KR101271822B1 - 감 품종 판별용 프라이머 세트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 감 품종 판별용 프라이머 세트에 관한 것으로, 감 품종들을 대상으로 양적 형질 및 질적 형질에 대한 형태적 유연관계를 분석하고, EST-SSR 부위를 선발하고, 이를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 이용하여 감 품종들 간의 유전적 유연관계를 분석함으로써 감 품종 구분과 형질관련 및 감 품종 육종에 활용에 이용할 수 있다.

Description

감 품종 판별용 프라이머 세트{Primer sets for distinguishing persimmon cultivars}
본 발명은 감 품종을 판별할 수 있는 EST-SSR 프라이머 세트에 관한 것이다.
전세계에 분포하는 감나무 속 (Diospyros) 식물은 대략 190여 종이다. 그 중 과수로 이용되고 있는 것은 감 (Diospyros kaki Thunb.), 고욤 (Diospyros lotus L.), 미국감 (Diospyros virginiana L.), 유시 (Diospyros oleifera Cheng.) 등 4종이다 (Hwang et al., J. Life . Sci. 20(4):632-638, 2010; Lim et al., Korean J. Pesticide Sci. 12(4):414-420, 2008). 감의 가공품인 곶감의 소비가 증가하면서 재배면적과 생산량이 증가하고 있지만 생산비용으로 인해 가격이 저렴한 수입품이 늘어나고 있는 실정이다. 그 예로 곶감의 2010년 10월까지의 누적수입량은 2,494톤으로 2009년에 비해 42% 증가하였다. 감의 형태적으로 구분하는 방법에 있어서 식품 (예를 들어, 곶감 등)을 만든 후에는 식별이 불가능하기 때문에 이를 악용하여 중국산 감을 이용해 식품을 제조 후 판매하는 행위가 일어나고 있으며 이로 인해 판매자와 소비자의 피해가 증가하고 있다. 이런 문제들을 해결하는 데 있어 모든 생물이 고유하게 가지는 DNA 정보의 활용은 단시간에 재현성 높은 결과를 줄 수 있다는 점에서 매우 유용하다고 할 수 있다 (Cho et al ., Kor . J. Hort . Sci . Technol. 25(2):114-118, 2007). 지금까지 식물 종 구분을 위하여 사용된 DNA 마커에는 DNA 제한효소를 사용해 생성된 단편들을 이용하는 RFLP (restriction fragment length polymorphism), 9~11bp의 짧은 임의의 프라이머를 이용해 PCR을 통해 PCR 산물을 분석하는 RAPD (random amplified polymorphic DNAs), 제한효소로 절단된 DNA의 단편들에 어댑터 (adaptor)를 붙인 후 표식부위의 염기서열을 바탕으로 제작한 프라이머를 이용해 PCR 후 그 산물을 분석하는 AFLP (amplified fragment length polymorphism), 4~10회 반복된 염기서열을 바탕으로 특정 프라이머에 의해 식물체 게놈 상의 반복된 염기서열이 상보적으로 증폭되어 품종간 다형성을 나타내며 재현성이 높은 SSR (simple sequence repeat) 등이 있다. 최근에 개발된 다양한 조직에서 발현되는 유전자에 대한 대량의 정보를 알아내고 실제 발현되는 유전자를 근거로 유전자의 기능을 이해할 수 있을 뿐만 아니라, 염색체 위치를 밝히는데 유용한 EST (expressed sequence tags)-SSR 분석법이 있다 (Kim et al., Kor . J. Hort . Sci . Technol. 28(4):618-626, 2010; Oh et al ., Kor . J. Hort. Sci . Technol. 28(6):1025-1038, 2010; Qureshi et al ., J. Cotton Sci. 8:112-123, 2004). 최근 들어서는 감을 재료로 DNA 마커를 이용한 유전적 분석은 RAPD (Je et al , Kor . J. Hort . Sci . Technol. 27(3):448-455, 2009; Yamagishi et al., Sci . Hor. 105:283-290, 2005; Yyldyz et al ., Afr . J. Biotechnol. 6(20):2393-2399, 2007), AFLP (Cho et al , Kor . J. Hort . Sci . Technol. 25(2):114-118, 2007), RFLP (Hu et al ., Sci . Hor. 117:32-38, 2008), SSR (Hwang et al , J. Life . Sci. 20(4):632-638, 2010; Guo et al ., Plant Sci. 170:528-533, 2006; Naval et al ., Tree Genetics & Genomes 6:677-687, 2010; Zhang et al ., Bio. & Bio. 23(4):1474-1478, 2009)을 이용해 분석한 바 있지만 AFLP 분석과 RAPD 분석은 실험의 어려움과 재현성 여부가 문제점이 있으며, 연구에 사용된 재료가 주로 일본이나 중국품종이어서 우리 실정에 맞지 않으며 PCR에 사용된 프라이머도 외국에서 개발한 프라이머를 사용해 우리나라 품종을 분석하였다 (Hwang et al , J. Life. Sci. 20(4):632-638, 2010). 이런 품종 구분에 쓰인 마커는 고유의 것이 아니어서 앞으로 상업화가 된다면 로열티 문제가 야기된다.
따라서, 본 발명은 경북농업기술원 감시험장에서 수집한 감 품종을 재료로 품종구분 및 유전자 기능도 탐색할 수 있는 EST-SSR 마커를 개발하고 수집된 종들의 유연관계를 분석하여 육종의 기초자료로 활용하고자 한다.
