KR101573981B1

KR101573981B1 - 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하기 위한 다형성 분자 마커 및 이를 이용한 원방풍, 해방풍 및 식방풍 구별 방법

Info

Publication number: KR101573981B1
Application number: KR1020130101636A
Authority: KR
Inventors: 이영기; 서효석; 이청호; 이정헌; 전은영; 김광철; 오경환
Original assignee: 주식회사 케이티앤지
Priority date: 2013-08-27
Filing date: 2013-08-27
Publication date: 2015-12-02
Also published as: KR20150024581A

Abstract

본 발명은 핵 리보솜 DNA의 ITS 지역에 해당하는 염기서열에서 다형을 확인하여, 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하기 위한 다형성 분자 마커를 제공할 수 있으며, 상기 다형성 분자 마커를 포함하는 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하기 위한 키트 및 다형성 염기를 포함하는 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열을 증폭할 수 있는 프라이머 또한 제공할 수 있으며, 이들을 이용하여 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 검출할 수 있는 방법을 제공한다.

Description

원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하기 위한 다형성 분자 마커 및 이를 이용한 원방풍, 해방풍 및 식방풍 구별 방법{SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM MARKER FOR IDENTIFICATION OF S.DIVARICATA, G.LITTORALIS AND P.JAPONICUM AND IDENTIFICATION METHOD USING THE SAME}

본 발명은 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하기 위한 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 분자 마커, 상기 다형성 분자 마커를 이용한 키트, 상기 다형성 분자 마커를 위한 프라이머쌍 및 실시간 중합효소 연쇄 반응(Real-time PCR)에 의한 원방풍, 해방풍 및 식방풍의 식별 방법에 관한 것이다.

원방풍 (元防風)은 중풍치료 처방에서 가장 많은 빈도로 사용되는 약재 중 하나로 이름도 여기에서 유래하였다. 원래 '원방풍'은 한국에 자생하지 않는 식물로 한국에서는 '갯기름나물'을 '식방풍'이라하여 '방풍'으로 사용하였고 이름이 비슷한 '해방풍'을 '원방풍'이라고 부르며 혼용하고 있다. '방풍'은 「대한약전」 9개정에 Saposhnikovia divaricata Schischkin (산형과 Umbelliferae)의 뿌리'로 규정되어 있고 「일본약국방」에 '해방풍'으로 수재되어 있으며, 「중국약전」에는 '북사삼'으로 수재된 약재로 효능 및 주치가 "양음청폐 (陽陰淸肺), 익위생진 (益胃生津)하여 폐열의 건조한 기침 노수담혈 (勞嗽痰血), 열병에 진상구갈 (津傷口渴)에 쓰인다 (CP)."고 하여 '사삼'과 비슷한 작용을 하는 것으로 알려져 있다.

방풍은 Saposhnikovia divaricata Schischkin (산형과 Umbelliferae)의 뿌리로 원주상을 이루고 길이 15~20cm, 지름 7~15mm이고 아래쪽은 약간 가늘다. 바깥면은 엷은 갈색을 띠며 뿌리줄기의 윗부분에는 촘촘히 돌림마디 모양의 세로주름이 있고 갈색의 털 모양으로 된 엽초의 잔기가 붙어있는 것도 있다. 뿌리에는 많은 세로주름과 가는 뿌리의 자국이 있다. 횡절면을 확대경으로 보면 가장자리는 회갈색이고 빈틈이 여러 개 보이며 중앙은 둥글고 황색을 띤다. 특이한 냄새가 있고 맛은 약간 달다 (KP, JP, CP). 중국, 일본에서 약재로 쓰이는 방풍 역시 모두 같은 기원으로 되어있으며 현재 국내에서는 원방풍 (元防風)으로 통칭되고 있다.

해방풍 (海防風)은 갯방풍으로도 불리며 Glhnia littoralis (산형과 Umbelliferae)의 뿌리 및 뿌리줄기이다. 거의 원주형을 이루고 길이 10~20cm, 지름5~15cm 이며 때로는 세로로 쪼개어져 있는 것도 있다. 바깥면은 엷은 황갈색~적갈색을 띠고 가지뿌리는 대부분 떨어졌으며 그 자국이 남아 있다. 뿌리줄기는 대개 짧고 서서히 가늘어진 직근으로 된 뿌리줄기에는 가는 가로주름의 돌림마디가 있다. 점차 뿌리쪽으로 가면서 곳곳에 어두운 적갈색의 작은 혹 또는 가로로 두드러진 입상돌기 및 둥굴게 패인 오목한 점과 거친 세로주름이 나타나며 때로는 코르크층이 벗겨져서 백색으로 보이는 것도 있다. 약간의 특이한 냄새가 있고 맛은 달다 (KP, JP 海防風; CP 北沙蔘).

식방풍 (植防風)은 갯기름나물로도 불리며 Pucdanum japonicum (산형과 Umbllifra)의 뿌리이다. 원추형~방추형을 이루고 곁뿌리가 2~4개 달려있고 길이 5~15 cm, 지름 1~3 cm이다. 바깥면은 회황색~회갈색이며 드문드문 길이 3~5 mm의 적갈색 피목이 세로로 있고 근두부에 오목한 줄기자국이 있으며 거친 세로주름과 잔뿌리 자국이 있다. 횡단면을 확대경으로 보면 피부는 회갈색~엷은갈색이며 빈틈이 보이고 갈색의 형성층이 뚜렷하고 목부는 횡갈색이며 치밀하다. 특이한 향기가 있고 맛은 부드럽고 조금 쓰다 (KHP).

