, Kangwon-do
51	KULP052	Liriope Platyphylla	Mt. Daemo, Gangnam-gu, Seoul
52	KULP053	Liriope Spicata	Mt. Daemo, Gangnam-gu, Seoul
53	KULP054	Liriope Spicata	Deokjeok Island, Ongjin, Incheon
54	KULP055	Liriope Platyphylla	Gangwha Island, Incheon
55	KULP056	Liriope Platyphylla	Sangam-dong, Mapo-gu, Seoul
56	KULP057	Ophiopogon Japonicus	Bogil Island, Wando, Jeollanam-do
57	KULP058	Liriope Platyphylla	Bogil Island, Wando, Jeollanam-do
58	KULP059	Liriope Platyphylla	Nowha Island, Wando, Jeollanam-do
59	KULP060	Liriope Platyphylla	Gimpo, GyeongGi-do
60	KULP061	Ophiopogon Japonicus	Nowha Island, Wando, Jeollanam-do
61	KULP062	Ophiopogon Jaburan	Seogwipo, Jeju-do
62	KULP063	Ophiopogon Japonicus	Anmyon Island, Dangjin, Chungcheongnam-do
63	KULP064	Liriope Platyphylla	Bucheon, GyeongGi-do
64	KULP065	Liriope Platyphylla	Gil-dong, Gangdong-gu, Seoul
65	KULP066	Liriope Platyphylla	Geoje, Gyeongsangnam-do
66	KULP067	Liriope Platyphylla	Seoul
67	CH68	Liriope Spicata	Sichuan, China
68	CH69	Liriope Spicata	Zhejiang, China

* IT No: Introduction number of National Institute of Horticulture & Herbal Science, Rural Development Administration (RDA) in Republic of Korea.

89 SSRs는 56.2%의 di-nucleotide, 41.6%의 tri-nucleotide, 1.1%의 tetra-nucleotide 및 1.1%의 hexa-nucleotide 로 구성되어 있었다. AG/GA motif는 di-nucleotide 형에서 가장 흔한 것으로서, 42%를 차지하고, 다음으로 TC/CT (34%), AT/TA (12%), GT/TG (10%), 및 CG/GC (2%) 순서이였다. 그러나 AC/CA 반복체 모티프는 발견되지 않았다. Tri-nucleotide 에서는 TGC/GCT/CTG motif 가 15.38%의 빈도를 보였고, CAG/AGC/GCA (12.82%), 및 CCT/CTC/TCC (10.26%)가 뒤따랐다. EST-SSRs 내에서 다른 반복체에 관한 자세한 내용은 표 3에 나타내었다. 하기 표 3은 ESTs 내에서 SSRs의 빈도 및 분포에 관한 것이다.

(2) EST - SSRs 의 다형성 및 종/속 간 전이성

Ophiopogon japonicus에서 유래된 EST-SSRs 정보에서 74개 프라이머를 설계하였고, 5 accessions은 프라이머들의 증폭 및 전이성을 검사하였다. 74개 프라이머 중에서 67(90.5%)는 증폭되었으나, 22개(32.8%) EST-SSRs만이 68 수집종(accessions)에서 예상된 사이즈 범위 내에서 다형성을 갖는 DNA 단편을 나타내었다. 22 EST-SSR 마커의 명칭, 순방향 및 역방향 프라이머의 염기서열정보, motif 종류, 어닐링 온도 및 예상 PCR product의 크기들은 표 4에 나타내었다.

EST-SSRs의 일반적인 기능 분류는 표 4에 나타냈다. NCBI 데이터베이스에 대해 22 SSR-ESTs의 BLASTX에 기초한 결과들은 세포 수송 및 다른 생물학적 프로세스에 관련된 알려진 유전자와 일치하는 다형성 EST의 7개로 나타났고, 15개는 알려지지 않았거나 가상 단백질이었다. 하기 표 4는 68 Liriope 및 Ophiopogon accessions에 걸친 22 EST-SSR 마커의 정보에 관한 요약이다.

(3) 68 accessions 내에서 유전적 다양성 평가 및 개체 구조

새롭게 개발된 EST-SSRs의 유용성을 평가 및 한국과 중국에서 수집된 68 accessions 사이의 유전적 다양성을 연구하기 위해서 PowerMarker V3.25와 MEGA 4.0 소프트웨어를 사용하여 UPGMA tree를 작성하였다.

68개 수집종에 대해 22개 EST-SSRs를 분석한 결과, 총 68개 대립유전자가 탐색되었는데 각 각의 SSR에서 2~5개 범위였고, 평균 대립유전자 수는 3.09개 였다. 마커 별 유전적 다양성은 0.10 (LS008) 에서 0.66 (LS011)의 범위로 나타났고, 평균 0.46 수준이었다. 이형접합 기대치 및 다형성 정보(polymorphism information content, PIC)의 값은 각각0.03~1.0 및 0.09~0.59 범위로 조사되었고, 평균은 각 각 0.56 및 0.38이였다(표 4). 한국 및 중국으로부터 수집한 Liriope 및 Ophiopogon의 유전적 다양성 및 PIC는 표 5에 나타내었다. 22 EST-SSRs에 의해 Liriope 종에서 67 대립인자를 보였고, 마커 당 대립유전자의 수는 3.05였으나, Ophiopogon종에서는 마커 당 평균 2.32개의 대립인자를 보였고, 총 51 대립인자를 포함하였다. Ophiopogon종내의 유전적 다양성(0.49), 이형접합성 기대치(0.69) 및 PIC(0.39)로 나타나 Liriope 종의 값(각각0.44, 0.55, 0.36) 보다 높았고, 이는 Ophiopogon종이 Liriope종보다 더 높은 유전적 변이의 레벨을 의미한다. 각 각의 SSR 유전자 좌에 대한 한국산과 중국산의 평균의 유전적 다양성 및 PIC는 또한 조사되었는데, 이는 각 각 0.46, 0.27, 및 0.38, 0.20나타났다(표 5). 하기 표 5는 다른 속 및 나라들의 대립인자의 평균 수, 유전적 다양성, 주 대립유전자의 빈도, 이형접합 기대값 및 PIC 이다.

