KR101444178B1 - 초위성체 마커를 이용한 고추 품종 식별 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 국내에서 유통되고 있는 고추 품종에 대하여 다형성을 나타내는 고추 품종 식별용 초위성체 마커를 이용한 고추 품종의 식별 방법 및 상기 초위성체 마커를 포함하는 키트에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 국내외서 유통되고 있는 고추 170개 품종에 대해 높은 다형성을 갖는 초위성체 마커의 조합을 선별하고 이를 이용하여 국내 종자시장에서 유통되고 있는 고추 품종을 식별할 수 있게 할 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용된 고추 품종 식별용 분자 표지는 국내에서 유통되고 있는 고추 170개 품종을 식별할 수 있을 뿐만 아니라 모든 품종에 대하여 양친을 식별하는 이형접합성을 나타내는 마커가 있기 때문에 F1 종자의 순도 검정에 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 농가와 종자 회사 또는 종자 회사와 종자 회사 간에 발생하는 종자 분쟁 발생시 이를 해결할 수 있는 중재 수단의 제공, 시중에서 유통되고 있는 고추 품종의 진위성 규명, 품종 보호 출원시 대조 품종의 선정, 권리침해 여부의 사전 모니터링 및 F1 종자의 순도확인 등과 같은 여러 분야에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

초위성체 마커를 이용한 고추 품종 식별 방법{A method for identifying hot pepper varieties using microsatellites markers}
본 발명은 국내 종자 회사에 육성된 고추 품종에 대해 다형성을 나타내는 분자 표지 즉 초위성체 마커, 상기 마커를 이용한 고추 품종의 식별 방법, F1 종자 순도 확인 방법 및 상기 마커를 포함하는 키트에 관한 것이다.
국제 신품종 보호 동맹(UPOV)에서는 분자 마커의 활용에 대한 실험실 및 연구자 간의 신뢰성 높은 분석 결과를 도출하기 위하여, 유전자 분석 방법 및 DNA 마커의 선정, DNA 분리 방법 및 데이터베이스 구축 등에 대한 가이드라인을 제시하고 있다. 이 가이드라인에서는 분자 마커의 활용시 실험실 및 연구자 간에 반복 재현성이 높을 뿐만 아니라 공우성을 나타내며, 활용 분자 마커가 염색체상에 고르게 분포되어 있고 여러 가지 분석장비를 활용하더라도 동일한 결과를 나타내어야 한다는 전제 조건을 제시하고 있다. 이러한 요건에 가장 적합한 것이 분석 방법이 염색체상에 존재하는 반복염기서열의 차이를 활용하여 분석 재료간의 다형성을 확인하는 SSR(simple sequence repeat) 분석 방법이라고 할 수 있다. 실제로 유럽에서는 유럽품종보호사무소(CPVO) 주관 하에 감자, 장미, 토마토 등의 작물에 대하여 500품종에 대한 DNA profile 데이터베이스를 구축하여 그 연구 결과를 보고하고 있다. 중국과 일본에서는 벼, 옥수수, 골풀, 딸기 등의 작물에 대하여 SSR 분석 기술을 활용한 품종별 DNA 프로파일을 데이터베이스화하여 품종보호 권리 침해와 자국 농산물의 보호 등과 같은 분야에 활용하고 있다. 한편, 우리나라의 경우 국립종자원에서 종자시장에서 중요도가 높거나 분쟁의 발생 가능성이 높은 무, 배추, 수박, 참외, 멜론, 오이, 벼 등과 같은 작물에 대하여 품종식별이 가능한 분자 마커를 활용하여 작물당 100~500품종에 대한 DNA 프로파일 데이터베이스를 구축하였거나 구축 중에 있으며, 실제로 품종별 DNA 프로파일 데이터베이스를 활용하여 품종보호출원 품종의 대조품종 선정 및 품종보호 재배심사시 구별성, 균일성 및 안정성을 확인하는데 이용하고 있으며, 최근에는 품종보호 등록품종의 특성 유지확인에도 유전자 분석 기술을 적극 활용하고 있다. 또한 품종식별 분자 마커는 농가와 종자 회사 및 종자회사 간에 발생하는 품종 진위성과 관련된 종자분쟁 발생시 이를 중재하기 위한 하나의 수단으로 적극 활용되고 있는 실정이다.
고추는 2011년 현재 재배면적이 42,574ha 이며 생산량이 77,110 톤에 달하며 2012년 10월 현재 품종보호출원 등록된 258품종과 생산 수입판매 신고된 2011 품종이 국내 종자시장에서 유통되고 있다.
고추에 대한 분자유전학적 연구 동향을 살펴보면, 2004년과 2006년에 우리나라의 서울대학교 연구팀에서 genomic library와 EST 등에서 유래된 SSR 마커 226개를 활용하여 TF68(Capsicum annuum)과 Habanero(Capsicum chinensis)가 교배된 F2 집단에 대한 유전자 지도를 작성하였다 (Lee JM, Nahm SH, Kim YM and Kim BD. 2004, Theoretical Applied Genetics. 108, 619-627 ; Yi GB, Lee JM, Lee SH, Choi DI and Kim BD. 2006, Theoretical Applied Genetics. 114, 113-130). 일본에서는 106개의 SSR 마커를 자체 개발하여 유전적 다형성이 적은 Manganji(Capsicum annuum)와 Tongari(C. annuum)의 약배양 집단을 대상으로 유전자 지도를 작성한 연구결과도 보고된바 있다 (Minamiyama Y, Tsuro M and Hirai M. 2006, Molecular Breeding 18, 157-169). 이탈리아와 독일에서 genomic library와 EST 등에서 유래된 SSR 마커를 개발하여 유전자원의 특성평가 및 가지과 작물에 활용 가능성에 대한 연구를 수행한 바 있다 (Portisa E, Nagyb I, Sasvarib Z, Stagela A, Barchia L and Lanteria S. 2007, Plant Science 172, 640-648; Nagy I, Stagel A, Sasvari Z, Roder M and Ganal M. 2007, Genome 50, 668-688). 최근에는 고추 품종식별에 적합한 SNP 마커를 개발하여 우리나라 고추 품종 98품종에 대해 식별체계를 구축한 바 있으나 (Jung JM, Park SW, Liu WY and Kang BC. 2010. Euphytica 175:97-107), 이 SNP 마커는 우성(dominant) 마커이기 때문에 분석방법의 반복 재현성 등과 한정된 품종을 분석에 이용한 점 등과 같은 문제점으로 인해 이를 실용적으로 활용하는 데는 한계성이 있는 것으로 지적되었다. 이러한 국내외 연구결과를 종합해 볼 때 국내 품종을 UPOV가 제안한 유전자 분석기법의 하나인 SSR 마커에 의해 식별할 수 있는 품종식별 방법은 미확립된 상태일 뿐만 아니라 이를 자동염기서열분석기를 활용한 품종별 정확한 DNA profile 구축은 되어있지 않는 상태이다.
