KR101912194B1 - 더덕과 잔대 구별을 위한 분자마커와 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 더덕과 잔대 구별을 위한 분자마커와 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 엽록체 서열 기반의 InDel 분자마커 및 상기 분자마커 증폭용 프라이머 세트는 더덕과 잔대를 간단하고 신속하게 구별할 수 있으므로, 더덕과 잔대가 혼용되는 것을 효과적으로 방지할 수 있을 것으로 사료된다.

Description

더덕과 잔대 구별을 위한 분자마커와 프라이머 세트 및 이의 용도{Molecular marker and primer set for discriminating Codonopsis lanceolata and Adenophora triphylla and uses thereof}

본 발명은 더덕과 잔대 구별을 위한 분자마커, 상기 분자마커를 증폭하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.

최근 분자생물학의 급속한 발전으로 DNA 수준에서 유전자원의 다양성(bio-diversity) 연구를 가능케 하는 핵산 지문 분석 방법 및 다양한 DNA 마커들이 개발되었다. 이를 통해 유용 형질의 탐색, 생물의 종 판별, 품종 분류·동정 및 집단 개체군의 유연관계 분석 등을 간단하고 신속하게 수행할 수 있게 되었다. 지금까지 개발된 PCR(polymerase chain reaction)을 이용한 지문분석법(fingerprinting)에는 RAPD(randomly amplified polymorphic DNAs) 방법, AFLP(amplified fragment length polymorphic DNA) 방법, SSR(simple sequence repeat) 방법 등이 있다. 상기 방법 중 RAPD 방법은 비특이적 PCR 산물이 증폭되므로 재현성이 떨어지는 단점이 있고, AFLP 방법은 높은 DNA 다형성(polymorphism) 검출로 각광을 받고 있지만 재현성이 떨어지는 밴드의 출현과 분석이 복잡하며, SSR 방법은 DNA 반복 배열인 초위성체(microsatellite) 영역의 염기배열 정보를 근거로 PCR 프라이머를 제작하여 개체 내의 초위성체를 분석하는 방법으로, 상기 단순염기서열의 반복수는 품종 간 또는 개체 간에 다르게 때문에 이 부분을 PCR 반응으로 증폭하였을 때 다형화 현상이 나타날 수 있으나, 고밀도 유전자지도 제작에는 충분하지 않다는 단점이 있다.

이에 반해 InDel(insertion/deletion) 마커는 PCR 반응으로 증폭하였을 때 다형화 현상이 나타나게 하는 장점을 유지하면서 고밀도 유전자지도 제작에는 충분하지 않는 SSR 마커의 단점을 보완하는 것으로, 특정 위치에 있는 DNA의 염기서열 분석을 통해 품종간 염기서열의 삽입 또는 결실을 기반으로 PCR 프라이머를 제작하는 방법이다.

식물의 경우는 핵, 미토콘드리아, 엽록체 게놈 등 3개의 게놈을 가지고 있다. 식물의 유전정보의 대다수는 핵 게놈에 존재하지만 게놈의 크기가 크고, 많은 인트론(intron)과 엑손(exon)으로 구성되어 있어, 특정 유전자의 염기 서열을 유전체 DNA(genomic DNA)로부터 분석하여 식물종의 보존이나 식별에 이용하는데는 제한적이며, 핵 리보솜 DNA(nuclear ribosomal DNA, nrDNA)의 ITS(internal transcribed spacer) 부위, 알코올탈수소효소(alcoholdehydrogenase)의 특정 인트론 부위 등이 이용된다. 식물 미토콘드리아 게놈의 경우 보통 400kb∼4,000kb 크기로, 동물 미토콘드리아와는 달리 크기가 크고 구조적으로 매우 불안정하며 염기서열이 매우 보존적이기 때문에 속, 종 수준 또는 그 이하의 분류군의 계통관계나 식별에 이용하는 것은 거의 의미가 없다.

반면에 식물 엽록체는 기원(origin)이나 진화(evolution)와 같은 엽록체 자체 연구뿐만 아니라, 유전학적인 연구에서도 매우 중요시되어왔다. 엽록체 게놈의 크기는 160Kb 내외이고 구조적으로 안정하며, 염기서열의 변이가 큰 비암호와 영역(non coding region)은 고유종의 식별, 아종 및 변종의 식별, 유전적 변이의 비교 분석에도 유용성이 보고되고 있다. 엽록체 게놈에 존재하는 120여개의 유전자 중 84개의 유전자가 단백질로 전사되는데 유전자에 따라서 진화속도가 크게 다르다. 어떤 보존적인 유전자는 고등 분류군의 계통에만 이용될 수 있으나 빨리 진화하는 유전자의 염기서열은 근연속이나 속내의 뚜렷한 종간의 유연관계를 논의하는데도 이용될 수 있다. 따라서 한국 특산속 식물의 타당성, 식별, 보존 전략을 세우는데 엽록체 게놈의 염기서열은 광범위하게 활용이 가능하다.