한약재는 한국을 비롯하여 중국, 일본 등 한약 문화권의 국가에서 오랫동안 사용되어 오고 있으며, 이러한 한약재는 지리적, 환경적, 역사적 차이 등 다양한 요인으로 인해 국가별로 기원에 대한 다양한 기준을 가지게 되었다. 또한 1990년대부터 중국을 비롯한 한약 문화권 국가로부터의 한약재 시장이 개방됨에 따라, 국내의 유사 한약재의 혼용 유통이 우려할만한 수준에 이르고 있다. 원방풍의 경우 국내 재배가 전무하고 전량 중국으로부터 수입이 되고 있는 상황에서 기원이 명확하지 않은 유사 약재의 혼입이 매우 우려된다. 건조, 가공되어 유통되는 한약재 특성상 원산지가 다른 한약재가 혼용 유통되는 사례가 발생하더라도 구분이 어렵기 때문에 유통된 방풍 약재들의 기원식물 종감별 및 원산지 판별은 중요한 의미를 갖는다.

현재까지 사용되고 있는 한약재 기원식물 종감별법에는 형태학적 특징, 성분의 정성과 정량분석 및 DNA 수준에서의 차이점 비교 등이 있다. 형태학적인 특징은 식물체의 생육환경에 따라 차이를 나타낼 수 있어 식물 종판별에 어려움이 있으며, 특히 약재의 경우 건조가공하여 유통되므로 육안으로 감별하기 쉽지 않다. 또한 성분분석 비교에 의한 약재 구분을 위해 미각센서 (Choi et al., 2011), NMR spectrometer (Yang et al., 2010) 등이 이용되었으나, 이 방법은 생산지의 재배환경에 따라 약재성분이 영향을 받을 수 있다는 한계가 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해, Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) (Williams et al., 1990), Sequence Characterized Amplified Regions (SCAR) (Wang et al., 2001; Choi et al., 2008), Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) (Ha et al., 2002) 등 DNA 단편의 다형성을 이용한 분자생물학적 식물 종판별이 시도되고 있을 뿐만 아니라, 또한 최근에는, 한약재 판별에 있어서 CBOL Plant Working Group이 제안한 DNA 바코드를 이용한 분류법이 그 유용성을 인정받고 있다 (CBOL Plnat Working Group, 2009). 특히 게놈 상에 존재하는 핵 리보솜 DNA 유전자 (Nuclear Ribosomal DNA gene, nrDNA)의 nrDNA-ITS (Internal transcribed spacer)부위는 다른 유전자의 코딩 부위보다 빠르게 진화할 뿐만 아니라, 일반성, 단순성, 재현성 등의 이점으로 인해 계통분류나 종간 유전변이 탐색 등을 위해 널리 이용되는 염기서열로 알려져 있다 (Chen et al., 2010; Kim et al., 2005; Lee et al., 2010).

본 발명은 한약재 자원으로 사용, 유통되고 있는 산형과 식물인 원방풍 (S. divaricata), 해방풍 (G. littoralis) 및 식방풍 (P. japonicum)을 대상으로 ITS 지역에 존재하는 유전자 염기서열의 종 간 다형성에 기인한 원방풍, 해방풍 및 식방풍의 분자마커를 제공한다. 또한 이를 이용하여 혼재된 약재 시료에서 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 확인할 수 있는 종감별법을 제공한다.

본 발명은 핵 리보솜 DNA의 ITS 지역에 해당하는 염기서열에서 다형을 확인하여, 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하기 위한 다형성 마커를 제공할 수 있다.

구체적으로, 방풍의 ITS 지역 유전자 내에서, 94 번째 염기, 101 번째 염기, 104 번째 염기, 222 번째 염기 및 226 번째 염기 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 염기를 포함하는 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열로 이루어지는 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하기 위한 다형성 분자 마커가 제공될 수 있으며, 이러한 다형성 분자 마커는 10 내지 100 개의 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열로 이루어질 수 있다.

다형성 분자 마커의 실시예로서 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열을 갖는 다형성 분자 마커가 제공될 수 있으며, 그 외에도 상기 ITS 지역의 94 번째 염기는 C, 101 번째 염기는 C, 104 번째 염기는 T인, 염기를 포함하는 연속적인 염기서열이나 그의 상보적인 염기서열, 또는 222 번째 염기는 A인, 염기를 포함하는 연속적인 염기서열이나 그의 상보적인 염기서열로 이루어지는 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하기 위한 다형성 분자 마커가 제공될 수 있다.

또한, 상기 ITS 지역의 94 번째 염기가 T, 101 번째 염기가 T, 104 번째 염기가 C인, 염기를 포함하는 연속적인 염기서열이나 그의 상보적인 염기서열, 또는 222 번째 염기는 T인, 염기를 포함하는 연속적인 염기서열이나 그의 상보적인 염기서열로 이루어지는 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하기 위한 다형성 분자 마커가 제공될 수 있다.

그 밖에도 본 발명은, 상기 ITS 지역의 94 번째 염기는 C, 101 번째 염기는 T, 104 번째 염기는 T인, 염기를 포함하는 연속적인 염기서열이나 그의 상보적인 염기서열 또는 222 번째 염기가 G인, 염기를 포함하는 연속적인 염기서열이나 그의 상보적인 염기서열로 이루어지는 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하기 위한 다형성 분자 마커를 제공할 수 있다.

또한 본 발명에서는 상기 다형성 분자 마커를 포함하는, 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하기 위한 키트를 제공할 수 있다.