이에 본 발명자는 국내에서 육성된 고추 170개 품종에 대해 다형성을 나타내는 초위성체 마커를 선별하고, 이들 초위성체 마커 세트를 프라이머로 이용하여 고추 게놈 DNA를 증폭시킨 후 생성된 증폭 산물을 확인함으로써, 대립 유전자 패턴 및 PIC(polymorphic information content) 값을 살펴 보았을 때 상기 초위성체 마커가 고추 품종 식별 방법에 적합함을 밝힘과 동시에 공시된 모든 고추 품종의 양친을 식별할 수 있는 이형접합성을 가진 분자표지가 존재하는 것이 확인되어 이 마커 세트는 고추 종자의 순도검정에 매우 유용하게 이용될 수 있는 것으로 판단되었다. 이러한 결과는 품종 보호 출원시 대조 품종 선정, 종자 분쟁 발생시 품종 진위성에 대한 과학적 검증, 종자 유통 관리 및 F1 종자의 품질관리 등 다양한 방면에 실용적으로 활용될 수 있을 것이다.
본 발명의 목적은 우리나라에서 유통되고 있는 고추 170개 품종에 대해 높은 다형성을 나타내는 초위성체 마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 초위성체 마커를 이용하는 고추 품종 식별 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 종자 회사에서 육종된 고추 품종에 대한 유전적 유사도를 DNA 수준에서 예측 가능하게 함으로써 이를 품종 보호 출원시 대조품종 선정에 직접 활용할 수 있게 하는 고추 품종 식별 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 고추 품종에 대한 진위성 검정에 분자생물학적 기술을 접목하여 종자 시장에서 판매되는 고추 품종의 진위성 여부를 실험실 수준에서 판단함으로써, 불량 종자의 유통을 근절하는데 크게 기여할 수 있고, 농가와 종자 회사, 육묘업체와 농가 또는 종자 회사와 종자 회사간에 발생하는 품종 진위성과 관련된 종자 분쟁 해결에 매우 유용하게 이용될 수 있는, 고추 품종 식별 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 고추 품종 식별에 활용된 분자 표지 중에서 품종에 따라 2개의 대립유전자를 나타내는 것은 이 품종 육성시 교배된 양친의 유전자형을 나타내기 때문에, F1 품종에 대해 양친의 교배 여부를 DNA 수준에서 확인할 수 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 국내외에서 유통되고 있는 고추 품종에 대하여 다형성을 나타내는 프라이머 세트(서열번호 1 내지 48)를 포함하는, 고추 품종을 식별하기 위한 마커를 제공한다.
또한, 본 발명은 고추로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 내지 서열번호 48 중 하나 이상의 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물로부터 상기 고추의 품종을 식별하는 단계를 포함하는, 고추 품종을 식별하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 고추로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 내지 서열번호 48 중 하나 이상의 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭하는 단계; 상기 증폭 산물에서 품종 특이적인 대립유전자를 가지면서 그 개수가 2개로 나타난 프라이머 세트를 선별하는 단계; 순도를 검정하고자 하는 고추의 일대 잡종(F1) 품종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 상기 선별된 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물이 상기 품종 특이적인 대립 유전자의 크기를 가지면서 대립 유전자의 수가 2개로 나타난 상기 고추의 F1 품종은 순종인 것으로 판별하는 단계를 포함하는 고추 F1 품종의 순도를 검정하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 48 중 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 고추 품종을 식별하기 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 48 중 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 고추 일대 잡종(F1) 품종의 순도를 검정하기 위한 키트를 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 국내외 종자 시장에서 유통되고 있는 고추 품종에 대하여 다형성을 나타내는 프라이머 세트(서열번호 1 내지 48)를 포함하는, 고추 품종을 식별하기 위한 마커를 제공한다.
상기 마커는 국내에서 유통되고 있는 고추 170개 품종에 대해 높은 다형성을 나타내는 초위성체 마커로서, 국내에서 유통되고 있는 고추 품종을 특이적으로 식별할 수 있다. 본 발명의 마커는 국내 종자 회사에서 육성되어 판매되고 있는 고추 170개 품종에 대해 높은 다형성을 나타내는 SSR 마커이다. 구체적으로, 본 발명의 마커는 하기 표 2에 기재된 고추 170개 품종에 대하여 높은 다형성을 나타내었다.
본 발명의 마커는 예를 들면, 하기 표 1에 기재된 염기 서열(서열번호 1 내지 48)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함할 수 있다.
