KR101555972B1 - 초위성체 마커를 이용한 호박 품종 식별 방법 - Google Patents

초위성체 마커를 이용한 호박 품종 식별 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101555972B1
KR101555972B1 KR1020130126723A KR20130126723A KR101555972B1 KR 101555972 B1 KR101555972 B1 KR 101555972B1 KR 1020130126723 A KR1020130126723 A KR 1020130126723A KR 20130126723 A KR20130126723 A KR 20130126723A KR 101555972 B1 KR101555972 B1 KR 101555972B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
primer set
oligonucleotides
amber
set consisting
Prior art date
Application number
KR1020130126723A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20150047016A (ko
Inventor
권용삼
홍지화
최근진
Original Assignee
대한민국
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대한민국 filed Critical 대한민국
Priority to KR1020130126723A priority Critical patent/KR101555972B1/ko
Publication of KR20150047016A publication Critical patent/KR20150047016A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101555972B1 publication Critical patent/KR101555972B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/151—Modifications characterised by repeat or repeated sequences, e.g. VNTR, microsatellite, concatemer

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 국내에서 유통되고 있는 호박 품종에 대하여 다형성을 나타내는 호박 품종 식별용 초위성체 마커를 이용한 호박 품종의 식별 방법 및 상기 초위성체 마커를 포함하는 키트에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 국내외서 유통되고 있는 호박 160개 품종에 대해 높은 다형성을 갖는 초위성체 마커의 조합을 선별하고 이를 이용하여 국내 종자시장에서 유통되고 있는 호박 품종을 식별할 수 있게 할 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용된 호박 품종 식별용 분자 표지는 국내에서 유통되고 있는 호박 160개 품종을 식별할 수 있을 뿐만 아니라 모든 품종에 대하여 양친을 식별하는 이형접합성을 나타내는 마커가 있기 때문에 F1 종자의 순도 검정에 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 농가와 종자 회사 또는 종자 회사와 종자 회사 간에 발생하는 종자 분쟁 발생시 이를 해결할 수 있는 중재 수단의 제공, 시중에서 유통되고 있는 호박 품종의 진위성 규명, 품종 보호 출원시 대조 품종의 선정, 권리침해 여부의 사전 모니터링 및 F1 종자의 순도확인 등과 같은 여러 분야에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

초위성체 마커를 이용한 호박 품종 식별 방법{A method for identifying pumpkin varieties using microsatellites markers}
본 발명은 국내 종자 회사에 육성된 호박 품종에 대해 다형성을 나타내는 초위성체 마커, 상기 마커를 이용한 호박 품종의 식별 방법 및 호박 F1 종자 순도 확인 방법, 및 상기 마커를 포함하는 키트에 관한 것이다.
국제 식물 신품종 보호 동맹(UPOV)에서는 품종보호제도 및 품종식별에 분자 마커의 활용시 신뢰도 높은 결과 도출 및 이를 활용한 데이터베이스를 구축하기 위하여, 유전자 분석 방법의 선정, DNA 마커의 선정 기준, DNA 분리 방법 및 데이터베이스 구축 등에 대한 가이드라인을 제시하고 있다. 이 가이드라인에서는 분자 마커의 활용시 실험실 및 연구자 간에 반복 재현성이 높을 뿐만 아니라 공우성을 나타내며, 이용된 분자 마커가 염색체상에 고르게 분포되어 있을 뿐만 아니라 여러 가지 분석 장비를 활용하더라도 동일한 결과를 나타내어야 한다는 기준을 제시하고 있다. 이러한 기준에 가장 적합한 유전자 분석 방법이 염색체상에 존재하는 단순 반복 염기서열의 차이를 활용하여 분석 재료 및 품종 간에 다형성을 확인하는 SSR(simple sequence repeat) 분석 방법이라고 할 수 있다.
