KR20220105438A - Dna 바코드를 이용한 한약재 잔대, 모시대 및 더덕 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 DNA 바코드를 이용한 한약재 잔대, 모시대 및 더덕 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명으로부터 제공되는 프라이머 세트는 엽록체 게놈에 존재하는 rbcL 유전자 내에서 단일 염기 다형성(SNP; single nucleotide polymerphism)을 나타내는 염기서열에 기반한 유전자 마커로서, 상기 유전자 마커를 이용하여 시료의 게놈 DNA에 대한 PCR을 수행하면 PCR 산물의 크기에 기반하여 간단하게 잔대, 모시대 및 더덕을 동시에 판별할 수 있다.
본 발명으로부터 제공되는 프라이머 세트는 엽록체 게놈에 존재하는 rbcL 유전자 내에서 단일 염기 다형성(SNP; single nucleotide polymerphism)을 나타내는 염기서열에 기반한 유전자 마커로서, 상기 유전자 마커를 이용하여 시료의 게놈 DNA에 대한 PCR을 수행하면 PCR 산물의 크기에 기반하여 간단하게 잔대, 모시대 및 더덕을 동시에 판별할 수 있다.
Description
본 발명은 한약재 잔대 유사 한약재인 모시대 및 더덕과 구별하기 위하기 위하여 DNA 바코드를 이용한 한약재 잔대, 모시대 및 더덕 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
잔대(사삼)는 한약전외한약(생약)규격집에 잔대(Adenophora triphylla var. japonica Hara) 또는 사삼(沙蔘)(Adenophora stricta Miq.(초롱꽃과 Campanulaceae))의 뿌리라고 기재되어 있으며, 양음청폐하여 진액을 보충하여 폐를 윤택하게 하고 거담지해의 효능이 있어 열을 식히며 담을 없애 인후건조, 마른기침, 가래, 해수, 천식 등에 쓰인다. 익위생진하여 위음 부족으로 입안이 마르고 인후가 건조하며 대변이 굳는 변비 증상 등에 사용한다.
잔대의 동속식물인 모시대(Adenophora remotiflorus Miquel)는 한방에서는 행엽채(杏葉菜), 행엽, 지삼(地蔘)이라고 칭하는데 뿌리는 제니라 하여 청열, 해독, 화담의 효능으로 응용되어 온 한약재이다. 모시대의 뿌리는 종모양의 통꽃으로 끝이 5개로 갈라지는 꽃부리를 갖고 있는 등 잔대(사삼)와 굉장히 형태적으로 유사하다.
또한, 잔대(사삼)로 유통되는 유사생약 및 혼용품으로 Codonopsis(더덕)속 식물이 있다. 더덕(Codonopsis lanceolata (Siebold & Zucc.) Trautv.)은 잔대속 보다는 도라지속과 단계통군에 속하나, 항약집성방(1433), 동의보감(1613) 등 많은 고문헌에서 잔대(사삼)의 기원 식물을 더덕으로 기록하고 있고, 이로 인해 기원 식물에 대한 문헌적 혼란이 계속 되어오고 있다. 이와 같이 모시대, 더덕이 잔대(사삼)로 이용되거나 유통되고 있는 등 혼란이 있어, 잔대(사삼)에 대한 기원식물의 재정립이 요구되고 있다.
잔대와 유사한 한약재를 구별하기 위한 기술로서, 대한민국 등록특허공보 제10-1912194호 「더덕과 잔대 구별을 위한 분자마커와 프라이머 세트 및 이의 용도」 및 대한민국 등록특허공보 제10-1912933호 「더덕과 잔대 구별을 위한 분자마커와 프라이머 세트 및 이의 용도」는 잔대와 더덕을 판별하기 위해 삽입/결실(InDel, insertion/deletion) 마커 즉, 특정 위치에 있는 DNA의 염기서열 분석을 통해 품종간 염기서열의 삽입 또는 결실을 기반으로 PCR 프라이머를 개발하여 PCR product size 차이로 잔대와 더덕을 구별할 수 있는 기술에 관한 것이다. 본 특허는 InDel 마커로 잔대와 더덕을 구별할 수 있지만, 모시대를 구별할 수는 없다. 또한, 모든 품종마다 삽입/결실이 일어나는 것은 아니기 때문에 잔대 및 모시대 사이에 삽입/결실 부위가 존재하지 않는다면 이 기술을 활용하여 잔대, 모시대, 더덕을 동시에 판별 할 수는 없다.