고추 품종 식별에 사용된 마커
서열 번호 초위성체 표지인자 프라이머 염기서열 형광염색
1 CAMS051
 정방향 : ACCCAGTTCCCTTTCTTGGT VIC
2 역방향 : GAAGGTTAGCGGAATGAACG
3 CAMS117
 정방향 : TTGTGGAGGAAACAAGCAAA NED
4 역방향 : CCTCAGCCCAGGAGACATAA
5 CAMS336
 정방향 : GGTGGAAACTTGCTTGGAGA PET
6 역방향 : CCCAGAACCATCCACCTACT
7 CAMS351
 정방향 : CGCATGAAGCAAATGTACCA FAM
8 역방향 : ACCTGCAGTTTGTTGTTGGA
9 CAMS855
 정방향 : AAGTGTCAAGGAAGGGGACA VIC
10 역방향 : CCTAACCACCCCCAAAAGTT
11 GPMS029
 정방향 : CAGGCAATACGGAGCATC NED
12 역방향 : TGTGTTGCTTCTTGGACGAC
13 GPMS100
 정방향 : TCCATACGGTTGGAGGAGAG FAM
14 역방향 : ACTATGCTCTGCTGTGCCCT
15 GPMS117
 정방향 : GATGTTAGGTCCGTGCTTCG VIC
16 역방향 : AAGCCCCATGGAAGTTATCC
17 GPMS159
 정방향 : AAGAACATGAGGAACTTTAACCATG NED
18 역방향 : TTCACCCTTCTCCGACTCC
19 GPMS161
 정방향 : CGAAATCCAATAAACGAGTGAAG FAM
20 역방향 : CCTGTGTGAACAAGTTTTCAGG
21 GPMS194
 정방향 : AGGTGGCAGTTGAGGCTAAG NED
22 역방향 : GTTCTAGGTCTTTGCCCTGG
23 GPMS197
 정방향 : GCAGAGAAAATAAAATTCTCGG FAM
24 역방향 : CAATGGAAATTTCATCGACG
25 EPMS305
 정방향 : CGTCTTTCACTTGTCTTTTGTTC VIC
26 역방향 : AGTGGGTTCACTGACTTGGG
27 EPMS331
 정방향 : AACCCAATCCCCTTATCCAC NED
28 역방향 : GCATTAGCAGAAGCCATTTG
29 EPMS376
 정방향 : ACCCACCTTCATCAACAACC PET
30 역방향 : ATTTGTGGCTTTTCGAAACG
31 EPMS386
 정방향 : ACGCCAAGAAAATCATCTCC VIC
32 역방향 : CCATTGCTGAAGAAAATGGG
33 EPMS418
 정방향 : ATCTTCTTCTCATTTCTCCCTTC NED
34 역방향 : TGCTCAGCATTAACGACGTC
35 EPMS426
 정방향 : GAGGAAACACTCTCTCTCTCTCTCTC FAM
36 역방향 : TCAAGAGACCCCAAATAGGG
37 EPMS441
 정방향 : GCACGAGGAAAGAGAGAGACATAG PET
38 역방향 : TCAACGGATTCAGTCTTCCC
39 EPMS542
 정방향 : ATCCACTTCCCCATTATCCC NED
40 역방향 : TGGATGATCGAGTTGACTGG
41 EPMS642
 정방향 : CAACTTCGCGTTATTGTCCA FAM
42 역방향 : AGGGCGGACAAAGAAGATTT
43 EPMS643
 정방향 : CCAAGATCAACTCTTACGCTAT PET
44 역방향 : CCCCTCAAGAATTCCCTCCAT
45 EPMS709
 정방향 : ACGCCGAGGACTATGATGAC NED
46 역방향 : TTCTTCATCCTCAGCGTGTG
47 EPMS755
 정방향 : CGCTCGCTACCCTTTCATTA FAM
48 역방향 : AATTTCGGAAGGGCAAAGAT
또한, 본 발명은 고추로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 내지 서열번호 48 중 하나 이상의 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물로부터 상기 고추의 품종을 식별하는 단계를 포함하는, 고추 품종을 식별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 고추 품종 식별 방법에서 고추로부터 유래된 게놈 DNA는 고추의 종자, 고추의 식물 전체로부터 DNA를 채취하는 통상적인 방법을 사용함으로써 얻을 수 있다. 예를 들면, 고추로부터 유래된 게놈 DNA는 고추의 종자 또는 고추의 잎, 줄기, 과육 또는 뿌리로부터 유래될 수 있고, 특히 종자를 파종하고 출아한 후의 고추의 어린 식물체의 잎으로부터 채취될 수 있다.
본 발명의 고추 품종 식별 방법에서 게놈 DNA의 증폭은 PCR 반응을 사용하는 것이 바람직하다. 일반적인 PCR 수행 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다. 구체적으로, PCR 반응은 당업계에서 PCR 반응에 필요하다고 알려진 여러 성분을 포함하는 PCR 반응액을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 PCR 반응액은 분석하고자 하는 고추로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 마커, 적당량의 DNA 중합 효소(예를 들면, Taq polymerase), dNTP 혼합물, PCR 완충 용액 및 물을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유할 수 있다.
본 발명에서 상기 증폭된 산물로부터 고추 품종을 식별하는 단계는 자동 염기 서열 분석기를 이용하여 대립 유전자(밴드)의 크기를 컴퓨터 프로그램에 의해 확인한 다음 각각의 품종을 식별할 수 있다. 구체적으로는, 각각의 고추 품종에 대하여 본 발명의 마커에 의한 증폭 산물의 유무를 표로 작성하고 상기 증폭된 산물과의 비교 분석을 통해 고추 품종을 식별할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 마커를 이용하여 각각의 고추 품종으로부터 나온 대립 유전자의 크기를 미리 하나의 표로 정리한 다음 대립 유전자의 존재 유무를 밝혀 대립 유전자가 존재할 때에는 "1"로 나타내고 대립 유전자가 존재하지 않을 때에는 "0"으로 나타낸다. 따라서, 품종을 식별하고자 하는 고추로부터 게놈 DNA를 분리한 후, 본 발명의 마커를 이용하여 증폭하고, 증폭된 산물의 크기를 분석한 다음 통계 프로그램을 통하여 고추 품종의 식별 여부를 확인할 수 있다.