또한 본 발명에서는 방풍의 ITS 지역 유전자 내에서, 94 번째 염기, 101 번째 염기, 104 번째 염기, 222 번째 염기 및 226 번째 염기 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 염기를 포함하는 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열을 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 제공할 수 있다.

본 발명에 따르는 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하는 방법은, 시료로부터 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출된 DNA에서 ITS 지역 유전자 내의, 94 번째 염기, 101 번째 염기, 104 번째 염기, 222 번째 염기 및 226 번째 염기 중에서 적어도 하나 이상을 포함하는 부위를 증폭시키는 단계; 및 상기 증폭된 DNA에서 ITS1 지역 유전자 내의, 94 번째 염기, 101 번째 염기, 104 번째 염기, 222 번째 염기 및 226 번째 염기 중에서 적어도 하나 이상을 비교하는 단계;를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에서, 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하는 방법은, 시료로부터 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출된 DNA에서 ITS 지역 유전자 내의, 94 번째 염기, 101 번째 염기, 104 번째 염기, 222 번째 염기 및 226 번째 염기 중에서 적어도 하나 이상을 포함하는 부위를 증폭시키는 단계; 상기 증폭 산물과 동일한 SNP 부분를 포함하는, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 다형성 분자마커와 혼성화하는 단계; 및 상기 혼성화 정도를 검출하는 단계;를 포함할 수 있다.

또한, 상기 방법은 원방풍, 해방풍 및 식방풍의 다형성 유전자의 염기서열에 기인하여, 상기 94 번째 염기가 C, 101 번째 염기가 C, 104 번째 염기가 T로 확인되는 경우, 또는 상기 222 번째 염기가 A로 확인되는 경우, 원방풍으로 감별할 수 있는 반면, 94 번째 염기가 T, 101 번째 염기가 T, 104 번째 염기가 C로 확인되는 경우, 또는 상기 222 번째 염기가 T로 확인되는 경우에는 해방풍으로 감별할 수 있다. 또한, 상기 94 번째 염기가 C, 101 번째 염기가 T, 104 번째 염기가 T로 확인되는 경우, 또는 상기 222 번째 염기가 G로 확인되는 경우에는, 식방풍으로 감별할 수 있다.

본 발명에 의하면, 혼오용이 우려되는 3종의 방풍류인 원방풍, 해방풍 및 식방풍 각각에 대한 종감별이 가능한 다형성 분자 마커를 이용하여 감별할 수 있으며, 이는 기존의 방법들에 비하여 감도 및 정확성을 대폭 향상시킬 수 있다. 또한, 육안으로 감별하기 어려운 약재들이 혼재된 대량 시료에서 이들 분자 마커를 동시처리하여 감별하는 것이 가능하다.

도 1은 원방풍, 해방풍 및 식방풍 수집 시료의 ITS 지역의 DNA를 비교하여 나타낸 염기서열에 대하여 실시예로서, 서열번호 2, 3, 4 인 분자 마커의 위치 및 서열번호 5, 6 인 프라이머의 위치이다.
도 2는 수집시료 번호 01, 03번 시료와 AB570260(accession number)의 염기서열이다.
도 3은 수집시료 번호 02, 04, 05, 06, 07, 08, 08, 10, 11, 12, 19번 시료와 FJ593179(accession number)의 염기서열이다.
도 4는 수집시료 번호 13, 17번 시료와 JF977807(accession number)의 염기서열이다.
도 5는 BPW_Pb_FAM 형광 분자마커를 이용한 RT-PCR 사이클 수에 따른 원방풍 기원식물의 형광값 검출을 나타낸 그래프이다.
도 6은 BPH_Pb_1_RC_FAM 형광 분자마커를 이용한 RT-PCR 사이클 수에 따른 해방풍 기원식물의 형광값 검출을 나타낸 그래프이다.
도 7은 BPS_Pb_1_RC_FAM 형광 분자마커를 이용한 RT-PCR 사이클 수에 따른 식방풍 기원식물의 형광값 검출을 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명의 참고예 및 실시예에 의해 상세히 설명하지만, 하기 참고예 및 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 하기의 실시예에서 확인되는 바와 같이, 수집된 약재들의 ITS 서열을 증폭하여 그 서열을 결정한 후, 원방풍, 해방풍 및 식방풍의 다형성을 보이는 부분(single nucleotide polymorphic site, 동일 종의 각 개체 사이에서는 서열이 보존되어 있어 동일한 염기 타입의 뉴클레오티드를 나타내지만, 종을 달리한 원방풍, 해방풍 및 식방풍 사이에서는 서로 염기 타입이 다른 뉴클레오티드를 나타내는 부분을 말한다)을 비교 분석한 결과 (도 1), 94 번째 염기, 101 번째 염기, 104 번째 염기, 222 번째 염기 및 226 번째 염기가 다형성 염기인 것으로 나타났다. 원방풍, 방풍 및 식방풍 각각의 해당 다형성 염기는 하기의 표와 같다.

<표 1. 원방풍, 해방풍 및 식방풍의 SNP 위치와 염기서열>

본 발명의 다형성 분자 마커는, 방풍의 ITS 지역 유전자 내에서, 94 번째 염기, 101 번째 염기, 104 번째 염기, 222 번째 염기 및 226 번째 염기 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 염기를 포함하는 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열로 이루어지는 것으로서, 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하는데 이용될 수 있다.