또한, 대한민국 등록특허공보 제10-1948389호 「SSR 마커를 이용한 더덕 및 잔대의 감별방법」는 잔대 및 더덕을 판별하기 위해 단순반복서열(SSR, simple sequence repeat) 마커 즉, 짧은 염기서열의 반복으로 만들어진 부위에 의해 나타나는 유전적 다양성을 분석하는 방법을 사용하여 더덕 및 잔대의 유전적 다형성을 확인함으로써 잔대를 판별하는 기술에 관한 것이다. 본 특허는 잔대와 더덕만 구별이 가능한 기술이며, 잔대와 모시대를 구별할 수는 없다. 또한, 식물에서 게놈 DNA를 추출한 후 DNA를 PCR로 증폭한 후 다시 SSR 마커 기반 프라이머로 한 번 더 PCR 증폭 과정을 수행하여 총 2단계 PCR 단계를 진행한다.
이에, 본 발명자들은 잔대(사삼)란 이름으로 유통되고 있는 약용식물들의 정확한 진위 여부를 감별하기 위하여 DNA의 직접적인 비교분석을 진행하였으며, 잔대, 모시대 및 더덕의 게놈 DNA에 존재하는 단일염기다형성(SNP, single nucleotide polymorphism)을 기반으로 종 감별이 가능한 프라이머 세트를 제작하여단 한 번의 분석으로 잔대, 모시대 및 더덕을 동시에 판별할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 한약재 잔대, 모시대 및 더덕의 판별용 프라이머 세트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 잔대, 모시대 및 더덕 판별용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 한약재 잔대, 모시대 및 더덕을 판별하는 방법을 제공하는 데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 잔대(Adenophora triphylla var. japonica Hara), 모시대(Adenophora remotiflorus Miquel) 및 더덕(Codonopsis lanceolata (Siebold & Zucc.) Trautv.) 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 내열성 DNA 중합효소, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 a) 잔대, 모시대 및 더덕의 의심 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; b) 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 프라이머 세트를 혼합하는 단계; c) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하는 단계; 및 d) 상기 증폭 반응에서 얻어진 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함하는 잔대와 모시대 및 더덕을 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 잔대, 모시대 및 더덕의 의심 시료는 잔대, 모시대 및 더덕으로 의심되는 식물체의 뿌리, 이의 절편형태 및 분말로 가공된 산물인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 증폭 산물을 분석하는 단계는 겔 전기영동, 형광 측정 및 UV 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 한다.
본 발명으로부터 제공되는 프라이머 세트는 잔대, 모시대 및 더덕의 엽록체 게놈에 존재하는 rbcL 유전자 내에서 단일 염기 다형성(SNP; single nucleotide polymerphism)을 나타내는 염기서열에 기반한 유전자 마커로, 본 발명의 유전자 마커를 이용하여 시료의 게놈 DNA에 대한 PCR을 수행하면 PCR 산물의 크기에 기반하여 간단하게 잔대를 모시대 및 더덕과 동시에 판별할 수 있다.
도 1은 본 발명의 서열번호 1 내지 3의 염기서열을 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 시료번호 1 내지 7의 잔대(Adenophora triphylla var. japonica Hara), 모시대(Adenophora remotiflorus Miquel) 및 더덕(Codonopsis lanceolata (Siebold & Zucc.) Trautv.) 표준시료에서 multiplex PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 잔대(Adenophora triphylla var. japonica Hara), 모시대(Adenophora remotiflorus Miquel) 및 더덕(Codonopsis lanceolata (Siebold & Zucc.) Trautv.) 판별용 프라이머 세트에 관한 것이다.
상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 3 염기서열 내에 17개 내지 30개의 연속 염기서열의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
상기 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트는 잔대, 모시대 및 더덕에서 모두 확인되는 잔대, 모시대 및 더덕의 엽록체 게놈의 rbcL 유전자 내에 공통으로 존재하는 염기서열로써, PCR 과정에서 올바르게 증폭이 되었는지 확인할 수 있는 대조군용 프라이머 세트이다.