유럽연합품종보호사무소(CPVO)에서는 밀, 감자, 장미, 토마토, 유채 등과 같은 작물을 대상으로 하여 여러 국가의 실험실이 공동으로 참여하는 DNA 검정 컨소시엄을 구성하여 분석 마커와 재료 및 실험실간에 오차를 비교 분석하고 각 작물별 100 내지 500 품종 이상에 대한 DNA 프로파일 데이터베이스를 구축하여 그 연구 결과를 발표하고 있다. 일본에서는 밥, 통조림, 돗자리 등과 같은 품종보호 등록품종의 수확물 및 가공품과 복숭아, 사과, 밤, 감귤 등과 같은 과수에 대하여 유전자 분석 체계를 구축하여 농업 생산물의 가공품에 대한 품종 확인 및 자국 농산물의 보호 등과 같은 분야에 적극 활용하고 있다. 최근에는 영양번식 작물의 권리분쟁 발생시 신속한 유전자 분석 및 향후 DNA 검정 신기술 개발시 분석 재료로 활용하기 위한 목적으로 203 작물 2500여 품종에 대한 DNA를 보관하고 있다.
한편, 우리나라의 경우 국립종자원에서 종자시장에서 중요도가 높거나 분쟁의 발생 가능성이 높은 채소작물인 고추, 수박, 무, 배추, 멜론, 오이 등과 같은 작물에 대하여 다형성이 높은 SSR 마커를 활용하여 작물당 200~600 품종 이상에 대한 DNA 프로파일 데이터베이스를 구축하였거나 구축 중에 있다. 실제로 이 결과를 품종보호출원 품종의 대조품종 선정 및 품종보호 재배심사시 구별성, 균일성 및 안정성을 확인하는데 이용되고 있다. 최근에는 품종보호등록 당시의 종자와 육종가가 제출한 기본식물의 종자를 유전자 분석을 수행한 다음 분석 결과가 상이하게 나타난 품종을 재배시험에 의한 특성조사를 실시하여 품종보호등록 품종의 진위 여부를 확인하는 등 그 활용 범위를 점차 확대하고 있다. 또한 품종식별 분자 마커는 농가와 종자 회사, 농가와 육묘장 및 종자회사 간에 발생하는 품종 진위성과 관련된 종자분쟁 발생시 이를 중재하기 위한 하나의 수단으로 적극 활용되고 있는 실정이다.
호박은 박과에 속하는 1년생 덩굴성 초본식물로 서양계(Cucurbita maxima), 동양계(Cucurbita . moshata), 페포계(Cucurbita pepo), 종간잡종(C. moshata/C. pepo, C. moshata/C. moshata), 흑종(Cucurbita ficifolia) 호박으로 크게 나눌 수 있으며, 다양한 형태의 품종들이 육성되어 생산 수입판매 신고된 855 품종과 품종보호 출원 및 등록된 49품종이 국내시장에서 유통되고 있다. 우리나라 호박 재배 면적은 2013년 기준 단호박 소비의 대중화 등으로 인해 수요가 지속적으로 늘어나면서 전년보다 재배면적이 1% 증가한 1만 518ha로 예상된다. 또한 생산량은 34만 2000톤으로 2012년보다 소폭 증가할 것으로 추정되며 특히 단호박의 꾸준한 수입으로 인해 2013년 수입량은 2만4000톤에 이를 정도로 경제적 중요성이 높아지고 있는 작물중의 하나이다.