Cho, D, H. 등, 2007, Genetic relationships of Korean astringent persimmon varieties using AFLP analysis. Kor. J. Hort. Sci. Technol. 25(2):114-118쪽 Guo, D. 등, 2006. Genetic relationships of Diospyros kaki Thunb. And related species revealed by IRAP and REMAP analysis. Plant Sci. 170:528-533쪽 http://www.seed.go.kr. 2007. Persimmon (Diospyros kaki L.) Hu, D. 등, 2008. Phylogenetic analysis in some Diospyros spp. (Ebenaceae) and Japanese persimmon using chloroplast DNA PCR-RFLP markers. Sci. Hor. 117:32-38쪽 Hwang, J, H. 등, 2010. Evaluation of genetic diversity among persimmon cultivars(Diospyros Kaki Thunb.) using Microsatellite markers. J. Life. Sci. 20(4):632-638쪽 Je, H, J. 등, 2009. Evaluation of genetic relationships among persimmon cultivars introduced and indigenous in Korea using RAPD. Kor. J. Hort. Sci. Technol. 27(3):448-455쪽 Kim, C, S. 등, 1997. A simple and rapid method for isolation of high quality genomic DNA from fruit trees and conifets using PVP. Nuc. Aci. Res. 25(5):1085-1086쪽 Kim, J, K. 등, 2010. Skewed inheritance of EST-SSR alleles in reciprocal crosses of cut roses. Kor. J. Hort. Sci. Technol. 28(4):618-626쪽 Lim, T, H. 등, 2008. Survey of actual condition of management of persimmon orchards in sangju, Gyeongbuk in 2007 and 2008. Korean J. Pesticide Sci. 12(4):414-420쪽 Naval, M. D. M. 등, 2010. Analysis of genetic diversity among persimmon cultivars using microsatellite markers. Tree Genetics & Genomes 6:677-687쪽 Oh, G, D. 등, 2010. EST profiling for seed, hair characteristic and development of EST-SSR and SNP markers in carrot. Kor. J. Hort. Sci. Technol. 28(6):1025-1038쪽 Qureshi, S, N. 등, 2004. EST-SSR: A new class of genetic markers in cotton. J. Cotton Sci. 8:112-123쪽 Yamagishi, M. 등, 2005. Identification of persimmon(Diospyros Kaki) cultivars and phonetic relationships between Diospyros species by more effective RAPD analysis. Sci. Hor. 105:283-290쪽 Yyldyz, M. 등, 2007. Molecular diversity in persimmon(Diospyros Kaki L.) cultivars growing around Hatay province in Turkey. Afr. J. Biotechnol. 6(20):2393-2399쪽 Zhang, Y. F. 등, 2009. Development of Japanese persimmon core collection by Genetic distance sampling based on SSR markers. Bio. & Bio. 23(4):1474-1478쪽
본 발명의 목적은 국내 감 품종을 구분하고 유전자 기능을 탐색할 수 있는 EST-SSR 부위를 증폭할 수 있는 프라이머 세트 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열목록 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트, 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트, 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트, 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트, 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트, 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트, 서열번호 13 및 14의 프라이머 세트, 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트, 서열번호 17 및 18의 프라이머 세트, 서열번호 19 및 20의 프라이머 세트, 서열번호 21 및 22의 프라이머 세트, 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트, 서열번호 25 및 26의 프라이머 세트, 서열번호 27 및 28의 프라이머 세트, 서열번호 29 및 30의 프라이머 세트 및 서열번호 31 및 32의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 감 품종 판별용 EST-SSR(expressed sequence tags-simple sequence repeat) 프라이머 세트를 제공한다.
상기 프라이머 세트는 반복서열 (CGCAA)2, (TTGCG)2, (A)20, (AA)5, (T)11, (ATACTC)2, (T)10, (CTTCC)2, (GGAAG)2 또는 (T)12 중 어느 하나를 증폭할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 감 품종 판별용 EST-SSR(expressed sequence tags-simple sequence repeat) 프라이머 세트를 포함하는 감 품종 판별용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한
판별하고자 하는 감 시료의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭시키는 단계; 및
상기 단계에서 얻은 PCR 산물의 발현 패턴을 분석하고, 상기 프라이머 세트에 의한 감 품종별 기준 패턴과의 상동성 동정을 통해 감 품종을 판별하는 단계를 포함하는 감 품종의 판별방법을 제공한다.
본 발명은 감 품종들 간의 유전적 유연관계를 분석할 수 있는 EST-SSR 프라이머 세트를 이용하여 정확하고 신속하게 국내산 감 품종을 구분하고, 형태적 양적 및 질적 형질을 통해 형태적 유연관계를 분석함으로써 형질관련 및 감 품종 육종에 활용할 수 있다.
도 1은 6개의 양적 형질(과실크기, 과고, 과경, 과경굵기, 과경길이, 종자크기) 별 감 수집종들의 분포를 나타낸 그래프이다.
도 2 내지 4는 19개의 질적 형질(횡단면, 종단면, 옆에서 본 일반적 모양, 골의 정도, 정부의 얕은 동심원 균열, 정부 열과, 세로 홈, 꽃받침 끝의 주름, 배꼽 홈 깊이, 꽃받침 쪽의 홈, 꽃받침 크기, 꽃받침의 자세, 표면색, 과육색, 과육의 갈색반점, 종자의 측면 모양, 종자의 색깔, 떫은맛, 과즙) 별 감 수집종들의 분포를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 EST-SSR 부위를 증폭할 수 있는 P66-71 프라이머 세트를 이용한 감 품종별 PCR 증폭 결과를 나타낸 것이다(레인 M: 사이즈 마커, 레인 1 내지 42는 각각 1: 영동먹감(Yeongdongmeoggam), 2: 밀양물감(Miryangmulgam), 3: 영덕상시(Yeongdeogsangsi), 4: 영덕태백감(Yeongdeogttabaegam), 5: 상주수수감(Sangjususugam), 6: 상주구설감(Sangjuguseulgam), 7: 상주수꽃감(Sangjusukkochgam), 8: 산청단성찰감(Sancheongdanseongchalgam), 9: 안동수시감(Andongsusigam), 10: 봉화골감(Bonghwagolgam), 11: 봉화반시(Bonghwabansi), 12: 산청고동시(Sancheonggodongsi), 13: 안동쪽감(Andongjjoggam), 14: 영주고종시(Yeongjugojongsi), 15: 영주동우감(Yeongjudongugam), 16: 선사환(Seonsahwan), 17: 애랑(Aerang), 18: 밀양개반시(Miryanggaebansi), 19: 밀양고동시(Miryanggodongsi), 20: 밀양반시(Miryangbansi), 21: 예천부채감(Yecheonbuchaegam), 22: 갑주백목(Gabjubaegmog), 23: 성주먹감(Seongjumeoggam), 24: 예천수시(Yecheonsusi), 25: 스퍼평핵무(Seupeopyeonghaegmu), 26: 산청두리감(Sancheongduligam), 27: 산청찰감(Sancheongchalgam), 28: 영동반시(Yeongdongbansi), 29: 산청단성시(Sancheongdanseongsi), 30: 영동수시(Yeongdongsusi), 31: 삼랑좌(Samrangjwa), 32: 산청대곡시(Sancheongdaegoksi), 33: 밀수감(Milsugam), 34: 예산반시(Yesanbansi), 35: 신추(Sinchu), 36: 상추감(Sangchugam), 37: 뾰조리(Ppyojori), 38: 시흥고종시(Siheunggojongsi), 39: 서조(Seojo), 40: 산청꾸리감(Sancheongkkurigam), 상주원시(Sangjuwonsi), 41: 박 36(Park 36)를 나타냄).