본 명세서에서, "ITS 지역"은 ITS 지역(ITS1 & ITS2) 의 일부 또는 전부를 포함하고 rDNA (18S, 5.8S & 28S)의 전부 또는 일부 서열을 포함하는 gDNA 상의 지역을 의미하며, 본 명세서의 의미 내용상 문맥에 따라서는 그 gDNA 상의 지역으로부터 얻어진 증폭 산물, 전사체(transcript), 그 전사체로부터 얻어진 cDNA, 또는 그 cDNA 의 증폭 산물을 의미할 수 있다.

또한, 본 명세서에서, "분자 마커"는 개체들 사이의 유전적 변이를 측정할 수 있게 해주는 도구 또는 수단으로서, 유전적 정보를 검출할 수 있거나 또는 개체들 사이의 유전적 연관성을 추정할 수 있게 하는 것들을 포함한다.

본 발명의 다형성 분자 마커는 10 내지 100 개의 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열로 이루어 질 수 있다.

이러한 분자 마커 또는 본 발명의 프라이머의 길이는 주형 DNA 와 특이적으로 결합하여 안정한 상보적인 결합을 형성하거나, DNA 합성의 시작점으로 작용할 수 있는 한 특별한 제한은 없다. 다만, 분자 마커 또는 프라이머의 길이는 온도, 버퍼의 염 농도 등 증폭 조건을 고려하여 결정될 것이다. 통상은 10 내지 100 뉴클레오티드 범위의 길이를 가지도록 설계되어 제작될 것이나, 이들의 길이가 너무 짧거나 너무 길 경우에 주형 DNA와 비특이적 결합이 형성될 수 있으므로 바람직하게는 15 내지 50 뉴클레오티드의 길이를 가지도록 설계되는 것이 바람직하다.

본 발명의 다형성 분자 마커의 구체적인 실시예로서, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4 를 참조할 수 있다.

하지만, 본 발명의 다형성 분자 마커의 염기서열은 상기 서열번호를 갖는 염기서열을 갖는 다형성 분자 마커에 한정되지 않으며, 구체적인 실시예로서, ITS 지역의 염기 서열 중에서 94 번째 염기가 C, 101 번째 염기가 C, 104 번째 염기가 T인, 염기를 갖는 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열로 이루어지는 다형성 분자 마커를 포함하며, 222 번째 염기는 A인 염기를 갖는 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열로 이루어지는 다형성 분자 마커를 포함할 수 있다.

이러한 염기서열을 포함하는 다형성 분자 마커는 원방풍을 감별하기 위한 목적으로 이용될 수 있다.

또한 ITS 지역의 염기 서열 중에서 94 번째 염기는 T, 101 번째 염기는 T, 104 번째 염기는 C인, 염기를 갖는 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열로 이루어지는 다형성 분자 마커, 상기 222 번째 염기는 T인 염기를 갖는 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열로 이루어지는 다형성 분자 마커를 포함한다.

이러한 염기서열을 포함하는 다형성 분자 마커는 해방풍을 감별하기 위한 목적으로 이용될 수 있다.

또 다른 실시예로서, ITS 지역의 염기 서열 중에서 94 번째 염기가 C, 101 번째 염기가 T, 104 번째 염기가 T인, 염기를 포함하는 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열로 이루어지는 다형성 분자 마커가 될 수 있으며, 222 번째 염기가 G인 염기를 포함하는 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열로 이루어지는 다형성 분자 마커를 포함할 수 있다.

이러한 염기서열을 포함하는 다형성 분자 마커는 식방풍을 감별하기 위한 목적으로 이용될 수 있다.

각각의 다형성 분자 마커는 원방풍, 해방풍 또는 식방풍의 ITS 지역에 해당하는 연속적인 염기서열 부분 또는 그의 상보적인 염기서열 부분에 결합될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하기 위한 키트가 제공된다.

본 발명의 키트는 프라이머, 증폭반응 요소로서 디옥시뉴클레오티드 혼합물(dNTP mixture) 및 완충용액을 추가적으로 포함할 수 있으며, 아울러, Taq DNA 중합효소와 같은 열안정성 DNA 중합효소를 추가적으로 포함할 수 있다. 더 나아가 PCR 결과를 확인하는데 필요한 아가로스와 전기영동 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 상기 증폭반응 요소가 상기 프라이머 쌍과의 사전혼합물(premix) 형태로 제공될 수도 있으며, 상용화된 96 well plate를 활용하여, 원방풍, 해방풍 및 식방풍 기원식물 종감별용 분자마커 3종을 동시에 반응시켜 최대 30개 샘플의 혼입 여부를 한 번의 반응으로 판단할 수도 있다.

본 발명을 실시하기 위하여 사용되는 프라이머 쌍은, ITS 지역 유전자 내의 94 번째 염기, 101 번째 염기, 104 번째 염기, 222 번째 염기 및 226 번째 염기 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 염기를 포함하는 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열을 증폭할 수 있으며, 이러한 프라이머의 구체적인 염기서열은 서열번호 5 및 6을 참고할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 프라이머의 서열은 주형 DNA와 완전히 상보적일 필요는 없으나 주형 DNA와 특이적 결합을 형성하여 원하는 증폭 산물을 얻기 위해서 바람직하게는 80% 이상의 서열 상보성을 가지도록 설계되어 제작될 수 있으며, 더 바람직하게는 90% 이상의 서열 상보성을 가지도록 설계되어 제작될 수 있다

본 발명의 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하는 방법은, 시료로부터 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출된 DNA에서 ITS 지역 유전자 내의, 94 번째 염기, 101 번째 염기, 104 번째 염기, 222 번째 염기 및 226 번째 염기 중에서 적어도 하나 이상을 포함하는 부위를 증폭시키는 단계; 및 상기 증폭된 DNA에서 ITS 지역 유전자 내의, 94 번째 염기, 101 번째 염기, 104 번째 염기, 222 번째 염기 및 226 번째 염기 중에서 적어도 하나 이상을 비교하는 단계;를 포함한다.