호박에 대한 분자유전학적 연구 동향을 살펴보면, 2002년에 페포계와 동양계 호박이 교배된 종간잡종 집단을 활용하여 RAPD, AFLP, SSR 마커를 활용하여 유전자 지도 작성하였으나(Brown RN and Myers JR. 2002. J Am Soc Hortic Sci 127:568-575) 유전자 지도상에 위치한 SSR 마커가 27개에 불과할 정도로 연구가 미진한 실정이었다. 따라서 이러한 문제점을 보완하기 위하여 오스트리아에서는 500개의 SSR 마커를 개발하여 이중 페포계와 동양계 호박에 다형성을 보이는 405개의 분자 마커를 활용하여 고밀도 유전자 지도를 작성하였고(Gong L, Stift G, Kofler R, Pachner M and Lelley T. 2008. Theoretical Applied Genetics. 117, 37-48), 이 마커를 활용하여 페포계 호박의 유전자원의 특성 평가(Gong L, Paris HS, Nee MH, Stift G, Pachner M, Vollmann J and Lelley T. 2012. Theoretical Applied Genetics. 124, 875-891) 등에 대한 여러 가지 연구결과가 발표된 바 있다. 최근, 수박, 멜론, 호박, 오이 등과 같은 박과 작물의 유전체 연구 프로젝트(http://www.icugi.org/)가 시작되면서 호박의 경우도 페포계 호박의 EST를 기반으로하여 SSR 및 SNP 마커를 개발하여 유전자 지도 작성 및 양적형질과 연관된 유전자좌의 맵핑 등에 대한 연구성과도 보고되고 있다(Esteras C, Gomez P, Monforte AJ, Blanca J, Vicente-Dolera N, Roig C, Nuez F and Pico B. 2012. BMC Genomics13:8). 이러한 국외 연구결과를 종합해 볼 때 국내 호박 품종을 UPOV가 제안한 유전자 분석 기법의 하나인 SSR 마커에 의해 식별할 수 있는 방법은 미확립된 상태일 뿐만 아니라 이를 자동염기서열분석기를 활용하는, 정확한 품종 구별 DNA 프로파일은 구축되어 있지 않은 실정이다.
이에 본 발명자는 국내에서 육성된 호박 160개 품종에 대해 다형성을 나타내는 초위성체 마커를 선별하고, 이들 초위성체 마커 세트를 이용하여 호박 게놈 DNA를 증폭시킨 후 생성된 증폭 산물을 확인함으로써, 대립유전자 패턴 및 PIC(Polymorphic Information Content) 값을 살펴 보았을 때 상기 초위성체 마커가 호박 품종 식별 방법에 적합함을 확인하였다. 또한, 공시된 모든 호박 품종의 양친을 식별할 수 있는 이형접합성을 가진 분자표지가 존재하는 것을 확인하여 이 마커 세트는 호박 종자의 순도검정에도 매우 유용하게 이용될 수 있는 것으로 판단하였다. 이러한 결과는 품종 보호 출원시 대조 품종 선정, 종자 분쟁 발생시 품종 진위성에 대한 과학적 검증, 종자 유통 관리 및 F1 종자의 품질관리 등 다양한 방면에 실용적으로 활용될 수 있을 것이다.
본 발명의 목적은 우리나라에서 유통되고 있는 호박 160개 품종에 대해 높은 다형성을 나타내는 초위성체 마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 초위성체 마커를 이용하는 호박 품종 식별 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 종자 회사에서 육종된 호박 품종에 대한 유전적 유사도를 DNA 수준에서 예측 가능하게 함으로써 이를 품종 보호 출원시 대조품종 선정에 직접 활용할 수 있게 하는 호박 품종 식별 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 호박 품종에 대한 진위성 검정에 분자생물학적 기술을 접목하여 종자 시장에서 판매되는 호박 품종의 진위성 여부를 실험실 수준에서 판단함으로써, 불량 종자의 유통을 근절하는데 크게 기여할 수 있고, 농가와 종자 회사, 육묘업체와 농가 또는 종자 회사와 종자 회사간에 발생하는 품종 진위성과 관련된 종자 분쟁 해결에 매우 유용하게 이용될 수 있는, 호박 품종 식별 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 호박 품종 식별에 활용된 분자 표지 중에서 품종에 따라 2개의 대립유전자를 나타내는 것은 이 품종 육성시 교배된 양친의 유전자형을 나타내기 때문에, F1 품종에 대해 양친의 교배 여부를 DNA 수준에서 확인할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 국내외에서 유통되고 있는 호박 품종에 대하여 다형성을 나타내는, 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTp137 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTp245 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTp252 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTp254 프라이머 세트; 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTp257 프라이머 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm7 프라이머 세트; 서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm18 