도 6은 25 형태적 특징들에 따른 감 수집종들의 계통수를 도시한 것이다.
도 7은 UPGMA 및 EST-SSR 프라이머 세트를 이용하여 구축된 감 수집종들의 계통수를 도시한 것으로 주요 그룹들은 계통수의 왼쪽에 표시하고, 하단의 스케일은 유사도의 Jaccard's 계수를 나타낸 것이다.
도 8은 멘텔 테스트를 이용하여 유전적 분석 (EST-SSR 프라이머 세트) 및 형태적 분석의 유사도 거리를 비교한 것으로 검은색 원은 형태를, 흰색 원은 EST-SSR이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 서열목록 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트, 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트, 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트, 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트, 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트, 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트, 서열번호 13 및 14의 프라이머 세트, 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트, 서열번호 17 및 18의 프라이머 세트, 서열번호 19 및 20의 프라이머 세트, 서열번호 21 및 22의 프라이머 세트, 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트, 서열번호 25 및 26의 프라이머 세트, 서열번호 27 및 28의 프라이머 세트, 서열번호 29 및 30의 프라이머 세트 및 서열번호 31 및 32의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 감 품종 판별용 EST-SSR(expressed sequence tags-simple sequence repeat) 프라이머 세트에 관한 것이다.
본 발명의 프라이머 세트는 국내산 감 품종 간 유전적 유연관계를 분석하여 미지의 감 시료로부터 품종을 판별할 수 있는 것을 특징으로 한다.
상기 프라이머 세트는 각각 정방향과 역방향 프라이머 쌍으로서 반복서열 (CGCAA)2, (TTGCG)2, (A)20, (AA)5, (T)11, (ATACTC)2, (T)10, (CTTCC)2, (GGAAG)2 또는 (T)12 중 어느 하나를 증폭시킬 수 있다.
상기 프라이머 세트는 말단, 바람직하게는 정방향 프라이머의 5'말단이 방사성 또는 형광물질로 표지하여 사용할 수 있다.
상기 형광물질은 특별히 제한하지는 않으나 FAM, Hex, 또는 Ned 중 어느 하나를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 EST-SSR 프라이머 세트는 국내산 감을 대상으로 게놈 DNA를 추출하고, 이로부터 cDNA 라이브러리를 제조하여 시퀀스를 분석한 후, EST 상의 SSR 부위를 분석하고, 상기 SSR 부위를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제조하여 이로부터 증폭된 밴드의 유무에 따라 나타난 밴드는 1로 하고, 나타나지 않은 밴드는 0으로 하여 유전적 다양성 지표인 다형성 정보량 (PIC) 값을 분석하여 감 품종 간 다형성 (polymorphism)을 분석함으로써 PIC 값이 높은 프라이머 세트를 선발함으로써 얻을 수 있다.
상기 프라이머 세트를 이용하여 유전적 유연관계를 분석하거나, 품종을 판별할 수 있는 국내산 감 품종은 영동먹감(Yeongdongmeoggam), 밀양물감(Miryangmulgam), 영덕상시(Yeongdeogsangsi), 영덕태백감(Yeongdeogttabaegam), 상주수수감(Sangjususugam), 상주구설감(Sangjuguseulgam), 상주수꽃감(Sangjusukkochgam), 산청단성찰감(Sancheongdanseongchalgam), 안동수시감(Andongsusigam), 봉화골감(Bonghwagolgam), 봉화반시(Bonghwabansi), 산청고동시(Sancheonggodongsi), 안동쪽감(Andongjjoggam), 영주고종시(Yeongjugojongsi), 영주동우감(Yeongjudongugam), 선사환(Seonsahwan), 애랑(Aerang), 밀양개반시(Miryanggaebansi), 밀양고동시(Miryanggodongsi), 밀양반시(Miryangbansi), 예천부채감(Yecheonbuchaegam), 갑주백목(Gabjubaegmog), 성주먹감(Seongjumeoggam), 예천수시(Yecheonsusi), 스퍼평핵무(Seupeopyeonghaegmu), 산청두리감(Sancheongduligam), 산청찰감(Sancheongchalgam), 영동반시(Yeongdongbansi), 산청단성시(Sancheongdanseongsi), 영동수시(Yeongdongsusi), 삼랑좌(Samrangjwa), 산청대곡시(Sancheongdaegoksi), 밀수감(Milsugam), 예산반시(Yesanbansi), 신추(Sinchu), 상추감(Sangchugam), 뾰조리(Ppyojori), 시흥고종시(Siheunggojongsi), 서조(Seojo), 산청꾸리감(Sancheongkkurigam), 상주원시(Sangjuwonsi), 또는 박 36(Park 36) 중 어느 하나일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
표 3을 참조하여 설명하면, 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트(EST-SSR 명칭: P52-109에 해당)를 이용하여 감 품종들에 대해 PCR 증폭할 경우, 증폭된 PCR 산물은 서열 내에 반복서열 (CGCAA)2를 포함하고, 젤 전기영동을 실시할 경우, 59, 280, 287, 298 bp 크기의 밴드를 나타낸다. 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트(P52-107에 해당)를 이용하여 PCR 증폭할 경우, 증폭된 PCR 산물 내에는 반복서열 (TTGCG)2를 포함하고, 젤 전기영동을 실시할 경우, 53, 62, 364, 410, 434, 460 bp 크기의 밴드를 나타낸다. 이러한 형태로 각 프라이머 세트들은 PCR 증폭 시 총 63개의 밴드를 확인할 수 있고, 각 프라이머 세트들은 총 2 내지 5개의 밴드들을 특이적으로 나타내며, 각 밴드는 42bp ~ 640bp까지 분포하였으며, 감 품종마다 차이가 확실한 밴드를 확인할 수 있다(도 5 참조). 상기 프라이머 세트에서 증폭된 밴드의 유무에 따라 나타난 밴드는 1로 하고, 나타나지 않은 밴드는 0으로 하여 유전적 다양성 지표인 다형성 정보량 값을 분석한 결과, 이들의 PIC 값 (대립인자 다형성에 미치는 값)은 0.000~에서 0.880까지 분포하고 있으며, 평균 0.672이며, PIC 값이 0.7 이상의 것은 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트 (P52-109), 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트 (P52-107), 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트 (P52-58), 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트 (P52-97), 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트 (P66-61), 서열번호 17 및 18의 프라이머 세트 (P66-67), 및 서열번호 31 및 32의 프라이머 세트 (P66-132)로 이들은 보다 특이적으로 감 품종을 구별하는데 사용될 수 있다.