잔대(Adenophora triphylla)는 초롱꽃과(Campanulaceae)에 속하는 다년생 초본류 자생식물로서, 이른 봄에 나오는 어린 싹은 식용으로 이용되는 대표적인 산나물로 '딱주'라고 알려져 있지만, 잔대는 주로 뿌리가 전통적인 생약재 및 식품으로 활용되고 있다. 뿌리는 '사삼'이라 하여 인삼과 비슷한 약효가 있는 것으로 알려져 있으며, 한방에서는 거담, 진해, 건위, 및 강장제 등의 약재로 이용된다.

더덕(Codonopsis lanceolata)은 도라지과(Companulaceae)에 속하는 다년생의 쌍자엽 식물로, 한국, 일본, 중국 및 러시아 극동지방 등 습기가 있는 초지, 숲 또는 계곡에 자생하는 식물이다. 더덕은 사삼 또는 백삼이라 불리며, 생약의 사삼은 건조된 뿌리를 칭한다. 건조된 뿌리에는 폴리아세틸렌(polyacetylene), 페닐프로파노이드(phenylpropanoid), 알칼로이드(alkaloid), 트리테르페노이드 (triterpenoid) 또는 다당류 등을 많이 함유하고 있으며, 특히 다량으로 함유되어 있는 사포닌(saponin)은 기침을 멎게 하고 가래를 억제하는 효과, 기관지염, 편도선염, 인후염 등 호흡기질환에 효능이 있다.

하지만, 더덕의 뿌리는 잔대의 뿌리와 매우 흡사하고 '사삼’이라는 약재 명에도 혼동이 있어 원료의 횬용이 문제점으로 야기되고 있다. 따라서 더덕과 잔대를 쉽고 간단하게 구별할 수 있는 방법의 개발이 절실히 필요하나 아직까지 그에 대한 연구가 미미한 실정이다.

이에 본 발명자들은 더덕 및 잔대의 엽록체 서열에 기반한 InDel 분자마커를 개발하였고, 상기 분자마커를 증폭할 수 있는 프라이머를 제작하여 더덕과 잔대를 구별할 수 있음을 확인하였다.

한편, 한국등록특허 제1752658호에는 '더덕 품종 구별을 위한 SSR 분자마커 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2017-0010226호에는 '엽록체 특이적 INDEL 마커를 활용한 근연야생종 감자 및 재배종 감자의 판별 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 더덕과 잔대 구별을 위한 분자마커와 프라이머 세트 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 더덕(Codonopsis lanceolata)과 잔대(Adenophora triphylla)의 엽록체 게놈 염기서열을 비교하여 psaB 및 rps7와 rps12 유전자간 부위에서 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 염기서열에 기반한 분자마커를 개발하였고, 상기 InDel 분자마커를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제작하여 더덕 및 잔대 시료를 대상으로 PCR을 수행한 결과, 본 발명의 InDel 분자마커가 더덕과 잔대를 구별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 더덕(Codonopsis lanceolata)과 잔대(Adenophora triphylla) 간에 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 염기서열로 이루진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 더덕과 잔대 구별용 InDel 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 더덕과 잔대 구별용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 InDel 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는 더덕과 잔대 구별용 마이크로어레이를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 더덕과 잔대 구별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 더덕과 잔대를 구별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 InDel 분자마커는 더덕 및 잔대의 엽록체 게놈에서 삽입 또는 결실에 의한 다형성을 나타내는 염기서열에 기반한 것으로, 본 발명의 InDel 분자 마커를 이용하면 더덕과 잔대를 간단하고 신속하게 구별할 수 있으므로, 한약재로 가공되어 유통되는 더덕과 잔대를 명확히 판별하여 원료의 혼용 방지 및 원료 품질관리에 대한 지표로서 유용하게 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

도 1은 더덕과 잔대 엽록체의 서열을 비교한 모식도이다. 빨간색 상자; InDel 다형성이 나타난 부위.
도 2는 InDel 분자마커를 증폭시키기 위한 프라이머 세트(cpInDel 1-1, cpInDel 1-2, cpInDel 2-1, cpInDel 2-2, cpInDel3-1, cpInDel 3-2)의 1차 선발 결과를 나타낸 PCR 결과이다.
도 3은 최종 선발된 프라이머 세트 cpInDel 1-1(A)와 cpInDel 3-1(B)을 이용하여 더덕과 잔대를 구별한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 더덕(Codonopsis lanceolata)과 잔대(Adenophora triphylla) 간에 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 염기서열로 이루진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 더덕과 잔대 구별용 InDel 조성물을 제공한다.