또한, 상기 서열번호 3으로 표시되는 프라이머 세트는 부가, 결실 또는 치환된 서열이 포함될 수 있다.
상기 서열번호 3으로 표시되는 프라이머는 모시대 및 더덕에서는 확인되지 않으나, 잔대의 엽록체 게놈의 rbcL 유전자 내에 특이적으로 존재하는 염기서열로써, 상기 서열번호 2 및 3으로 표시되는 프라이머 세트는 더덕 및 모시대와 잔대를 특이적으로 구분할 수 있는 프라이머이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 잔대, 모시대 및 더덕 판별용 키트를 제공한다.
상기 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 추가로 포함할 수 있다. 상기 시약은 내열성 DNA 중합효소, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 a) 잔대, 모시대 및 더덕의 의심 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; b) 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 프라이머 세트를 혼합하는 단계; c) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하는 단계; 및 d) 상기 증폭 반응에서 얻어진 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함하는 잔대와 모시대 및 더덕을 판별하는 방법에 관한 것이다.
상기 잔대, 모시대 및 더덕의 의심 시료는 잔대, 모시대 및 더덕으로 의심되는 식물체의 뿌리, 이의 절편형태 및 분말로 가공된 산물인 것일 수 있다.
상기 잔대, 모시대 및 더덕의 의심 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수 있고, DNeasy plant mini kit(Qiagen)를 이용할 수 있다.
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다.
상기 증폭 산물을 분석하는 단계는 겔 전기영동, 형광 측정 및 UV 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 분석하는 하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다.
상기 판별하는 방법은 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 프라이머 세트와 한 가지 분석 조건으로 동시에 반응할 수 있는 multiplex PCR(multiplex polymerase chain reaction) 분석 기술을 이용하는 것을 특징으로 한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1> 잔대, 모시대 및 더덕의 표준시료 준비 및 DNA 추출
실험에 사용된 잔대(Adenophora triphylla var. japonica Hara)는 동의보감소재은행에서 표준한약재 분말로 분양받아 -80℃의 deep-freezer에 보관하였다(분양번호 : D160705159). 또한, 실험에 사용된 모시대(Adenophora remotiflorus Miquel) 및 더덕(Codonopsis lanceolata (Siebold & Zucc.) Trautv.)은 채집지 별로 국립생물자원관 야생생물유전자원은행에서 분양받아 -80℃의 deep-freezer에 보관하였다. 잔대는 분말 형태로 분양받아 DNeasy plant mini kit(Qiagen)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 게놈 DNA를 추출하고, nuclease free water에 용출하였으며, 추출한 DNA는 -20℃에서 냉동 보관하여 사용하였다.
아래의 표 1은 분양받은 자원의 분양번호를 나타낸 것이다.
| 시료 번호 | 분양번호 | 분양기관 | ??명 | 채집지 |
| 1 | D160705159 | 동의보감소재은행 | Adenophora triphylla var. japonica Hara | 중국 길림 |
| 2 | NIBRGR0000608309 | 국립생물자원관 야생생물유전자원은행 | Adenophora remotiflorus Miquel | 강원도 평창 |
| 3 | NIBRGR0000608310 | 경상북도 영주 | ||
| 4 | NIBRGR0000608311 | 전라남도 구례 | ||
| 5 | NIBRGR0000605152 | Codonopsis lanceolata (Siebold & Zucc.) Trautv. | 전라북도 장수 | |
| 6 | NIBRGR0000416909 | 경상남도 남해 | ||
| 7 | NIBRGR0000432482 | 충청남도 예산 |
<실시예 2> 잔대, 모시대 및 더덕 판별용 엽록체 기반 rbcL SNP 마커
엽록체 유전자 내의 단일염기다형성(SNP, single nucleotide polymorphism)을 확인하고자 잔대, 모시대 및 더덕의 rbcL 유전자 염기서열 분석을 실시하였다. 그 후, NCBI nucleotide blast 프로그램을 이용하여 잔대, 모시대 및 더덕의 rbcL 유전자 염기서열을 비교 분석하여 잔대의 모시대 및 더덕과 다른 특이적인 염기서열이 존재하는 SNP 영역을 확인하였다. 또한, 잔대의 rbcL 유전자에서 특이적으로 존재하는 SNP 영역을 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제작하여 잔대, 모시대 및 더덕을 판별할 수 있는 rbcL SNP 마커를 개발하여 아래 표 2에 나타내었다.