상기 단계에서 증폭을 위한 방법으로서 중합효소 연쇄반응 (PCR)의 구체적인 실시는 실시예 3을 참조할 수 있다.

또 다른 구별 방법은, 추출된 DNA에서 ITS 지역 유전자 내의, 94 번째 염기, 101 번째 염기, 104 번째 염기, 222 번째 염기 및 226 번째 염기 중에서 적어도 하나 이상을 포함하는 부위를 증폭하여 염기서열을 비교하는 단계에 있어서, 상기 증폭 산물과 동일한 SNP 부분를 포함하는, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 다형성 분자마커와 혼성화하는 단계; 및 상기 혼성화 정도를 검출하는 단계;를 포함할 수 있다.

이러한 방법의 구체적인 실시 방법의 예시로서 실시간 중합효소 연쇄반응 (Real-Time PCR)을 이용하는 실시예 5 를 참조할 수 있으며, RT-PCR에서는 PCR의 증폭산물을 형광감도에 의해 검출할 수 있으므로, 이를 위하여 검출 방법으로서, intercalator를 이용하는 방법과 형광 표지 프루브를 이용하는 방법이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하는 것에 있어서, 구체적으로는 ITS 지역의 94 번째 염기가 C, 101 번째 염기가 C, 104 번째 염기가 T로 확인되는 경우, 또는 222 번째 염기가 A로 확인되는 경우에는 원방풍으로 감별한다.

또한, ITS 지역의 94 번째 염기는 T, 101 번째 염기는 T, 104 번째 염기는 C로 확인되는 경우, 또는 222 번째 염기가 T로 확인되는 경우에는 해방풍으로 감별한다.

반면, ITS 지역의 94 번째 염기는 C, 101 번째 염기는 T, 104 번째 염기는 T로 확인되는 경우, 또는 222 번째 염기가 G로 확인되는 경우에는 식방풍으로 감별한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하며, 이는 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 게노믹 DNA (genomic DNA) 추출

식품의약품안전청에서 원방풍 및 해방풍의 표준 시료를 분양 받았으며, 봉화 고랭지약초시험장에서 식방풍의 식물체를 수집하였다. 또한 국내에 유통되고 있는 원방풍 5구, 해방풍 5구, 식방풍 3구 및 별도 분류 표기가 없는 방풍 유통품 6구를 수집하였다 (표 2).

<표 2. 실시예에 이용된 원방풍, 해방풍 및 식방풍의 시료 내역>

게노믹 DNA (genomic DNA)를 추출하기 위하여, 건조된 뿌리 상태의 시료를 믹서기와 gyro shaker를 이용하여 분쇄한 후 DNA mini prep 키트를 이용하였다. (예를 들면 MACHEREY-NAGEL사의 NucleoSpin Plant II kit를 사용할 수 있다.)

또 다른 게노믹 DNA 추출을 위한 실시예로서, 구체적인 실시 방법은 다음과 같다.

약 100 mg의 건조된 약재의 뿌리 절편을 막자사발에 넣고 액체질소를 사용하여 미세분말 상태로 마쇄하고, 분말 시료를 500 ㎕의 lysis buffer에 넣고 10 ㎕ 프로테나아제 K를 첨가한 후, 37℃ 항온기에서 1시간 반응시킨 뒤 400 ㎕의 CTBA 완충용액 [50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 0.7 M NaCl, 50 mM EDTA (pH 8.0), 140 mM β-mercaptoethanol]와 혼합한 다음 65℃ 항온기에서 30분 간 처리하였다. 이 반응물에 페놀 : 클로로포름 : 이소아밀알콜 혼합액 (25 : 24 : 1) 600 ㎕를 넣어 위아래로 균질하게 잘 섞어 14,000 rpm으로 20℃에서 10 분간 원심분리하여 상등액 600 ㎕를 취하고 여기에 클로로포름 : 이소아밀알콜 혼합액 (24 : 1) 600 ㎕와 증류수 300 ㎕를 첨가하여 완전히 섞이도록 흔들어 준 다음, 14,000 rpm / 20℃에서 10 분 동안 원심분리하였다. 상등액 600 ㎕를 새 E-tube에 넣고 이소프로판올 600 ㎕를 첨가한 다음 수차례 인벌트한 뒤 10 분간 방치하여 14,000 rpm / 20℃에서 10 분간 원심분리 하였다. 침전된 DNA를 70% 에탄올 500 ㎕로 2∼3 회 세척하고 상온에서 자연건조시켰다. 건조된 DNA를 20∼30 ㎕ 멸균된 3차 증류수에 녹여 4℃에서 1 시간 동안 방치한 후 10 mg/ml RNase를 첨가하고 37℃ 항온기에서 1 시간동안 반응시켰다. 추출된 DNA를 1% 아가로오스 젤에서 전기영동하여 확인한 후 DNA 순도검정 및 정량을 실시하였다.

실시예 2 : ITS 부위 특이 프라이머 제작

ITS 부위 특이 프라이머 제작을 위하여, 하기의 표 3과 같은, 곰팡이 균과 식물에서 광범위하게 이용되는 ITS universal primer를 이용하여 ITS1 및 ITS2 부위 증폭용 프라이머를 제작하였다.