상기 서열번호 1 내지 서열번호 4는 각각 삽입(insertion) 또는 결실(deletion) 부위의 염기서열을 포함하는 다형성 뉴클레오티드이다. InDel 다형성이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 일부가 중간에 더해지거나 없어져 품종 혹은 종간에 길이 차이가 생긴 경우를 포함하는 서열을 말한다. 상기 다형성 뉴클레오티드 서열은 DNA 또는 RNA가 될 수 있다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 InDel 조성물에 있어서, 상기 InDel 다형성 염기 정보는 표 2에 나타내었다.

또한, 본 발명은 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 더덕과 잔대 구별용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 프라이머 세트는 바람직하게는 상기 2개의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 프라이머 세트를 포함하며, 2개의 프라이머 세트, 즉, 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 모두 포함할 수 있다. 2개의 프라이머 세트를 동시에 이용하면 더덕과 잔대를 더욱 효율적으로 구별할 수 있다.

상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 5, 6, 7 및 8의 서열 내의 14 이상, 15 이상, 16 이상, 17 이상, 18이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 5의 프라이머(18개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 14 이상, 15 이상, 16 이상, 17이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 5, 6, 7 및 8의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 서열번호 1 내지 서열번호 4의 염기서열의 InDel 다형성 뉴클레오티드, 이에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 이의 cDNA를 포함하는 더덕과 잔대 구별용 마이크로어레이를 제공한다.

바람직하게는, 상기 다형성 뉴클레오티드는 아미노-실란, 폴리-L-라이신 또는 알데히드의 활성기가 코팅된 기판에 고정될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 또는 플라스틱일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 다형성 뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 피에조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting) 법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 마이크로어레이는 본 발명에 따른 다형성 뉴클레오티드 또는 그의 상보적 다형성 뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 이용하여 본 분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 더덕과 잔대 구별용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

또한, 본 발명은

더덕 또는 잔대 의심 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 더덕과 잔대를 구별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 더덕 또는 잔대 의심 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 더덕 또는 잔대 의심 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 조합은 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 더덕과 잔대를 구별하는 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABI Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 더덕과 잔대의 DNA 추출

평창, 무주, 울릉, 청주, 용인에서 재배된 더덕(Codonopsis lanceolata)과 음성, 곡성, 평창, 나주, 진안에서 재배된 잔대(Adenophora triphylla)의 잎을 채취하여 사용하였다. 더덕과 잔대의 잎을 각각 채취하여 액체 질소에 담궈 동결시킨 후 막자사발로 분쇄하였다. 상기 더덕과 잔대의 분쇄물을 이용하여 CTAB(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) 방법으로 게놈 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA는 TE 완충액에 용해시킨 후 보관하였다.

2. 중합효소연쇄반응(PCR)

5 ng/㎕ 농도로 희석된 더덕과 잔대 DNA 각각 2 ㎕, InDel F 및 R 프라이머 각각 1 ㎕, Taq mixture 8 ㎕, 증류수 8 ㎕를 혼합하여 최종 20 ㎕가 되도록 PCR 반응 혼합물을 제조한 후 PCR을 수행하였고, PCR 조건은 하기 표 1과 같다. PCR 증폭산물은 3% 아가로스 겔에서 전기영동하여 확인하였다.

PCR 반응 조건

단계	온도(℃)	시간
전-변성	94	5분
변성	94	30초
결합	50~54	30초
신장	72	1분
변성 단계로 돌아가 34회 추가 반복
최종 신장	72	10분
보관	4	∞

실시예 1. 더덕과 잔대의 엽록체 염기서열 비교 분석을 통한 변이지역 분석

상기에서 추출한 더덕 및 잔대의 게놈 DNA를 Theragen Etex에 의뢰하여 시퀀싱하였으며, CLC Genomics Workbench 7.5 program을 이용하여 어셈블리(assembly)를 하였다.

더덕과 잔대의 시퀀싱 결과 중, 엽록체 게놈 컨티그들을 각각 정렬(alignment)한 후 비교하여, 삽입(insertion) 또는 결실(deletion)된 염기서열을 분석하였다.

그 결과, 더덕과 잔대 엽록체 게놈의 rps7와 rps12의 유전자간 부위에 존재하는 16bp의 염기서열이 더덕에서는 결실되고 잔대에서는 삽입된 것을 확인하였다(도 1A). 또한, 더덕과 잔대 엽록체 게놈의 psaB 유전자에 존재하는 50bp의 염기서열이 더덕에서는 결실되고 잔대에서는 삽입된 것을 확인하였다(도 1B). 상기 삽입 또는 결실의 염기서열 정보는 하기 표 2와 같다.