| 서열번호 | 프라이머명 | 염기서열(5`→3`) | 크기(bp) |
| 1 | rbcL_Con(F) | TCGTCCCCTATTGGGATGTA | 497 |
| 2 | rbcL_Con(R) | CTACGGTCCCGGAGTGAATA | 497, 225 |
| 3 | rbcL_tSNP(F) | CAGAGAGTTGGGAGTTCCTAGCA | 225 |
<실시예 3> 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용한 유전자 마커 증폭
DNA prep kit를 이용하여 추출한 잔대의 게놈 DNA와 분양받은 모시대 및 더덕의 DNA를 10 ng/uL로 희석하여 DNA 1uL, 프라이머(표 2) 및 증류수 혼합물 9uL, 2X TOPsimple™ DyeMIX 10uL를 혼합하여 20uL의 PCR 반응 혼합물을 제조하였다. PCR 과정은 전변성(initial denaturation) 94℃ 4분; 변성(denaturation) 95℃ 30초, 결합(annealing) 56.5~61.5℃, 30초, 신장(extension) 72℃, 1분의 과정을 총 35회 반복; 최종 신장(final extension) 72℃, 10분의 조건으로 수행하였다. PCR 증폭 산물은 1% 아가로스 겔에서 전기영동하여 UV illuminator(bio-rad, chemidoc)를 사용하여 확인하였다.
<실시예 4> rbcL SNP 마커를 이용한 잔대, 모시대 및 더덕의 구별
상기 개발된 유전자 마커인 rbcL SNP 마커가 잔대, 모시대 및 더덕을 판별할 수 있는지 확인하기 위해 잔대, 모시대 및 더덕의 DNA 시료를 주형으로 multiplex PCR 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 잔대에서 225bp, 497bp의 밴드가 확인되었고, 모시대 및 더덕에서 497bp의 밴드가 확인되어, 모시대 및 더덕의 한약재가 잔대와 구분되는 것을 확인하였다. 또한, 상기 rbcL SNP 마커는 모시대 및 더덕의 채집지와 상관없이 모두 잔대와 구별한 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> GFC Life Science Co., Ltd.
<120> Primer set for discriminating Adenophora triphylla var. japonica
Hara, Adenophora remotiflorus Miquel and Codonopsis lanceolata
(Siebold & Zucc.) Trautv DNA Barcode and uses thereof
<130> P20268
<160> 3
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rbcL_Con(F)
<400> 1
tcgtccccta ttgggatgta 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rbcL_Con(R)
<400> 2
ctacggtccc ggagtgaata 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rbcL_tSNP(F)
<400> 3
cagagagttg ggagttccta gca 23
Claims (6)
- 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 잔대(Adenophora triphylla var. japonica Hara), 모시대(Adenophora remotiflorus Miquel) 및 더덕(Codonopsis lanceolata (Siebold & Zucc.) Trautv.) 판별용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트를 포함하는 잔대, 모시대 및 더덕 판별용 키트.
- 제2항에 있어서, 상기 키트는 내열성 DNA 중합효소, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 잔대, 모시대 및 더덕 판별용 키트.
- a) 잔대, 모시대 및 더덕의 의심 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; b) 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 프라이머 세트를 혼합하는 단계; c) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하는 단계; 및 d) 상기 증폭 반응에서 얻어진 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함하는 잔대와 모시대 및 더덕을 판별하는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 잔대, 모시대 및 더덕의 의심 시료는 잔대, 모시대 및 더덕으로 의심되는 식물체의 뿌리, 이의 절편형태 및 분말로 가공된 산물인 것을 특징으로 하는 잔대와 모시대 및 더덕을 판별하는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 증폭 산물을 분석하는 단계는 겔 전기영동, 형광 측정 및 UV 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 잔대와 모시대 및 더덕을 판별하는 방법.
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| KR101912933B1 (ko) | 2018-08-03 | 2018-10-30 | 충북대학교 산학협력단 | 더덕과 잔대 구별을 위한 분자마커와 프라이머 세트 및 이의 용도 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Minkyung Kim, et al., The Korean Society of Plant Resources, p.97, F-P-36, 2019 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102511995B1 (ko) | 2023-03-21 |
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