프라이머 세트; 서열번호 15 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm19 프라이머 세트; 서열번호 17 및 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm20 프라이머 세트; 서열번호 19 및 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm34 프라이머 세트; 서열번호 21 및 서열번호 22의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm35 프라이머 세트; 서열번호 23 및 서열번호 24의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm37 프라이머 세트; 서열번호 25 및 서열번호 26의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm48 프라이머 세트; 서열번호 27 및 서열번호 28의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm52 프라이머 세트; 서열번호 29 및 서열번호 30의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm54 프라이머 세트; 서열번호 31 및 서열번호 32의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm60 프라이머 세트; 서열번호 33 및 서열번호 34의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm61 프라이머 세트; 서열번호 35 및 서열번호 36의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm63 프라이머 세트; 서열번호 37 및 서열번호 38의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm80 프라이머 세트; 서열번호 39 및 서열번호 40의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm87 프라이머 세트; 서열번호 41 및 서열번호 42의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm88 프라이머 세트; 서열번호 43 및 서열번호 44의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm91 프라이머 세트; 서열번호 45 및 서열번호 46의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm111 프라이머 세트; 서열번호 47 및 서열번호 48의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm119 프라이머 세트; 서열번호 49 및 서열번호 50의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm128 프라이머 세트; 서열번호 51 및 서열번호 52의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm135 프라이머 세트; 서열번호 53 및 서열번호 54의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm137 프라이머 세트; 서열번호 55 및 서열번호 56의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm162 프라이머 세트; 및 서열번호 57 및 서열번호 58의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm164 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트(이하 '서열번호 1 내지 서열번호 58의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 29쌍의 프라이머 세트 중 하나 이상의 프라이머 세트'라고도 함)를 포함하는, 호박 품종을 식별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
상기 프라이머 세트는 국내에서 유통되고 있는 호박 160개 품종에 대해 높은 다형성을 나타내는 초위성체 마커를 위한 프라이머 세트로서, 국내에서 유통되고 있는 호박 품종을 특이적으로 식별할 수 있다. 본 발명의 마커는 서열번호 1 내지 서열번호 58의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 29쌍의 프라이머 세트 중 하나 이상의 프라이머 세트를 통해 얻어진 증폭 산물(들)을 의미할 수 있다. 본 발명의 마커는 하기 표 2에 기재된 호박 160개 품종에 대하여 높은 다형성을 나타낸다. 바람직하게는, 본 발명의 마커는 상기 29쌍의 프라이머 세트 모두를 이용하여 얻어진 증폭 산물을 포함할 수 있다. 본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 58의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 29쌍의 프라이머 세트를 하기 표 1에 나타내었다.
서열
번호		 초위성체
표지인자		 프라이머의 염기서열 (5' →3') 형광표지
1 CMTp137
 정방향: TGAAATCTCTGCGAGACAAAAG FAM
2 역방향: AATTCAGATTGAGAGGGAGGTG
3 CMTp245