실시예 2. 분자마커를 이용한 더덕과 잔대 구별

더덕과 잔대의 엽록체 염기서열 비교분석을 통해, 6개의 InDel 마커 후보를 선별하고 각각의 마커를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제작하여 더덕과 잔대 DNA 시료를 주형으로 PCR 분석을 수행하였다.

그 결과, 6개의 InDel 마커 중 cpInDel 1-1 및 cpInDel 3-1 마커에서 더덕과 잔대간에 뚜렷한 밴드 차이가 확인되었다(도 2).

더덕과 잔대 구별용 프라이머

프라이머 명칭	염기서열(5'→3')	반응온도(℃)	위치
cpInDel 1-1 F	GCAGGAAAAGGAGGGAAA (서열번호 5)	52.4	rps7 ~ rps12
cpInDel 1-1 R	GTAGGGTGGATCTCGAAA (서열번호 6)
cpInDel 3-1 F	GGGTCAGGTCCACTTATT (서열번호 7)	52.0	psaB
cpInDel 3-1 R	GGGCTTTGGCTTTTTTCA (서열번호 8)

상기 선발된 마커 cpInDel 1-1 및 cpInDel 3-1을 이용하여 더덕과 잔대를 구별할 수 있는지 확인하기 위해, 더덕과 잔대 각 5개체의 DNA 시료를 주형으로 하여 PCR 분석을 수행하였다.

그 결과, 더덕과 잔대에서 각각 다른 크기의 밴드가 나타나 더덕과 잔대가 정확하게 구별되는 것을 확인하였다(도 3). 따라서, 상기 결과를 통해 더덕 및 잔대 엽록체 게놈 서열에서 InDel 다형성을 보이는 염기서열에 기반한 본 발명의 분자마커와 이를 증폭하기 위한 프라이머 세트 cpInDel 1-1 및 cpInDel 3-1은 더덕과 잔대를 효과적으로 구별하기 위해 활용될 수 있음을 확인하였다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Molecular marker and primer set for discriminating Codonopsis lanceolata and Adenophora triphylla and uses thereof <130> PN17369 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 162 <212> DNA <213> Codonopsis lanceolata <400> 1 gcaggaaaag gagggaaacg gatactcaat ttaaagtgag taaacagaat tccatactcg 60 atctcataga tacatataga attctgcgga aagccgtatt cgatgaaagt cgtatgtacg 120 gcttggaggg agatctttca tatctttcga gatccaccct ac 162 <210> 2 <211> 178 <212> DNA <213> Adenophora triphylla <400> 2 gcaggaaaag gagggaaacg gatactcaat ttaaagtgag tcaacagaat tctatactcg 60 atctcataga tacataatct catagataca tatagaattc tgcggaaagc cgtattcgat 120 gaaagtcgta tgtacggctt ggagggagat ctttgatatc tttcgagatc caccctac 178 <210> 3 <211> 203 <212> DNA <213> Codonopsis lanceolata <400> 3 gggtcaggtc cacttatttt tcttttgttg atttcgaatt gaaaagagga ctatttggtg 60 attcaagaga tgacttatca ttcttcatga taactactat actagaaatg ataacgtagt 120 attatatgat ggattactac tataaaaaat gtcttccttc aaatatgaat actactgtag 180 ttttatgaaa aaagccaaag ccc 203 <210> 4 <211> 246 <212> DNA <213> Adenophora triphylla <400> 4 gggtcaggtc cacttagttt tttggttgat ttcgaatctt ttcactagat ttcatttcta 60 atttcaaata ggaatattga gtcatttacg agaggatttc tcattcttca tgataactac 120 tatactataa atgctaacta tatggttaat gattactagt aataatatct ctagtcttcc 180 ttcaaatagg aatactacta ctctagtttt atgaaaaatg tagttttatg aaaaaagcta 240 aagtcc 246 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gcaggaaaag gagggaaa 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gtagggtgga tctcgaaa 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gggtcaggtc cacttatt 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gggctttggc ttttttca 18

Claims (8)

1. 더덕(Codonopsis lanceolata)과 잔대(Adenophora triphylla) 간에 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 더덕과 잔대 구별용 InDel 조성물.
2. 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 더덕과 잔대 구별용 프라이머 세트.
3. 삭제
4. 제1항에 기재된 InDel의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는 더덕과 잔대 구별용 마이크로어레이.
5. 제2항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 더덕과 잔대 구별용 키트.
6. 제5항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
7. 더덕 또는 잔대 의심 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
   상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제2항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
   상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 더덕과 잔대를 구별하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.

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