<표 3. ITS 지역 DNA 증폭을 위한 프라이머 서열>

수집 한약재를 대상으로 PCR (Polymerase Chain Reaction, 중합효소 연쇄반응)을 이용하여 DNA를 증폭하기 위하여 추출 및 정제된 게노믹 DNA와 ITS1, ITS4 프라이머 세트를 이용하였다.

또 다른 측면에서, 한약재 기원식물의 ITS 부위 염기서열 증폭에 최적화시키기 위하여, ITS 부위 DNA 증폭용 프라이머 염기서열을 조정하여 ITS1, ITS4 프라이머 염기서열 및 베이스페어 개수를 변경한 ITS_SF18, ITS_SR19 프라이머를 제작하였다.

<표 4. 변형된 프라이머 ITS_SF18, ITS_SR19 >

실시예 3 : 수집된 약재의 ITS 부위 DNA 증폭을 위한 중합효소 연쇄반응 (PCR)

수집된 약재의 ITS 부위의 DNA를 증폭하기 위하여 중합효소 연쇄반응을 이용하며, 구체적인 실험 방법은 다음과 같다.

수집 약재로부터 분리 정제된 지노믹 DNA의 증폭반응용 용액은 ITS1 프라이머 (5 pmole) 1 ㎕, ITS4 프라이머 (5 pmole) 1 ㎕, dNTP (10 mM) 2 ㎕, 10 X PCR buffer 5 ㎕, Taq polymerase (2 units) 0.5 ㎕와 주형 DNA (10 ng/㎕) 5 ㎕를 혼합하여 사용하며 반응 부피는 50 ㎕로 하였다. 유전자 증폭을 위한 중합효소 연쇄 반응 (PCR, Polymerase Chain Reaction)은 94℃에서 5분간 전처리 (predenaturation)한 후, 94℃에서 30초간 변성 (denaturation), 60℃에서 45초간 결합 (annealing), 72℃에서 60초간 증폭 (extension)으로 이루어지는 과정을 40회 반복하고, 72℃에서 10분간 최종 증폭 (final extension)시키는 조건으로 이루어졌다 (표 5). 증폭된 DNA 절편은 1.5% 아가로오스 젤에 점적하여 전기영동한 다음 EtBr 염색법으로 처리하여 증폭 밴드를 확인하였다.

<표 5. ITS 지역 DNA를 증폭하기 위한 PCR 반응 조건 및 반응액 조성>

실시예 4 : 수집된 약재들로부터 증폭된 ITS 부위 DNA의 염기서열 비교 분석

ITS1 프라이머와 ITS4 프라이머로 증폭된 DNA의 염기서열을 분석하여 정렬 및 비교하였다. DNA 염기서열 분석은 바이오니아 (주)에 의뢰하여 BigDyeTM terminator Cyclic Sequencing Reaction을 통하여 제공받았다. 이미 공개되어 있는 염기서열과 비교 분석을 하기 위하여 NCBI (National Center for Biotechnology Information)에서 제공하는 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)을 이용하였다.

실시예 5 : 원방풍, 해방풍 및 식방풍 기원식물 종감별을 위한 실시간 중합효소 연쇄반응 (Real-Time PCR)

실시간 중합효소 연쇄반응에 최적화시키기 위하여 ITS1, ITS2 프라이머의 염기서열 및 베이스페어 개수를 일부 변형한 ITS_SF18, ITS_SR19 프라이머를 제작하여 사용하였다 (표 4). 반응 용액은 QuantiTaq Probe Mastermix (Qiagen) 12.5 ㎕, ITS_SF18 프라이머 (5 pmoles/㎕) 1 ㎕, ITS_SR19 프라이머 (5 pmoles/㎕) 1 ㎕, 형광 분자마커 (5 pmoles/㎕) 1 ㎕ 및 정제한 주형 DNA (10 ng/㎕) 5 ㎕를 혼합하고 3차 증류수 4.5 ㎕를 첨가하여 제조하였으며, 최종 반응 부피는 25 ㎕로 하였다 (표 6). 실시간 중합효소 연쇄반응은 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems) 기계를 이용하며 반응조건은 95℃에서 15 분 (Enzyme Activation) 처리한 후, 95℃에서 15 초 (Denaturation), 60℃에서 1 분 (Annealing and Extension) 조건으로 40회 반복하여 유전자를 증폭시켰다 (표 7).

<표 6. 실시간 중합효소 연쇄반응 (Real-time PCR)을 위한 반응액 조성>

<표 7. 실시간 중합효소 연쇄반응 (Real-time PCR) 조건>

실시예 6 : ITS 부위 DNA 염기서열 비교 분석

1) NCBI 등록 염기서열과 비교

수집된 원방풍, 해방풍 및 식방풍 시료의 ITS-1 부위, 5.8S rDNA 및 ITS-2 부위 DNA 염기서열을 분석하여 NCBI에 이미 등록된 원방풍, 해방풍 및 식방풍의 염기서열과 비교하였다. 도 2에서 나타낸 바와 같이, 수집 시료 중 01, 03번 시료의 염기서열이 NCBI에 등록된 Saposhnikovia divaricata의 염기서열 중 AB570260, FJ609730, EU164927, AY863062, AY925160, AF495838 (accession number)의 염기서열과 일치하였다. 도 3에서 나타낸 바와 같이 수집 시료 02, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 10, 11, 12, 19번 시료의 염기서열은 NCBI에 등록된 Glehnia littoralis 염기서열 FJ593179, EU164928과 일치하였다. 도 4에서 나타낸 바와 같이 13, 17번 시료의 염기서열은 NCBI에 등록된 Peucedanum japonicum의 염기서열 JF977807, JF977805, JF977806, AF495826, EU224273과 일치하였다.