상기 프라이머 세트들을 이용하여 감 품종별 PCR 증폭을 실시하고, 각 프라이머 세트에 대한 감 품종들의 특이 발현 패턴들을 분석하여 품종간 유사도를 비교하여 유연관계를 분석할 수 있다.
또한, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 미지의 감 시료의 발현 패턴과 상기 감 품종별 특이 발현 패턴을 비교함으로써 감 품종을 판별할 수 있는 것이다.
상기 프라이머 세트를 이용하여 실시하는 PCR 조건은 90 내지 97 ℃, 3 내지 7분간 반응하고 다시 90 내지 97 ℃에서 20초 내지 1분, 56~58 ℃에서 20초 내지 1분, 72 ℃ 30초 내지 1분으로 30 내지 40 사이클로 증폭하고 72 ℃ 5분간 추가로 반응시켜 실시할 수 있으나, 당업자의 기술 수준에서 이해할 수 있는 통상의 방법에 따라 수행될 수 있어 특별히 제한하지는 않는다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 감 품종 판별용 EST-SSR(expressed sequence tags-simple sequence repeat) 프라이머 세트를 포함하는 감 품종 판별용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 감 품종 판별용 EST-SSR 프라이머 세트는 감 품종에 따라 다형성을 나타내는 DNA 영역을 증폭할 수 있어 PCR 산물의 발현 패턴과 상기 EST-SSR 프라이머 세트에 의한 감 품종별 기준 패턴의 상동성 동정을 통해 미지의 감 시료의 품종을 판별할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트에는 분석을 수행하기 위한 사용설명서(예, 서면, 테이프, VCR, CD-ROM 등)가 포함될 수 있다. 상기 키트의 분석 포맷은 당해 기술분야에 알려진 아가로우즈 젤 전기영동, 형광 분석 등을 통한 발광 또는 형광 이미지이다.
본 발명은 또한
판별하고자 하는 감 시료의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭시키는 단계; 및
상기 단계에서 얻은 PCR 산물의 발현 패턴을 분석하고, 상기 프라이머 세트에 의한 감 품종별 기준 패턴과의 상동성 동정을 통해 감 품종을 판별하는 단계를 포함하는 감 품종의 판별방법에 관한 것이다.
본 발명의 감 품종의 판별방법을 단계별로 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
제1단계는 판별하고자 하는 감 시료에서 추출한 게놈 DNA를 대상으로 본 발명의 EST-SSR 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭하는 것이다.
상기 게놈 DNA의 추출은 당업자가 이해하는 기술 수준에서 추출할 수 있어 특별히 제한하지는 않는다.
상기 프라이머 세트는 방사성 또는 형광물질이 표지된 것을 사용할 수 있다.
상기 PCR 증폭 조건은 당업자의 기술 수준에서 이해할 수 있는 통상의 방법에 따라 수행될 수 있어 특별히 제한하지는 않는다.
제2단계는 PCR 증폭 산물의 발현 패턴을 분석하여 상기 프라이머 세트에 의한 감 품종별 기준 패턴과의 상동성을 동정함으로써 미지의 감 시료의 품종을 확인한다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 감 품종 판별
(식물재료 및 특성조사)
본 발명은 경북농업기술원 상주감시험장에서 보존중인 종 가운데 완전떫은감 37종, 불완전떫은감 1종, 완전단감 2종, 불완전단감 2종을 포함하여 42개 수집 종을 이용하여 (표 1), UPOV 조사 기준 (2007)에 따라 조사한 형태적인 특성을 사용하였다 (표 2).
Figure 112011058488245-pat00001
Figure 112011058488245-pat00002
(총 RNA 추출 및 게놈 DNA 추출)
총 RNA는 Get pure RNA Kit (Dojindo Co., Japan)를 사용하여 추출하였다. ‘상주수꽃감’의 신선한 감 잎 0.1 g을 막자사발에 넣고 액체질소를 사용해 마쇄한 후, 1.5 mL 튜브에 시료를 옮겨 500 ㎕의 라이시스 버퍼와 5㎕의 2-머캅토에탄올을 넣어주었다. 교반한 후 13,000 rpm으로 5분간 원심분리하고 상층액을 새로운 1.5 mL 튜브에 옮겨 같은 량의 에탄올을 넣고 교반한 뒤 13,000 rpm으로 2분간 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 1.2 mL 에탄올 (70%)을 넣고 교반 후 13,000 rpm으로 2분간 원심분리하고 상층액을 제거한 후 200 ㎕ DNase I 작업용액(working solution)을 첨가하여 침전물을 용해하였다. 37 ℃에서 15분간 반응 후 50 ㎕ 침전용액 I (precipitation solution I)을 다시 넣고 교반한 후, 50 ㎕ 침전용액 II (precipitation solution II)를 첨가하여 다시 교반하고 13,000 rpm으로 5분간 원심분리 하였다. 같은 양의 에탄올을 첨가하고 13,000 rpm으로 20분간 원심분리한 후, 상층액을 완전히 제거하고 1.2 mL 70% 에탄올을 넣어 피펫을 사용해 침전물을 수세하였다. 침전물을 완전히 건조한 후 30 ㎕ RNase free water에 용해하고 -80 ℃ 초저온 냉동고 (deep freezer)에 보관하면서 실험에 사용하였다.