또한, 본 발명은 고추 F1 품종의 순도를 검정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 고추로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 내지 48 중 하나 이상의 고추 품종 식별용 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭하는 단계; 상기 증폭 산물에서 품종 특이적인 대립 유전자를 나타내며 대립 유전자의 개수가 2개로 나타난 프라이머 세트를 선별하는 단계; 순도를 검정하고자 하는 고추 F1 품종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 상기 선별된 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물이 상기 품종 특이적인 대립 유전자의 크기를 가지면서 대립 유전자의 수가 2개로 나타난 상기 고추의 F1 품종은 순종인 것으로 판별하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 고추로부터 유래된 게놈 DNA는 고추의 종자 및 고추의 식물 전체로부터 DNA를 채취하는 통상적인 방법을 사용함으로써 얻을 수 있다. 상기 얻은 고추로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 내지 48 중 하나 이상의 고추 품종 식별용 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 증폭 산물의 유무를 표로 작성한다. 예를 들면, 하기 표 2에서 기재된 국내에서 유통되고 있는 고추 170개 품종으로부터 DNA를 채취하고, 고추 품종 식별용 프라이머 세트를 사용하여 증폭함으로써, 도 2에서 도시된 바와 같은 증폭 산물의 유무를 표로 작성한다. 예를 들어, 도 2에 따르면, ‘무한질주’ 품종은 CAMS051 프라이머 세트에 대해서는 2개의 대립 유전자가 존재하고, CAMS351 프라이머 세트에 대해서도 2개의 대립 유전자가 존재한다. 상기 표에서 각각의 고추 품종에 대하여 특이적인 대립유전자를 가지면서 그 개수가 2개로 나타나게 하는 프라이머 세트, 즉 공우성 (co-dominance)인 프라이머 세트를 선별한다. 예를 들어, ‘무한질주’ 품종 (도 2에서 100번 품종)에 대해서 마커 CAMS117은 대립유전자를 나타내는 밴드가 1개만 나타나서 양친을 구별할 수 없으므로, ‘무한질주’ 품종의 순도를 검정할 수 있는 마커로 사용할 수 없다. 그러나, ‘무한질주’ 품종에 대해서 마커 도 2에 의하면, CAMS051, CAMS351, GPMS029, GPMS117, GPMS159, GPMS161, GPMS197, EPMS305, EPMS376, EPMS386, EPMS426, EPMS542, EPMS642, EPMS643은 2개의 특이적인 대립유전자를 나타냈다. 이들 마커는 ‘무한질주’ 품종의 양친을 식별할 수 있어 ‘무한질주’ 품종의 순도를 검정할 수 있는 마커로 사용될 수 있다.
순도를 검정하고자 하는 고추의 F1 품종의 게놈 DNA를 추출한다. 상기 게놈 DNA를 추출하는 방법은 상기 고추로부터 게놈 DNA를 추출하는 방법과 동일한 방법으로 실시한다.
순도를 검정하고자 하는 고추의 F1 품종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 상기 선별된 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭한다.
상기 증폭 산물에서 대립 유전자의 크기가 품종 특이적이고 그 개수가 2개로 나타나면, 상기 고추의 F1 품종은 양친간의 정상적인 교배가 이루어진 순종인 것으로 검정된다. 상기 증폭 산물에서 대립 유전자의 수가 1개로 나타나면, 상기 고추의 F1 품종은 양친간의 교배가 되지 않은 것으로 판단한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 48 중 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 고추 품종을 식별하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 본 발명의 프라이머 세트 중 하나 이상, DNA 중합 효소 및 PCR 완충 용액을 포함한다. 이외에 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기 영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 48 중 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 고추 일대 잡종 (F1) 품종의 순도를 검정하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 본 발명의 프라이머 세트 중 하나 이상, DNA 중합 효소 및 PCR 완충 용액을 포함한다. 이외에 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기 영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
본 발명의 고추 품종 식별용 마커 만을 사용하여 국내외 종자 시장에서 판매되고 있는 주요 고추 품종 170개를 식별할 수 있다. 따라서, 고추 품종의 진위성 규명을 통한 품종 보호 침해 여부의 사전 모니터링 및 침해 여부 확인, 품종 보호 출원시 대조 품종의 선정, F1 종자 생산시 순도확인 등과 같은 다양한 분야에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a 내지 1c는 본 발명에 따른 마커에 의해 분석된 각 고추 품종을 코드화하고 NTSYSPC 컴퓨터 프로그램을 활용하여 고추 품종 식별 및 품종별 유전적 유사도를 나타낸 것이다.
도 2a 내지 2i는 국내에서 육성되는 170개 고추 품종을 대상으로 본 발명의 24개의 프라이머 세트를 이용하여 증폭하였을 때 대립 유전자의 크기(bp)에 따라 밴드의 유무를 코드화한 것으로, 밴드가 존재할 때에는 “1”로 나타내었고, 밴드가 존재하지 않을 때에는 “0”으로 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 그러나 본 발명이 하기 실시 예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 고추 품종 식별을 위한 마커의 평가
(1) 고추 시료
본 발명에서는 하기 표 2에 기재된 고추 170개 품종을 고추 품종 식별용 프라이머 세트의 선별 및 고추 품종 식별 가능성 검정을 위해 사용하였다.