2) 원방풍, 해방풍 및 식방풍의 SNP (Single Nucleotide polymorphism, 단일염기다형) 분석

국내 유통 원방풍, 해방풍 및 식방풍의 18S rDNA의 3' 말단 부위 일부, ITS1 부위, 5.8S rDNA, ITS2 부위 및 36S rDNA의 5' 말단부위 일부를 포함하는 총 629 bp의 유전자 절편에 대한 염기서열을 상호 비교한 결과 94 번째 염기, 101 번째 염기, 104 번째 염기, 222 번째 염기 및 226 번째 염기에서 SNP 위치가 확인되었다(표 1 참조).

실시예 7 : 프라이머 및 형광 분자마커 디자인

실시간 중합효소 연쇄반응 (Real-time PCR)에 적합하도록 ITS-1 부위의 DNA를 증폭할 수 있는 총 18 bp의 길이를 가지는 ITS_SF18 프라이머와 총 19 bp의 길이를 가지는 ITS_SR19 프라이머를 디자인하였다. 원방풍 특이 형광 분자마커는 염기서열 90 bp부터 112 bp (도 1 에 비교된 염기서열 기준)에 해당하는 부위의 센스 DNA 가닥에 결합할 수 있도록 디자인하였으며, 해방풍 특이 형광 분자마커는 염기서열의 216 bp부터 234 bp에 해당하는 부위, 식방풍 특이 형광 분자마커는 216 bp부터 235 bp에 해당하는 부위의 안티센스 DNA 가닥에 결합할 수 있도록 제작되었다

RT-PCR에서는 PCR의 증폭산물을 형광감도에 의해 검출하며, 대표적인 형광을 이용한 검출 방법에는 인터칼레이터(intercalator)를 이용하는 방법과 형광 표지 프루브를 이용하는 방법이 있다.

인터칼레이터(interchelator)로서 일반적으로 SYBR Green I을 사용 하며, 이 물질은 이중가닥 DNA에 결합해 형광을 발하는 시약이다. PCR 반응으로 합성된 이중가닥 DNA에 결합하여 형광을 발하며 이 형광강도를 검출하여 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있다.

형광표지 프루브는 많은 종류가 있으며, Linear probe (ex: Taqman probe), structured probe (Molecular Beacon), Cycling probe등이 있다.

1) 원방풍 및 해방풍 식방풍 감별을 위한 실시간 중합효소 연쇄반응 (Real-time PCR) 결과

ITS_SF18, ITS_SR19 프라이머 세트와 BPW_Pb_FAM 형광 분자마커, BPH_Pb_1_RC_FAM 형광 분자마커, BPS_Pb_1_RC_FAM 형광 분자마커를 이용하여 국내 수집 원방풍, 해방풍, 식방풍 시료에 대하여 각각 실시간 중합효소 연쇄반응 (Real-time PCR) 실험을 한 결과, 원방풍, 해방풍 및 식방풍 각각에 대하여, PCR cycle 수에 따른 형광물질의 검출을 나타내는 그래프인 도 5 내지 도 7에서 볼 수 있듯이 감별이 효과적으로 이루어질 수 있는 것을 확인할 수 있다.

2) 국내 유통 방풍 시료에 대한 감별 방법 적용 결과

국내 시중에서 유통되고 있는 18구의 약재 시료를 대상으로 종감별 실험을 한 결과, '원방풍' 표기 유통 약재 5구 중 원방풍 시료는 1구에 불과하였으며 나머지 4구는 해방풍으로 밝혀졌다. 또한 '방풍'으로 표기되어 유통되는 6구에 대한 실험 결과, 원방풍 1구, 해방풍 1구, 식방풍 4구로 판명되었다 (표 8).

<표 8. 국내 유통 방풍 약재에 대한 종감별 실험 결과 예시>

3) 실시간 중합효소 연쇄반응 (Real-time PCR)에 의한 기원식물 종감별 조건

실시간 중합효소 연쇄반응 종료 후, 7500 system SDS software window상에서 Result tab을 누른 후 Amplification plot을 누르고 마우스의 오른쪽 키를 사용하여 Graph setting 창을 열고 post run setting 조건을 log에서 linear로 변경한다, post run setting 조건을 변경한 후 Graph setting창을 닫으면 실시간 증폭된 Amplification plot를 확인 할 수 있다. 각각의 기원 식물 특이적인 증폭 반응의 결과는 Amplification plot상의 analysis setting 값(base line 범위와 threshold 값)의 조절에 의해 판정한다. 실시간 중합효소 연쇄반응 (Real-time PCR) 종료 후, 각 기원식물에 해당하는 결과 프로파일(Amplification plot)과 결과 판정을 위한 analysis setting 값 조건은 하기의 표 9 내지 표 11과 같다.