42개의 감 수집종을 DNesey plant mini kit (QIAGEN Co., Germany)을 사용해 Kim et al. (Nuc . Aci . Res. 25(5):1085-1086, 1997) 방법을 응용하여 DNA를 추출하였다. 채취한 감 잎 0.1 g을 막자사발에 넣고 액체질소를 사용해 마쇄한 후, 1.5 mL 튜브에 시료를 옮겨 400 ㎕ AP1 버퍼와 4 ㎕ RNase A를 넣고 10초간 교반하였다. 65 ℃의 온탕기에 10분간 진탕시키고 130 ㎕ AP2 버퍼를 넣고 5분 동안 얼음에 넣어 식혀주었다. 13,000 rpm 5분간 원심분리 후 상층액을 Qia shredder mini spincolumn에 옮겨 주었다. 14,000 rpm 2분간 원심분리시키고 상층액을 새로운 1.5 mL 튜브에 옮겨, 675 ㎕ AP3 버퍼를 넣고 5초 동안 섞어주었다. 용액을 DNeasy mini spin column에 옮겨 10,000 rpm 1분간 원심분리한 후 하층액을 버리고 500 ㎕ AW 버퍼를 넣어 14,000 rpm에 2분간 원심분리 후 하층액을 버리고 다시 원심분리 하였다. 여분의 용액을 완전히 제거 후 스핀 컬럼을 1.5 mL 튜브에 넣어 50 ㎕ nuclear free water을 넣고 실온에 DNA를 용해한 후 추출하였다. 추출한 용액은 Nano-drop 2000 (Thermo Scientific, USA)분광광도계를 사용해 농도를 측정한 뒤 10 ng/㎕로 맞추어 -20 ℃에 보관 후 실험에 사용하였다.
(cDNA 라이브러리 제작)
cDNA 라이브러리는 cDNA Synthesis Kit (TaKaRa Co., Japan)와 cDNA PCR Library Kit (TaKaRa Co., Japan)를 같이 사용하여 제작하였다. 2 ㎕ 5×제1 가닥 합성 버퍼, 0.5 ㎕ dNTP 혼합물 (10 mM), 0.5 ㎕ RNase 저해제 (20 unit/㎕), 1 ㎕ Oligo dT RA 프라이머 (1 ㎍/㎕), 0.5 ㎕ M-MLV 역 전사효소 (reverse transcriptase)를 혼합하고 5.5 ㎕의 주형 RNA를 첨가하여 총량을 10 ㎕로 조정하였다. 이것을 실온에 10분간 반응시키고 42 ℃에서 1시간 처리하고 80 ℃에서 5분간 가열을 하여 제1 가닥 (first strand) cDNA를 제작하였다.
이 제1 가닥 cDNA는 제2 가닥 cDNA 제작에 이용하였다. 10 ㎕ 제1 가닥 cDNA 합성 혼합물과 15 ㎕ 5×제2 가닥 합성 버퍼, 1.5 ㎕ dNTP 혼합물 (10 mM)를 제작한 후 DEPC 수로 총량을 71 ㎕로 조정하였다. 그 다음 1 ㎕ E. coli DNA 폴리머라아제 I (20 unit/㎕)과 1 ㎕ E. coli RNase H/E. coli DNA 리가아제 혼합물을 넣어 섞어주었다. 16 ℃에서 2시간 반응 후에 72 ℃에서 가열한 후, 2 ㎕ T4 DNA 폴리머라아제 (1 unit/㎕)를 첨가해 잘 섞은 뒤 37 ℃에서 10분간 반응하였다. 연쇄반응 방지를 위해 6 ㎕ 반응종결용액 (stop solution) (0.2M EDTA, 2 mg/mL 글리코겐, pH 8.0)를 넣어준 후, 순수한 제2 가닥 cDNA를 얻기 위해 동량의 PCI (페놀 : 클로로포름 : 이소아밀 알코올 = 25 : 24 : 1)를 넣고 1분 동안 교반 후 15,000 rpm 5분간 원심분리 하였다. 상층액을 새로운 1.5 mL 튜브에 옮겨 동량의 CI (클로로포름 : 이소아밀 알코올 = 24 : 1)를 넣어준 후 1분 동안 교반시키고 다시 15,000 rpm 5분간 원심분리 하였다. 상층액을 새로운 1.5 mL에 옮겨 동량의 4 M 암모늄 아세테이트와 이소프로판올을 넣어주고 -80 ℃에 1시간 보관 후 15,000 rpm 5분간 원심분리 하였다. 상층액을 완전히 제거하고 1 mL 70% 에탄올을 넣어 피펫을 사용해 침전물을 수세하였다.