연번 품종명 육성회사 연번 품종명 육성회사 연번 품종명 육성회사
1 슈퍼마니따 농우 58 금당 신젠타 115 초지일관 KS
2 홍미인 농우 59 흥이나 동부 116 신세계 사카타
3 PR만세 농우 60 대찬 농우 117 PR드래곤 에코씨드
4 배로따 농우 61 큰살림 농우 118 PR아폴로 에코씨드
5 홍진주 농우 62 한반도 농우 119 무병장수 삼성
6 오복 농우 63 미락홍 현대 120 TPE010 다끼이
7 PR대촌 농우 64 포청천 신젠타 121 홍원 평화
8 PR상생 농우 65 SS-33 삼성 122 강력신건 바이엘
9 PR마니따 농우 66 독야청청 신젠타 123 승자영광 현대
10 PR어울림 농우 67 이플러스 삼성 124 다보탑 몬산토
11 PR열정 농우 68 우리건 삼성 125 일당백골드 신젠타
12 PR금맥 농우 69 대촌 농우 126 적벽대전 바이엘
13 PR신나라 농우 70 당찬 농우 127 금송이 몬산토
14 마니따 농우 71 천통 씨덱스 128 금마루 몬산토
15 만사형통 신젠타 72 홈런왕 씨덱스 129 원기왕성 동부
16 일인자 신젠타 73 태산 농우 130 신옥동자 대농
17 축제 신젠타 74 참마니 농우 131 신독불장군 대농
18 슈퍼비가림 신젠타 75 생생풋 농우 132 예쁜독야청청 신젠타
19 대장부 신젠타 76 녹광 몬산토 133 슈퍼금당 신젠타
20 파워스피드 동부 77 천향맛 농우 134 불도장 신젠타
21 신기원 몬산토 78 화양 제일 135 다홍치마 신젠타
22 부자왕 동부 79 PR자이안트 에코씨드 136 강한건 이서
23 건초왕 삼성 80 TP052 다끼이 137 순한길상 사카타
24 절대강자 삼성 81 금부자 동부 138 PR스마트 농우
25 영웅호걸 삼성 82 맛기찬단 하나 139 따고또따고 아시아
26 B25 삼성 83 뉴라이프 바이엘 140 아시아점보 아시아
27 제왕 삼성 84 새로운PR 몬산토 141 신통방통 아시아
28 수퍼홍 KS 85 PR청탑 현대 142 신초롱 사카타
29 빛고을 사카타 86 신파워불사조 대농 143 골든벨 권농
30 e-풍성한 사카타 87 더블건 대농 144 세농탄두초 농우
31 안전벨트 사카타 88 만나풋 하나 145 세농선초 농우
32 광택나 아시아 89 PR드래곤2 에코씨드 146 세농홍심 농우
33 돌풍 아시아 90 TP034 다끼이 147 고향맛 삼성
34 PR매콤 코레곤 91 하나3호 하나 148 글래머 삼성
35 대들보 다끼이 92 하나2호 하나 149 신화창조골드 삼성
36 지천명 동원 93 하나1호 하나 150 무병장수골드 삼성
37 독무대 동원 94 자주생각 정기오 151 PR건초왕 삼성
38 홍놀부 한터21 95 역대최강 삼성 152 PR부부 삼성
39 PR금고추 몬산토 96 PR돈방석 삼성 153 PR농가왕 삼성
40 PR금강석 몬산토 97 PR액션 삼성 154 거창한 사카타
41 이구동성 몬산토 98 불맛 신젠타 155 세계일 사카타
42 왕대박 몬산토 99 기세등등 사카타 156 아사삭 농진청
43 온누리 몬산토 100 무한질주 신젠타 157 홍연 농진청
44 부촌 몬산토 101 역강홍장군 코레곤 158 홍선 농진청
45 천하제일 몬산토 102 오대양 부농 159 적영 농진청
46 홍보석 몬산토 103 모닝풋 신젠타 160 옹고집 바이엘
47 PR태평 NH 104 아삭이풋 농우 161 RS902 바이엘
48 한민족 NH 105 BN54 사카타 162 파프코레드 삼성
49 PR조강 진흥 106 기립박수 신젠타 163 파프코옐로우 삼성
50 TM강력상장군 권농 107 롱그린맛 농우 164 에코에프79 에코씨드
51 천하태평 동부 108 맵시나 한터21 165 늘푸른플러스 신젠타
52 금상 동부 109 농가왕 삼성 166 마이다스 몬산토
53 빨리따 동부 110 천군만마 삼성 167 스페셜 엔자
54 금수강산 다끼이 111 신사랑풋 동원 168 피에로 신젠타
55 일당백 신젠타 112 강력대통 바이엘 169 쭉쭉빵빵 아시아
56 금탑 몬산토 113 하이그린풋 삼성 170 제일매운청양 제일
57 청양 몬산토 114 한입맛 KS
(2) 게놈 DNA의 추출
상기 표 2에 기재된 공시된 고추 종자를 50공 플러그 육묘판에 파종하고 3주일 경과 후, 연한 부위의 유엽을 채취하여 게놈 DNA의 분리 재료로 이용하였다. 채취한 고추의 유엽이 보관되어 있는 2 ml 튜브에 텅스텐 구슬 3개를 넣고 액체 질소(-196℃)를 이용하여 급속 동결시킨 다음 볼텍싱 (vortexing) 과정을 반복하면서 조직을 고르게 마쇄하였다. 충분히 마쇄된 조직은 NucleoSpin® PlantⅡ(Macherey-Nagel Cat. 740 770.250) 키트를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 추출된 게놈 DNA는 1.0% 아가로스겔에서 전기 영동하여 DNA의 농도를 확인하였고, 정량한 후 ㎕당 10 ng의 농도로 희석한 다음 이를 PCR 분석에 이용하였다.
(3) 품종식별용 SSR primer 선발
고추 품종식별에 효율적인 분자표지를 선발하기 위하여 ‘오추’, ‘선착순’, ‘꺽정’, ‘BN54’, ‘녹광’, ‘하이비타옐로우’, ‘고올’, ‘초대형풋’, ‘원강2호’, ‘금당’, ‘독야청청’, ‘슈퍼대형풋’ 품종의 DNA를 기 보고된 600개 SSR 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 다음 모세관 전기영동 장치(HDA-GT12TM System, eGEnE, Inc.)와 컴퓨터 프로그램 (Biocalculator 2.0)을 활용하여 각 시료별 대립 유전자의 차이를 분석한 다음 밴드의 패턴이 깨끗하며 다형성 정도가 높은 마커 24개를 선정하였다. 이들 24개 마커의 분자 표지에 대해 자동 염기 서열 분석기를 통한 정밀 분석을 추진하기 위하여, 정방향 프라이머가 형광 발생 물질 FAM, VIC, NED 및 PET 중 하나로 형광 표지된 올리고뉴클레오타이드를 제작하였다.