<표 9. 원방풍 기원식물 종감별 결과 확인 및 판정 조건>

<표 10. 해방풍 기원식물 종감별 결과 확인 및 판정 조건>

<표 11. 식방풍 기원식물 종감별 결과 확인 및 판정 조건>

<110> KT&G Corporation <120> SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM MARKER FOR IDENTIFICATION OF S.DIVARICATA, G.LITTORALIS AND P.JAPONICUM AND IDENTIFICATION METHOD USING THE SAME <130> APC-2013-0229 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 300 <212> DNA <213> Saposhnikovia divaricata <400> 1 tgcggaagga tcattgtcga atcctgcaac agcagaatga cccgctaaca cgtcaacaat 60 ttgggcaagc gtcggggggc ctcggtctcc tgtctgcgaa cccttggtag gtggccactc 120 ccgggtggcc actggccttc aaaatcattc gggcgcggaa tgcgccaagg accttaaaaa 180 ctgaattgta cgtccgtatc ccgttagcgg gcagcggcgt cattctaaaa cacaacgact 240 ctcgacaacg gatatctcgg ctctcgcatc gatgaagaac gtagcgaaat gcgatacttg 300 300 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS_SF18 <400> 2 ctgtctgcga acccttggt 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BPH_Pb_1_RC_FAM <400> 3 tgtgttttgg aaagacgcc 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BPS_Pb_1_RC_FAM <400> 4 ttgtgtttta gaacgacgcc 20 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS_SF18 <400> 5 tgcggaagga tcattgtc 18 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS_SR19 <400> 6 ttcttcatcg atgcgagag 19

Claims

서열번호 1로 기재되는 방풍의 ITS 지역 유전자 내에서, 94 번째 염기, 101 번째 염기, 104 번째 염기, 222 번째 염기 및 226 번째 염기 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 염기를 포함하는 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열로 이루어지는 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하기 위한 다형성 분자 마커.
제1항에 있어서,
상기 다형성 분자 마커는 10 내지 100 개의 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열로 이루어지는 것인, 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하기 위한 다형성 분자 마커.
제1항에 있어서,
상기 다형성 분자 마커는 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4 인, 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하기 위한 다형성 분자 마커.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 94 번째 염기는 C, 101 번째 염기는 C, 104 번째 염기는 T인, 염기를 포함하는 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열로 이루어지는 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하기 위한 다형성 분자 마커.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 222 번째 염기는 A인, 염기를 포함하는 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열로 이루어지는 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하기 위한 다형성 분자 마커.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 94 번째 염기는 T, 101 번째 염기는 T, 104 번째 염기는 C인, 염기를 포함하는 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열로 이루어지는 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하기 위한 다형성 분자 마커.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 222 번째 염기는 T인, 염기를 포함하는 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열로 이루어지는 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하기 위한 다형성 분자 마커.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 94 번째 염기는 C, 101 번째 염기는 T, 104 번째 염기는 T인, 염기를 포함하는 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열로 이루어지는 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하기 위한 다형성 분자 마커.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 222 번째 염기는 G인, 염기를 포함하는 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열로 이루어지는 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하기 위한 다형성 분자 마커.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 다형성 분자 마커를 포함하는, 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하기 위한 키트.
서열번호 1 로 기재되는 방풍의 ITS 지역 유전자 내에서, 94 번째 염기, 101 번째 염기, 104 번째 염기, 222 번째 염기 및 226 번째 염기 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 염기를 포함하는 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열을 증폭할 수 있는, 프라이머 쌍
제11항에 있어서,
상기 프라이머 쌍은 서열번호 5 및 6을 갖는 것인, 프라이머 쌍.
시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
상기 추출된 DNA에서 ITS 지역 유전자 내의, 94 번째 염기, 101 번째 염기, 104 번째 염기, 222 번째 염기 및 226 번째 염기 중에서 적어도 하나 이상을 포함하는 부위를 증폭시키는 단계; 및
상기 증폭된 DNA에서 ITS 지역 유전자 내의, 94 번째 염기, 101 번째 염기, 104 번째 염기, 222 번째 염기 및 226 번째 염기 중에서 적어도 하나 이상을 비교하는 단계;를 포함하는, 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하는 방법.
시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
상기 추출된 DNA에서 ITS 지역 유전자 내의, 94 번째 염기, 101 번째 염기, 104 번째 염기, 222 번째 염기 및 226 번째 염기 중에서 적어도 하나 이상을 포함하는 부위를 증폭시키는 단계;
상기 증폭 산물과 동일한 SNP 부분를 포함하는, 제1항의 다형성 분자마커와 혼성화하는 단계; 및
상기 혼성화 정도를 검출하는 단계;를 포함하는, 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하는 방법.
제13항 또는 제14항에 있어서,
상기 94 번째 염기는 C, 101 번째 염기는 C, 104 번째 염기는 T로 확인되는 경우, 원방풍으로 감별하는 것인, 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하는 방법.
제13항 또는 제14항에 있어서,
상기 222 번째 염기는 A로 확인되는 경우, 원방풍으로 감별하는 것인, 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하는 방법.
제13항 또는 제14항에 있어서,
상기 94 번째 염기는 T, 101 번째 염기는 T, 104 번째 염기는 C로 확인되는 경우, 해방풍으로 감별하는 것인, 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하는 방법.
제13항 또는 제14항에 있어서,
상기 222 번째 염기는 T로 확인되는 경우, 해방풍으로 감별하는 것인, 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하는 방법.
제13항 또는 제14항에 있어서,
상기 94 번째 염기는 C, 101 번째 염기는 T, 104 번째 염기는 T로 확인되는 경우, 식방풍으로 감별하는 것인, 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하는 방법.
제13항 또는 제14항에 있어서,
상기 222 번째 염기는 G로 확인되는 경우, 식방풍으로 감별하는 것인, 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하는 방법.