침전물을 완전히 건조시킨 후 5 ㎕ RNase free water에 용해한 후, 제2 가닥 cDNA에 Ex TaqTM polymerase (TaKaRaCo., Japan)를 사용하여 양 말단에 제한효소 영역을 가진 어댑터 (adaptor)를 합성하였다. 30 ㎕ 제2 가닥 cDNA, 5 ㎕ 10× Ex Taq 버퍼, 4 ㎕ dNTP 혼합물 (2.5 mM), 1 ㎕ CA 프라이머 (20 pmole/㎕, 5´-CGT GGT ACC ATG GTC TAG AGT-3´), 1 ㎕ RA 프라이머 (20 pmole/㎕, 5´-CTG ATC TAG ACC TGC AGG CTC-3´), 0.5 ㎕ TaKaRa Ex TaqTM (5 unit/㎕), 8.5 ㎕ nuclear free water로 혼합하고 총 반응액은 50 ㎕로 조정한 후 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 94 ℃ 2분 반응 후, 94 ℃ 30초, 60 ℃ 30초, 72 ℃ 3분으로 35 사이클 증폭하고 72 ℃ 10분간 추가로 반응하였다. PCR 산물 중 1 ㎕를 1.0% 아가로우즈 젤에 전기영동하고 에티디움 브로마이드에 염색한 후, UV transilluminator에서 cDNA 합성을 확인하였다. 앞에서 제작한 cDNA 라이브러리 PCR을 효소와 불순물을 제거하기 위해 PCR 정제 키트 (QIAGEN Co., Germany)로 정제하고 pGEM-T Easy Vector (Promega Co., USA)에 라이게이션 하였다. 5 ㎕ 2× 래피드 라이게이션 버퍼 (rapid ligation buffer), 1 ㎕ T4 DNA 리가아제 (3 unit/㎕), pGEM-T Easy Vector (50 ng/㎕)와 cDNA PCR 산물을 1 : 1 비율로 맞춘 후 nuclear free water로 총량을 10 ㎕로 조종하고 4 ℃에서 12시간 반응하였다.
5 ㎕ 라이게이션 산물과 50 ㎕ DH 5α 컴피턴트 세포를 섞은 후 얼음에서 30분간 반응시키고 42 ℃에서 1분간 처리하였다. 다시 얼음에서 2분간 처리하고 250 ㎕ LB broth (10g 박토 트립톤, 5g 박토 이스트 추출물, 5g NaCl)을 첨가하여 37 ℃에서 180 rpm으로 1시간 배양하였다. 배양액은 LB 평판 배지 (100 ppm/l 앰피실린, 0.5 mM IPTG, 80 ㎍/mL X-Gal 첨가)에 도말한 후 37 ℃에서 12시간 배양하였다. 배양 후 나온 푸른색 콜로니와 흰색 콜로니 중 형질전환이 된 흰색 콜로니를 선발한 후 5mL LB 브로스 (10g 박토 트립톤, 5g 박토 이스트 추출물, 5g NaCl)에 넣어 37 ℃에서 14시간 이상 배양하였다.
배양액은 3,000 rpm 10분간 원심분리한 후 Qiaprep spin miniprep kit (QIAGEN Co., Germany)를 사용하여 추출하였다. 상층액을 제거하고 250 ㎕ P1 버퍼를 넣어 균체를 녹인 후 1.5 mL-튜브에 옮겨 250 ㎕ P2 버퍼를 넣고 조심스럽게 섞어주었다. 350 ㎕ N3 버퍼를 첨가하고 13,000 rpm으로 10분간 원심분리한 후, 상층액을 새로운 1.5 mL 튜브에 옮기고 다시 13,000 rpm으로 5분간 원심분리하고 상층액을 새로운 1.5 mL 튜브에 옮겼다. 700 ㎕를 스핀 컬럼에 옮기고 13,000 rpm에서 1분간 원심분리 후 컬럼에 걸러진 하층액을 버렸다. 500 ㎕ PB 버퍼를 넣고 13,000 rpm 1분간 원심분리한 후, 750 ㎕를 PE 버퍼를 넣어 플라스미드 DNA를 수세하였다. 하층액을 버리고 여분의 용액을 완전히 제거하고 스핀 컬럼을 1.5 mL-튜브에 넣어 30 ㎕ nuclear free water로 플라스미드 DNA를 용해한 후 추출하였다.
(제한효소 처리)
추출한 플라스미드 DNA의 cDNA 유, 무를 확인하기 위해 제한효소 EcoRI(TaKaRa Co., Japan)을 처리해 주었다. 1 ㎕ 플라스미드 DNA, 0.5 ㎕ EcoR I, 2 ㎕ 10× 버퍼 (H)에 16.5 ㎕ nuclear free water을 넣어 총 20 ㎕로 맞춘 후 37 ℃에서 1시간 반응시켰다. 제한효소로 처리한 플라스미드 DNA를 연쇄반응방지를 위해 10분 동안 얼음에서 처리한 후 0.8% 아가로우즈 젤에서 전기영동하고 에티디움 브로마이드에 염색한 후, UV 형광투시기 (transilluminator)에서 cDNA 삽입 유, 무를 확인하였다.
(DNA 시퀀싱 및 프라이머 설계)
cDNA가 pGEM-T-easy vector에 삽입이 확인된 플라스미드 DNA를 SolGent사 (SolGent Co., Korea)에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다. 얻어진 염기서열 분석 결과를 마이크로새틀라이트 분석 프로그램 (Microsatellite analysis program) (http://www.wsmartins.net/websat/)을 사용하여 EST 시퀀스 상의 SSR 부위를 분석한 후, SSR 부위를 이용하여 정방향 프라이머 (forward primer)와 역방향 프라이머 (reverse primer)를 작성하였다.
(EST-SSR 프라이머 세트를 이용한 다형성 분석)
EST-SSR 부위의 다형성 분석을 위해 개발한 25개의 EST-SSR 프라이머 세트를 사용하였다. 먼저 5개의 수집종의 DNA 샘플을 이용하여 1차 PCR 검정을 하고 PCR이 성공적으로 이루어졌음을 확인 후 모든 품종에 대한 2차 PCR 검정을 하였다. PCR용액의 조성은 4 ㎕ HiPi PCR Premix (Elpisbio. Korea)를 10 ng의 게놈 DNA, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 각각 1 ㎕ (20 pmole/㎕)을 섞은 후 nuclear free water를 사용해 20 ㎕를 조정한 후, PCR을 수행하였다. PCR 조건은 94 ℃ 5분간 반응하고 다시 94 ℃에서 30초, 56~58 ℃에서 30초, 72 ℃ 45초로 35 사이클 증폭하고 72 ℃ 5분간 추가로 반응하였다. PCR 산물은 QIAxcel (QIAGEN Co., Germany)을 사용하여 증폭된 밴드를 확인하였으며, QX DNA 사이즈 마커 (FX174/HaeIII)를 통해 크기를 확인하였다. EST-SSR 프라이머에서 증폭된 밴드의 유, 무에 따라서, 나타난 밴드는 1로 하고, 나타나지 않은 밴드는 0으로 하여 유전적 다양성 지표인 다형성 정보량 (polymorphic information content) 값의 분석을 PCR을 통해 증폭된 산물의 크기를 QX DNA 사이즈 마커 (FX174/HaeIII) 밴드를 기준으로 측정하여 작성하였으며, Noise cut off 20%, contrast (1~100%) 100% 로 조절하여 확인이 가능한 밴드만을 선발하였으며 밴드 피크의 붉은색 부분과 데이터 테이블의 사이즈 (bp), 함량 (ng/㎕)를 참조하였다.