(4) PCR 증폭 및 전기 영동
상기 준비된 게놈 DNA와 상기 제작된 마커를 재료로 하여 PCR을 실시하였다. PCR 반응액의 조성은 상기 제조된 고추 게놈 DNA 20 ng, 0.1 μM의 상기 마커, 2.0㎕ dNTP 혼합물(2.5 mM), Taq polymerase 1U(Takara CAT. RR011A), 2.5 ㎕의 10 x PCR 버퍼(50 mM KCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2.0 mM MgCl2)를 증류수에 첨가하여 전체 부피를 25 ㎕로 조절하였다. PCR(C1000, BioRad, 미국) 증폭은 94℃에서 5분 동안 게놈 DNA를 충분히 변성시킨 다음, 변성은 94℃에서 30초, 어닐링은 55℃에서 30초, 그리고 신장을 72℃에서 45초간 40회 반복 수행하였다. PCR 산물의 최종 신장을 위하여 72℃에서 10분 동안 반응시켰다. 각각의 프라이머 세트에 대한 어닐링 온도는 하기 표 3에 나타내었다. PCR이 완료된 후, 2.8% 아가로스 겔에서 전기영동하여 증폭 여부를 확인하였다. 증폭된 시료들은 다음 실험을 위해 -20℃에서 보관하였다. PCR에 증폭된 시료들은 초순수 150㎕에 적정 농도로 희석한 다음, 희석된 3㎕의 PCR 산물을 탈이온된 포름아마이드(deionized formamide) 10㎕, 대립유전자 크기를 측정하는 사이즈 마커(Size marker)(LIZ500 size standard) 0.25㎕를 잘 혼합하여 섞은 다음 94℃에서 2분간 변성시켰다. 변성시킨 유전자 증폭 산물은 자동 염기 서열 분석장치(Genetic Analyzer 3130XL, Applied Biosystem)를 활용하여 전기영동하였다. 각 품종별 초위성체 분자 표지에 대한 대립유전자 크기는 GeneMapper3.7 컴퓨터 프로그램(Applied Biosystem)을 이용하여 정확하게 측정하였다.
(5) 본 발명에 따른 마커의 고추 품종 식별 가능성 검정
상기에서 자동염기서열분석기로 확인한 대립유전자 크기를 이용하여 본 발명에 따른 마커의 고추 품종 식별 가능성을 조사하였다. 하기 식 1을 사용하여 PIC(polymorphism information content)값을 산출하였다. 하기 식에서 Pij는 마커 i의 밴드들 중에서 j번째 공통 밴드 패턴의 빈도수이다(Anderson et al., 1993, Genome 36: 181-186).
<식 1>
Figure 112012093992964-pat00001
그 결과, 각 마커에 따른 어닐링 온도(℃), 증폭 산물의 크기(bp), 대립 유전자의 수 및 PIC 값을 하기 표 3에 나타내었다.
연번 SSR 마커명 어닐링 온도(℃) 대립유전자의 크기(bp) 대립유전자의 수 PIC 값
1 CAMS051 55 155-165 5 0.610
2 CAMS117 55 216-240 11 0.753
3 CAMS336 55 144-175 6 0.547
4 CAMS351 55 187-218 11 0.788
5 CAMS855 55 242-291 9 0.635
6 GPMS029 50 250-262 5 0.523
7 GPMS100 50 170-173 2 0.324
8 GPMS117 55 133-148 8 0.685
9 GPMS159 55 284-325 14 0.814
10 GPMS161 55 248-265 7 0.770
11 GPMS194 60 224-246 5 0.558
12 GPMS197 58 275-335 15 0.802
13 EPMS305 55 064-088 5 0.559
14 EPMS331 55 070-104 11 0.710
15 EPMS376 55 250-263 5 0.788
16 EPMS386 55 125-158 9 0.824
17 EPMS418 55 194-208 6 0.808
18 EPMS426 55 099-119 4 0.788
19 EPMS441 55 117-129 5 0.670
20 EPMS542 58 171-189 4 0.520
21 EPMS642 55 187-209 5 0.695
22 EPMS643 55 197-219 4 0.748
23 EPMS709 50 259-278 6 0.744
24 EPMS755 50 138-145 2 0.496
총계 　 　 　 164 16.156
평균 　 　 　 6.833 0.673
상기 표 3에서 살핀 바와 같이, 본 발명에서 활용된 마커 중 2개(GPMS100, EPMS755)는 0.50보다 낮은 PIC 값을 나타내었고, 나머지 22개는 0.520~0.814까지 높은 PIC 값을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 마커는 고추 품종을 충분히 식별 가능하게 할 수 있음을 알 수 있다.
또한 마커에 대해 대립 유전자의 크기에 따른 품종 밴드의 유무에 따라 NTSYS pc(version 2.10b) (Rohlf, 2000, Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System-Version 2.10b. Applied Biostatistics Inc., New York.) 컴퓨터 프로그램에 입력하고 Jaccard's 방법 (Sneath and Sokal 1973, Numerical taxonomy : The Principles and Practice of Numerical Classification, W. H. Freeman, San Francisco.)에 준하여 유전적 유사도 값을 계산하였다. 유전적 유사도를 이용하여 UPGMA (Unweighted Pair-group Method with Arithmetical Average)(Sneath and Sokal, 1973) 방법에 의해 집괴 분석하여 계통도(dendrogram)를 작성하였고 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 따르면 본 발명의 프라이머 세트는 국내에서 유통되고 있는 170개 고추 품종의 식별이 가능하게 함을 알 수 있다.
실시예 2: 고추 품종 식별
(1) 본 발명의 마커를 이용한 품종 식별표 작성
국내에서 육성되는 170개 고추 품종 각각으로부터 게놈 DNA를 상기 실시예 1의 (2)의 방법에 따라 추출하였다. 본 발명의 24개 마커를 프라이머 세트로 이용하여 상기 실시에 1의 (4)의 방법에 따라 PCR을 실시하였다. PCR 결과물로부터 본 발명에 따른 마커에 대해 밴드의 유무를 판별하여 밴드가 존재할 경우에는 점수 1로 코드화하고 밴드가 존재하지 않을 경우에는 0으로 코드화함으로써, 본 발명의 마커를 이용한 170개 고추 품종 각각에 대한 품종 식별표를 작성하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 나타난 바와 같이 본 발명의 마커에 따른 대립 유전자수에 따라 고추 품종 각각은 서로 다른 형태의 밴드 크기를 나타내었다. 예를 들어, 표 2에서 고추의 품종 연번 100인 ‘무한질주’ 품종은 분자 표지 CAMS51로 증폭할 경우 157 bp와 163 bp 크기의 2개 대립 유전자가 존재한다.