 정방향: AGGTAACTGCACCCCAGCTA VIC
4 역방향: CCCATCTCTCAAGCTCATCC
5 CMTp252
 정방향: TCTCACTCATCCACCACACC NED
6 역방향: CGTTTCGAGTCATTTGTTCG
7 CMTp254
 정방향: CCCCACATCCATATATCCACA PET
8 역방향: CTCCAATGCACAACCTTGC
9 CMTp257
 정방향: CACGAAGATTTGATGGCCTTA FAM
10 역방향: GGATTGGGATGGTGAAGATG
11 CMTm7
 정방향: AACCAAACTCCGGCAAGA VIC
12 역방향: GTTCTCTCCGTTCAGGATGG
13 CMTm18
 정방향: ATGGGTTTCACCAAAAGCTG NED
14 역방향: AAGCGGACGACTGACGAC
15 CMTm19
 정방향: GCATGGGAGATGAAGGTTAG PET
16 역방향: ATTTCCTGGTGGTATGAGATTC
17 CMTm20
 정방향: GTGGGCCATATCGATTCACT FAM
18 역방향: CGAAAGTCGCAGAGAACACA
19 CMTm34
 정방향: TGAAACTACACTACATGACCTTGG VIC
20 역방향: TGGGTTGGTAGACTTGTAGTTGA
21 CMTm35
 정방향: CATCAGGTTATTGAGTTTTACTCAGAC NED
22 역방향: TCGTCTGCCCCAATAATTC
23 CMTm37
 정방향: CGTGTTTGTGTTGGAAAAGC PET
24 역방향: AAGCAAACCCACAGAAGGAG
25 CMTm48
 정방향: AAGCCTTTGGGGACCTTTAC FAM
26 역방향: TTGAAACCTTCAAACAAGAAATTG
27 CMTm52
 정방향: GCTCTCCATTTTCCAGCTTC VIC
28 역방향: GACGCAGAGGGAGATTAATGA
29 CMTm54
 정방향: GTGTGGATGCAAATGGTGAG NED
30 역방향: GGGAATCGAGGGTTTTGAAT
31 CMTm60
 정방향: TCCTCCAAAGCATACCAACTGT PET
32 역방향: GCGCCATTTTATTGATTGGAT
33 CMTm61
 정방향: GCCATTATTCCACTCCATGC FAM
34 역방향: TGCCTGCACCTGTTTTAGC
35 CMTm63
 정방향: GCAGAAGATACCGTCGGAGT VIC
36 역방향: AAGGTGAACGGGAATGTGAG
37 CMTm80
 정방향: GGCCTAATGGGTTGTGAAGA NED
38 역방향: AGTGGAATCCATTTGTTCGTG
39 CMTm87
 정방향: AATCTGCAAACGGACTTCAAT PET
40 역방향: TCACAGTGATCCCCAAACTC
41 CMTm88
 정방향: CATCGACATTCGCCTCATC FAM
42 역방향: AGGCAGCTTCCAAATCAGC
43 CMTm91
 정방향: CCCTAGAATTAGTGGGCAAT VIC
44 역방향: TAGGCCTAAAAAGACCCAAT
45 CMTm111
 정방향: CTCCATTCCCATGGCTTC NED
46 역방향: CCATGAGCTTGAGAGAGGTG
47 CMTm119
 정방향: GAAGCTGCCGGAAGTTAGC PET
48 역방향: GGGACCACCCTCTTCTCTTC
49 CMTm128
 정방향: ACCAATTTTTGATTTTCAGTTTGC FAM
50 역방향: AGGGGGAAGAAAAGCGAAG
51 CMTm135
 정방향: GTGGCCGTAGGTTTGTCAGT VIC
52 역방향: TCAGAGAATCGGAGCAGAGAG
53 CMTm137
 정방향: ACGTTCTTTCTGCCTCCAT NED
54 역방향: ATGCCCATTATGCAATTCTC
55 CMTm162
 정방향: TGGATGGGGAAATTATTGGA PET
56 역방향: ATTCAGGGGAGATTGGGACT
57 CMTm164
 정방향: AGCCTTTCAGAAGAACCAAG FAM
58 역방향: GGCTTCAAACAAATACTAACCA
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 58의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 29쌍의 프라이머 세트 중 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 호박 품종을 식별하기 위한 키트를 제공한다. 바람직하게는, 상기 키트는 상기 29쌍의 프라이머 세트를 모두 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 또한, DNA 중합 효소 및 PCR 완충 용액(buffer)을 포함할 수 있다. 이외에 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 호박으로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 내지 서열번호 58의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 29쌍의 프라이머 세트 중 하나 이상의 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및 얻어진 증폭 산물로부터 상기 호박의 품종을 결정하는 단계를 포함하는, 호박 품종을 식별하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 증폭 단계는 상기 29쌍의 프라이머 세트를 모두 사용하여 핵산을 증폭하는 것일 수 있다.