(형태적 유연관계 분석 및 유전적 유사성 검정)
경북농업기술원 상주감시험장에서 수집한 42품종에 각 품종의 과실크기, 옆모양, 횡단면, 종단면 등 25개의 형태적 특징을 조사한 것과 EST-SSR 프라이머 세트에 의해 조사된 자료를 이용하여 NTsys 소프트웨어 프로그램을 사용하여 계통수 (dendrogram)를 작성하였다. NTsys 소프트웨어 프로그램을 사용하여 유연관계를 분석한 후, 계통수 (phylogenetic tree)를 작성하였으며, 분석조건은 비가중산술법 (UPGMA; unweighted pair group method with arithmetic)을 사용하였다. 형태적 유연관계 와 유전적 유연관계의 유사성 검정은 NTsys 소프트웨어 프로그램 중 멘텔 테스트 (Mantel test)를 통해 확인하였다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 사용하기 위해 경북농업기술원 상주감시험장에서 수집한 42종의 수집종의 UPOV 조사기준 (2007)에 따라 조사하였다. 과실크기, 과고, 과경, 과경굵기, 과경길이, 종자크기로 6가지의 양적 형질 (도 1)과 횡단면, 종단면, 옆에서 본 일반적 모양, 골의 정도, 정부의 얕은 동심원 균열, 정부 열과, 세로 홈, 꽃받침 끝의 주름, 배꼽 홈 깊이, 꽃받침 쪽의 홈, 꽃받침 크기, 꽃받침의 자세, 표면색, 과육색, 과육의 갈색반점, 종자의 측면 모양, 종자의 색깔, 떫은 맛, 과즙으로 19가지의 질적 형질을 조사한 결과 (도 2 내지 4)는 6가지의 양적 형질은 정규분포곡선으로 나타났으며, 옆에서 본 일반적 모양은 원형, 종단면은 둔각형, 횡단면은 둥근부정형, 종자색깔은 암갈색, 과육의 갈색반점은 항상없음, 배꼽 홈 깊이는 약간패임, 꽃받침자세는 반직립이 높았으며, 정부의 얕은 동심원 균열과 정부열과, 세로홈, 꽃받침 끝 주름은 없거나 적었으며, 꽃받침크기는 크고 과실표면색과 과육색에는 오렌지색이 높게 나왔다. 꽃받침쪽의 홈과 떫은맛은 전부 있었으며 과즙은 모두 적었고, 종자 측면모양은 좁은 타원형 난형, 반 넓은 타원형, 반 편원형에 고르게 분포되었다.
cDNA가 삽입된 총 252개의 플라스미드를 시퀀싱 하였다. 분석된 염기서열을 DNA STAR SeqMan II-expert sequence analysis software (version 5.01)를 이용하여 EST-SSR 부위를 증폭할 수 있는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 25개를 선발하였다. 선발된 25개의 프라이머 세트를 마이크로새틀라이트 분석 프로그램을 사용하여 시퀀스 상의 EST-SSR 부위를 분석한 결과 총 146개의 EST-SSR 부위를 찾아낸 후 이 부분을 사용하여 EST-SSR 프라이머를 제작하였다 (표 3).
Figure 112011058488245-pat00003
다형성 분석을 위해 개발한 25개의 EST-SSR 프라이머 세트를 사용하여, 먼저 5개의 수집종의 DNA를 이용하여 1차 PCR 후 2.5% 아가로우즈 젤에 전기영동을 통해 검정을 한 결과, 프라이머 별로 밴드를 확인할 수 있었다. 이중 재연성이 높은 EST-SSR 부위를 증폭할 수 있는 16개의 프라이머 세트를 선발하였다 (표 3). PCR로 증폭한 후 확인할 수 있는 밴드는 총 63개 였고, PIC 값 (대립인자 다형성에 미치는 값)은 0.000~에서 0.880까지 분포하고 있으며, 평균 0.672이며, PIC 값이 0.7 이상 것은 P52-109, P52-107, P52-58, P52-97, P66-61, P66-67, P66-132로 감 유전자원을 이용한 품종 구분에 매우 유용하게 이용될 것을 생각된다. 본 실험은 총 16개 EST-SSR 프라이머 세트를 개발하였고, 이 중 7 개 (43.8%) 프라이머 세트는 PIC 값이 7.0을 넘음으로 EST-SSR 프라이머 세트를 이용하여 감 품종을 정확하게 구분할 수 있을 것이라 생각된다.
선발한 16개의 프라이머 세트를 이용해 42개의 수집종의 DNA를 PCR한 결과 프라이머에 의해 나타난 밴드의 수는 총 2~5개로 증폭되었으며, 크기는 42bp ∼ 640bp까지 분포하였으며, 품종마다 차이가 확실한 밴드를 확인할 수 있었다 (도 5). 최근에 Qureshi et al. (J. Cotton Sci. 8:112-123, 2004)는 목화에서 9,948개의 시퀀스 분석을 이용하여 84개의 EST-SSR 프라이머를 만들어 연구를 하였고, Kim et al. (Kor . J. Hort . Sci . Technol. 28(4):618-626, 2010)은 장미에서 30개의 EST-SSR 마커를 이용한 바 있다. Oh et al. (Kor . J. Hort . Sci . Technol. 28(6):1025-1038, 2010)는 당근의 EST 시퀀스를 바탕으로 50개를 이용하여 당근의 계통 분류 및 여러 가지 형질관련 분자 마커 연구에 활용 가능할 것을 기대된다고 보고하고 있다. 또한 본 발명에서 개발한 16개의 EST-SSR 프라이머 세트는 감 품종 및 여러 가지 형질관련 연구에 활용 가능할 것으로 생각된다.