(2) 고추 품종 식별
품종을 식별하고자 하는 고추의 종자를 50공 플러그 육묘판에 파종하고 3주일 경과 후, 연한 부위의 유엽을 채취하여 게놈 DNA의 분리 재료로 이용하였다. 채취한 고추의 유엽이 보관되어 있는 2 ml 튜브에 텅스텐 구슬 3개를 넣고 액체 질소(-196℃)를 이용하여 급속 동결시킨 다음 볼텍싱(Vortexing) 과정을 반복하면서 조직을 고르게 마쇄하였다. 충분히 마쇄된 조직은 NucleoSpin® PlantⅡ(Macherey-Nagel Cat. 740 770.250) 키트를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 추출된 게놈 DNA는 1.0% 아가로스 겔에서 전기영동하여 DNA의 농도를 확인하였고, 정량한 후 ㎕당 10 ng의 농도로 희석하였다.
본 발명의 24개 마커 각각을 프라이머 세트를 이용하여 상기 추출한 게놈 DNA를 PCR로 증폭하고 전기영동 하였다. PCR 증폭 및 전기 영동은 상기 실시예 1에서 기술된 방법과 동일한 방법을 사용하였다. 각각의 전기영동 결과물에서 나타난 밴드의 유무를 도 2의 결과와 비교하였다. 품종을 식별하고자 했던 고추는 ‘무한질주’ 품종의 밴드 유무와 동일한 밴드 형태를 나타내었으므로, ‘무한질주’ 품종으로 확인되었다.
실시예 3: 고추 F1 종자 순도 검정용 마커의 선별
고추 170개 품종에 대하여 상기 실시예 2의 (1)에 따라 품종 식별표를 작성하였다(도 2a 내지 도 2i 참조). 고추 170개 품종 중 ‘무한질주’ 품종에 대한 종자를 마쇄한 다음 상기 실시예 2의 (2)와 동일한 방법으로 DNA를 분리하였다. 상기 분리한 DNA에 대해서 표 3에 기재된 24개의 프라이머로 사용하여 증폭한 후 대립 유전자의 크기와 수를 관찰하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 의하면, 마커 CAMS117, CAMS336, CAMS855, GPMS100, GPMS194, EPMS331, EPMS418, EPMS441, EPMS709, EPMS755는 1개의 대립유전자만을 나타내어 양친을 구분하지 못하므로 F1 종자의 순도 검정에는 사용할 수 없다. 그러나, 마커 CAMS051, CAMS351, GPMS029, GPMS117, GPMS159, GPMS161, GPMS197, EPMS305, EPMS376, EPMS386, EPMS426, EPMS542, EPMS642, EPMS643은 F1 품종의 양친 특이적인 대립 유전자 2개가 뚜렷하게 구분되는 것으로 나타났다. 따라서, 이들 마커는 고추 ‘무한질주’ 품종의 양친을 식별할 수 있어, F1 품종이 양친의 정상적인 교배로 생성되었음을 판단하기 위한 마커로 사용될 수 있다.
실시예 4: 고추 F1 종자의 순도 검정
순도를 검정하고자 하는 ‘무한질주’ 품종의 종자에 대해 상기 실시예 2의 (2)에서 기재된 바에 따라 DNA를 분리하였다. 분리한 DNA에 대해서 마커 CAMS051, CAMS351, GPMS029, GPMS117, GPMS159, GPMS161, GPMS197, EPMS305, EPMS376, EPMS386, EPMS426, EPMS542, EPMS642, EPMS643을 프라이머로 사용하여 증폭하였다. 증폭 조건은 상기 실시예 1의 (4)에서 기재된 바와 동일하게 실시하였다. 그 결과 품종에 특이적인 대립 유전자의 개수가 2개가 나타났다. 따라서 실험한 ‘무한질주’ F1 품종의 종자는 양친의 정상적인 교배로부터 생성된 순종인 것으로 검정할 수 있었다.
<110> Korea Seed & Variety service <120> A method for identifying hot pepper varieties using microsatellites markers <130> PN099244 <160> 48 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAMS051_F primer <400> 1 acccagttcc ctttcttggt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAMS051_R primer <400> 2 gaaggttagc ggaatgaacg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAMS117_F primer <400> 3 ttgtggagga aacaagcaaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAMS117_R primer <400> 4 cctcagccca ggagacataa 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAMS336_F primer <400> 5 ggtggaaact tgcttggaga 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAMS336_R primer <400> 6 cccagaacca tccacctact 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAMS351_F primer <400> 7 cgcatgaagc aaatgtacca 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAMS351_R primer <400> 8 acctgcagtt tgttgttgga 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAMS855_F primer <400> 9 aagtgtcaag gaaggggaca 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAMS855_R primer <400> 10 cctaaccacc cccaaaagtt 20 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPMS029_F primer <400> 11 caggcaatac ggagcatc 18 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPMS029_R primer <400> 12 tgtgttgctt cttggacgac 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPMS100_F primer <400> 13 tccatacggt tggaggagag 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPMS100_R primer <400> 14 actatgctct gctgtgccct 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPMS117_F primer <400> 15 gatgttaggt ccgtgcttcg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPMS117_R primer <400> 16 aagccccatg gaagttatcc 20 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPMS159_F primer <400> 17 aagaacatga ggaactttaa ccatg 25 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPMS159_R primer <400> 18 ttcacccttc tccgactcc 19 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPMS161_F primer <400> 19 cgaaatccaa taaacgagtg aag 23 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPMS161_R primer <400> 20 cctgtgtgaa caagttttca gg 22 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPMS194_F primer <400> 21 aggtggcagt tgaggctaag 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPMS194_R primer <400> 22 gttctaggtc tttgccctgg 20 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPMS197_F primer <400> 23 gcagagaaaa taaaattctc gg 22 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPMS197_R primer <400> 24 caatggaaat ttcatcgacg 20 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPMS305_F primer <400> 25 cgtctttcac ttgtcttttg ttc 23 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPMS305_R primer <400> 26 agtgggttca ctgacttggg 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPMS331_F primer <400> 27 aacccaatcc ccttatccac 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPMS331_R primer <400> 28 gcattagcag aagccatttg 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPMS376_F primer <400> 29 acccaccttc atcaacaacc 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPMS376_R primer <400> 30 atttgtggct tttcgaaacg 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPMS386_F primer <400> 31 acgccaagaa aatcatctcc 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPMS386_R primer <400> 32 ccattgctga agaaaatggg 20 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPMS418_F primer <400> 33 atcttcttct catttctccc ttc 23 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPMS418_R primer <400> 34 tgctcagcat taacgacgtc 20 <210> 35 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPMS426_F primer <400> 35 gaggaaacac tctctctctc tctctc 26 