유전적 유사도 계수는 0.0400 에서 0.5882 범위에서 평균 0.2340로 나타났다(도 1). 68 accessions은UPGMA 계통도 내에서 크게 2 개 그룹으로 분류되었다. 그룹 I은 62 accessions을 포함하고, 두 개의 하위 그룹으로 나뉘었다. 하위 그릅 G I-1은 54개 L. platyphylla, 2 개의L. spicata (52번, 53번), 및 한 개의 O. japonicus (37번)로부터 57개 수집종으로 구성되었고, G I-2는 5개의 accessions(L. spicata) 로 구성되어 있다. 그룹 II는 6개의 accessions을 포함하고, 두 개의 하위 그룹으로 나뉘었다. G II-1은 두 개의 O. japonicus accessions (60번, 62번)을 포함했고, 세 개의 O. japonicus accessions (22번, 39번, 56번)과 1 개의 O. jaburan (61번)는 G II-2를 형성했다. 32번 (L. platyphylla) 과 34번 (L. platyphylla) 수집종을 제외한 모든 수집종에 대해 22 EST-SSRs 마커를 사용함으로써 각각 구별이 될 수 있었다.

수집 집단의 구조 분석을 위하여 STRUCTURE 프로그램을 사용하였다. 정확한 집단(K)을 결정하기 위하여 K의 범위를 2에서 10으로 하여 각 각의 log likelyhood 값을 분석 조사한 결과 명확한 구분이 되지 않아, ΔK를 분석한 결과, 68 accessions에 있어서 K = 3일 때 가장 높은 ΔK값을 보였다(도 2). K = 3에서, 모든 68 accessions이 75% 확률로 세 개의 그룹으로 나뉘었고, 이는 유전적 거리에 의한 분류(도 1)와 일치하였다(도 3).

도 3에서 보듯이, accessions의 대부분은 세 개의 하부 개체군 중에서 하나로 명확하게 분류되었다. S1은 1개의 O. japonicus, 5개의 L. spicata 및 31개의 L. platyphylla을 포함한 37개 accessions으로 구성되었고, S2는 주로 L. platyphylla (23개) 및 L. spicata (1개)을 포함하여 24 accessions로 구성되었다. S3은 모두Ophiopogon를 포함하는 것으로 6개의 accessions로 구성되었다.

두 개의 accessions(67, 68)은 중국으로부터 수집하였고, 농촌 진흥청 국립원예특작과학원으로부터 수집된 34개를 포함한 66개 accessions을 한국에서 수집하였다. 국립원예특작과학원으로부터 수집된 대다수의 accessions은 S1 및 S2 그룹에 속했다.

S1(37개) 중에서 22개는 국립원예특작과학원으로부터 연구소부터, 3 accessions는 전라남도로부터, 4 accessions는 서울로부터, 3 accessions는 인천으로부터, 2 accessions는 중국으로부터 수집되었고, 나머지 3 accessions 는 각 각 제주, 강원 및 경남지방으로부터 수집되었다. S2는 국립원예특작과학원으로부터 11 accessions을, 5 accessions는 인천으로부터, 3 accessions는 전라남도, 2 accessions 경기도로부터, 3 accessions는 각 각 경상, 서울 강원 지방에서 수집된 것을 포함하였다. 남은 S3은 1 accession는 국립원예특작과학원으로부터, 3 accessions는 전라남도로부터 나머지 2는 제주 및 충청남도 지역으로부터 수집되었다. 특히 L. platyphylla 와 L. spicat 두 개의 종은 유전적으로 밀접하게 관련되어 있고, Ophiopogon유전적 거리가 있음을 나타내었다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 5 및 6으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 9 및 10으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 13 및 14로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 15 및 16으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 17 및 18로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 19 및 20으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 21 및 22로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 23 및 24로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 25 및 26으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 27 및 28로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 29 및 30으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 31 및 32로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 33 및 34로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 35 및 36으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 37 및 38로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 39 및 40으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 41 및 42로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 43 및 44로 표시되는 프라이머쌍; 으로 이루어진 22개의 맥문동속 및 맥문아재비속 판별용 EST-SSR 프라이머쌍.
제1항에 있어서, 상기 프라이머쌍은 Ophiopogon japonicus로부터 유래된 것을 특징으로 하는 맥문동속 및 맥문아재비속 판별용 EST-SSR 프라이머쌍.
제1항에 따른 22개의 맥문동속 및 맥문아재비속 판별용 EST-SSR 프라이머쌍; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 맥문동속과 맥문아재비 속의 품종을 판별하기 위한 키트.
제 3항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
(a)맥문동으로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
(b)추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항에 따른 22개의 맥문동속 및 맥문아재비속 판별용 EST-SSR 프라이머쌍을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
(c)상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 맥문동속과 맥문아재비 속의 품종을 판별하는 방법
제 5항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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