선발한 16개의 프라이머 쌍을 이용해 42개의 수집종의 DNA를 PCR한 결과 프라이머에 의해 나타난 밴드의 수는 총 2~5개로 증폭되었으며, 크기는 42bp ∼ 640bp까지 분포하였으며, 품종마다 차이가 확실한 밴드를 확인할 수 있었다
42개의 감 수집종의 형태적 특성을 가지고 NYsys 프로그램을 사용해 유연관계를 나타내는 계통수를 작성하였다. 형태적 유연관계에서는 여러 그룹이 형성되었지만 계수가 0.02 이하로 분석되어 형태적 특성으로는 감 수집종을 분류하기는 어려웠다 (도 6). 밀수감과 시흥고종시, 영주고종시와 영주동우감, 밀양물감과 신추는 같은 것으로 분석되고 선사환은 그룹에서 떨어져 있었다.
개발한 16개의 EST-SSR 프라이머를 사용하여 유전적 유연관계를 분석 결과 계수가 0.77에서 크게 3개 그룹으로 분류되었으며, 상주수수감과 상주수꽃감, 밀양반시와 밀양고동시, 영동반시와 영동수시는 같은 그룹으로 분석 되었다 (도 7). 또한 형태적 분석에서 동일하게 나타난 3쌍은 밀수감과 시흥고종시가 II 그룹에 있었고, I 그룹에는 영주동우감, 밀양물감, II 그룹에는 영주고종시, 선사환으로, III 그룹에는 신추가 속하였다. 따라서 형태적 분석과 유전적 분석의 상관관계를 조사한 결과 형태적 분석의 유사도 거리와 유전적 분석의 유사도 거리 간의 r값이 -0.03으로 유의성이 매우 낮게 연관되었다 (도 8).
따라서, 상기 실험 결과 형태적 마커로는 감 수집종에서 정확한 육종 계획에 활용할 수 없을 것으로 판단된다.
결론적으로, 본 발명에서 16개의 EST-SSR 프라이머 세트를 개발하여 정확하고 신속하게 품종 구분과 형질관련 및 감 품종 육종에 활용에 이용 가능성이 크다고 사료된다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

  1. 서열목록 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트, 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트, 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트, 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트, 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트, 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트, 서열번호 13 및 14의 프라이머 세트, 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트, 서열번호 17 및 18의 프라이머 세트, 서열번호 19 및 20의 프라이머 세트, 서열번호 21 및 22의 프라이머 세트, 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트, 서열번호 25 및 26의 프라이머 세트, 서열번호 27 및 28의 프라이머 세트, 서열번호 29 및 30의 프라이머 세트 및 서열번호 31 및 32의 프라이머 세트로 구성된 감 품종 판별용 EST-SSR(expressed sequence tags-simple sequence repeat) 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 반복서열 (CGCAA)2, (TTGCG)2, (A)20, (AA)5, (T)11, (ATACTC)2, (T)10, (CTTCC)2, (GGAAG)2 또는 (T)12 중 어느 하나를 증폭시키는 감 품종 판별용 EST-SSR 프라이머 세트.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 말단이 방사성 또는 형광물질로 표지된 것인 감 품종 판별용 EST-SSR 프라이머 세트.
  4. 제1항에 있어서,
    감 품종은 영동먹감(Yeongdongmeoggam), 밀양물감(Miryangmulgam), 영덕상시(Yeongdeogsangsi), 영덕태백감(Yeongdeogttabaegam), 상주수수감(Sangjususugam), 상주구설감(Sangjuguseulgam), 상주수꽃감(Sangjusukkochgam), 산청단성찰감(Sancheongdanseongchalgam), 안동수시감(Andongsusigam), 봉화골감(Bonghwagolgam), 봉화반시(Bonghwabansi), 산청고동시(Sancheonggodongsi), 안동쪽감(Andongjjoggam), 영주고종시(Yeongjugojongsi), 영주동우감(Yeongjudongugam), 선사환(Seonsahwan), 애랑(Aerang), 밀양개반시(Miryanggaebansi), 밀양고동시(Miryanggodongsi), 밀양반시(Miryangbansi), 예천부채감(Yecheonbuchaegam), 갑주백목(Gabjubaegmog), 성주먹감(Seongjumeoggam), 예천수시(Yecheonsusi), 스퍼평핵무(Seupeopyeonghaegmu), 산청두리감(Sancheongduligam), 산청찰감(Sancheongchalgam), 영동반시(Yeongdongbansi), 산청단성시(Sancheongdanseongsi), 영동수시(Yeongdongsusi), 삼랑좌(Samrangjwa), 산청대곡시(Sancheongdaegoksi), 밀수감(Milsugam), 예산반시(Yesanbansi), 신추(Sinchu), 상추감(Sangchugam), 뾰조리(Ppyojori), 시흥고종시(Siheunggojongsi), 서조(Seojo), 산청꾸리감(Sancheongkkurigam), 상주원시(Sangjuwonsi), 또는 박 36(Park 36) 중 어느 하나인 감 품종 판별용 EST-SSR 프라이머 세트.
  5. 제1항에 따른 감 품종 판별용 EST-SSR(expressed sequence tags-simple sequence repeat) 프라이머 세트를 포함하는 감 품종 판별용 키트.
  6. 판별하고자 하는 감 시료의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭시키는 단계; 및
    상기 단계에서 얻은 PCR 산물의 발현 패턴을 분석하고, 상기 프라이머 세트에 의한 감 품종별 기준 패턴과의 상동성 동정을 통해 감 품종을 판별하는 단계를 포함하는 감 품종의 판별방법.
  7. 제6항에 있어서,
    프라이머 세트는 말단이 방사성 또는 형광물질이 표지된 것인 감 품종의 판별방법.
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