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPMS426_R primer <400> 36 tcaagagacc ccaaataggg 20 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPMS441_F primer <400> 37 gcacgaggaa agagagagac atag 24 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPMS441_R primer <400> 38 tcaacggatt cagtcttccc 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPMS542_F primer <400> 39 atccacttcc ccattatccc 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPMS542_R primer <400> 40 tggatgatcg agttgactgg 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPMS642_F primer <400> 41 caacttcgcg ttattgtcca 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPMS642_R primer <400> 42 agggcggaca aagaagattt 20 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPMS643_F primer <400> 43 ccaagatcaa ctcttacgct at 22 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPMS643_R primer <400> 44 cccctcaaga attccctcca t 21 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPMS709_F primer <400> 45 acgccgagga ctatgatgac 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPMS709_R primer <400> 46 ttcttcatcc tcagcgtgtg 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPMS755_F primer <400> 47 cgctcgctac cctttcatta 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPMS755_R primer <400> 48 aatttcggaa gggcaaagat 20

Claims (8)

  1. 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CAMS051 프라이머 세트;
    서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CAMS117 프라이머 세트;
    서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CAMS336 프라이머 세트;
    서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CAMS351 프라이머 세트;
    서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CAMS855 프라이머 세트;
    서열번호 11 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 GPMS029 프라이머 세트;
    서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 GPMS100 프라이머 세트;
    서열번호 15 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 GPMS117 프라이머 세트;
    서열번호 17 및 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 GPMS159 프라이머 세트;
    서열번호 19 및 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 GPMS161 프라이머 세트;
    서열번호 21 및 서열번호 22의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 GPMS194 프라이머 세트;
    서열번호 23 및 서열번호 24의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 GPMS197 프라이머 세트;
    서열번호 25 및 서열번호 26의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 EPMS305 프라이머 세트;
    서열번호 27 및 서열번호 28의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 EPMS331 프라이머 세트;
    서열번호 29 및 서열번호 30의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 EPMS376 프라이머 세트;
    서열번호 31 및 서열번호 32의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 EPMS386 프라이머 세트;
    서열번호 33 및 서열번호 34의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 EPMS418 프라이머 세트;
    서열번호 35 및 서열번호 36의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 EPMS426 프라이머 세트;
    서열번호 37 및 서열번호 38의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 EPMS441 프라이머 세트;
    서열번호 39 및 서열번호 40의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 EPMS542 프라이머 세트;
    서열번호 41 및 서열번호 42의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 EPMS642 프라이머 세트;
    서열번호 43 및 서열번호 44의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 EPMS643 프라이머 세트;
    서열번호 45 및 서열번호 46의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 EPMS709 프라이머 세트; 및
    서열번호 47 및 서열번호 48의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 EPMS755 프라이머 세트를 모두 포함하는, 고추 품종 식별용 프라이머 세트.
  2. 고추로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고 청구항 1의 고추 품종 식별용 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물로부터 상기 고추의 품종을 식별하는 단계를 포함하는, 고추 품종을 식별하는 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 얻어진 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 고추 품종을 식별하는 방법.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 게놈 DNA는 상기 고추의 종자 또는 어린 식물체의 잎, 줄기 및 과실로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 고추 품종을 식별하는 방법.
  5. 청구항 2에 있어서, 상기 증폭 산물로부터 고추 품종을 식별하는 단계는 각각의 고추 품종에 대해 청구항 1의 고추 품종 식별용 프라이머 세트에 의한 증폭 산물의 유무를 표로 작성하고 상기 증폭된 산물과의 비교 분석에 의해 고추 품종을 식별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 고추 품종을 식별하는 방법.
  6. 고추로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고 청구항 1의 고추 품종 식별용 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭하는 단계;
    상기 증폭 산물에서 품종 특이적인 대립 유전자를 나타내며 대립 유전자의 개수가 2개로 나타난 프라이머 세트를 선별하는 단계;
    순도를 검정하고자 하는 고추의 F1 품종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 상기 선별된 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 산물이 상기 품종 특이적인 대립 유전자의 크기를 가지면서 대립 유전자의 수가 2개로 나타난 상기 고추의 F1 품종은 순종인 것으로 판별하는 단계를 포함하는, 고추 일대 잡종(F1) 품종의 순도를 검정하는 방법.
  7. 청구항 1의 고추 품종 식별용 프라이머 세트, DNA 중합 효소 및 PCR 완충 용액을 포함하는 고추 품종 식별용 키트.
  8. 청구항 1의 고추 품종 식별용 프라이머 세트, DNA 중합 효소 및 PCR 완충 용액을 포함하는 고추 일대 잡종(F1) 품종의 순도 검정용 키트.
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CN112877453B (zh) * 2021-01-26 2022-11-22 北京市农林科学院 一种鉴定辣椒品种真实性的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090085843A (ko) * 2008-02-05 2009-08-10 재단법인서울대학교산학협력재단 시판 고추 ｆ1 품종 식별을 위한 ｓｎｐ 마커
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Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090085843A (ko) * 2008-02-05 2009-08-10 재단법인서울대학교산학협력재단 시판 고추 ｆ1 품종 식별을 위한 ｓｎｐ 마커
KR20110111069A (ko) * 2010-04-02 2011-10-10 대한민국(국립종자원장) 초위성체 마커를 이용한 오이 품종 식별 방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Genome, Vol. 50, pp. 668-688 (2007.08.03.) *
Mol. Breeding, Vol. 18, pp. 157-169 (2006.08.29.) *

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