상기 게놈 DNA는 호박의 종자, 호박의 식물 전체로부터 DNA를 채취하는 통상적인 방법을 사용함으로써 얻을 수 있다. 예를 들면, 상기 게놈 DNA는 호박의 종자 또는 호박의 잎, 줄기, 과육 또는 뿌리로부터 유래될 수 있고, 특히 종자를 파종하고 출아한 후의 호박의 어린 식물체의 잎으로부터 채취될 수 있다.
상기 방법에서 게놈 DNA의 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)을 사용하는 것이 바람직하다. 일반적인 PCR 수행 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다. 구체적으로, PCR 반응은 당업계에서 PCR 반응에 필요하다고 알려진 여러 성분을 포함하는 PCR 반응액을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 PCR 반응액은 분석하고자 하는 호박으로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합 효소(예를 들면, Taq polymerase), dNTP 혼합물, PCR 완충 용액(buffer) 및 물을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유할 수 있다.
상기 방법에서 얻어진 증폭 산물로부터 상기 호박의 품종을 결정하는 단계는, 증폭된 산물에 대한 검출 결과를, 상기 29쌍의 호박 품종 식별용 프라이머 세트에 의해 공지된 호박 품종의 핵산을 증폭한 결과와 비교함으로써 수행되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 증폭된 산물로부터 호박 품종을 결정하는 단계는 자동 염기 서열 분석기를 이용하여 증폭 산물(밴드)의 크기를 컴퓨터 프로그램에 의해 확인함으로써 수행되는 것일 수 있다. 예를 들면, 공지된 호박 품종에 대하여 본 발명의 프라이머 세트를 통해 증폭된 산물(각 대립 유전자에 해당함)의 유무를 미리 하나의 표로 정리한다. 구체적으로, 대립 유전자가 존재할 때에는 "1"로 나타내고 대립 유전자가 존재하지 않을 때에는 "0"으로 나타낸다. 품종을 식별하고자 하는 호박으로부터 게놈 DNA를 분리한 후, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭하고 증폭된 산물의 크기를 분석한 다음, 이 분석 결과를 상기 공지된 호박 품종의 핵산을 증폭한 결과와 통계 프로그램을 통하여 비교함으로써 호박의 품종을 결정할 수 있다.
또한, 본 발명은 호박 F1 품종의 순도를 검정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 호박으로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 내지 서열번호 58의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 29쌍의 프라이머 세트 중 하나 이상의 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭하는 단계; 품종 특이적인 대립유전자를 가지면서 대립유전자의 개수가 2개인 증폭 산물을 갖는 프라이머 세트를 선별하는 단계; 순도를 검정하고자 하는 호박의 F1 품종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 선별된 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및 증폭 결과 품종 특이적인 대립유전자를 가지면서 대립유전자의 개수가 2개인 것으로 나타난 경우, 순도 검정 대상인 호박의 F1 품종은 순종인 것으로 판별하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 게놈 DNA는 호박의 종자 및 호박의 식물 전체로부터 DNA를 채취하는 통상적인 방법을 사용함으로써 얻을 수 있다. 얻어진 게놈 DNA를 주형으로 하고 상기 29쌍의 프라이머 세트 중 하나 이상의 프라이머 세트를 사용하여 증폭한 후, 증폭 산물의 유무를 표로 작성한다. 예를 들면, 하기 표 2에서 기재된 국내에서 유통되고 있는 호박 160개 품종으로부터 DNA를 채취하고, 호박 품종 식별용 프라이머 세트를 사용하여 증폭함으로써, 도 2a 내지 2t에 나타낸 바와 같이 증폭 산물의 유무를 표로 작성한다.
상기 표에서 각각의 호박 품종에 대하여 특이적인 대립유전자를 가지면서 그 개수가 2개로 나타나는 프라이머 세트, 즉 공우성(co-dominance)인 프라이머 세트를 선별한다. 예를 들어, '농협애호박' 품종(5번 품종)에 대해 CMTp137 프라이머 세트는 대립유전자를 나타내는 밴드가 1개만 나타나서 양친을 구별할 수 없으므로, '농협애호박' 품종의 순도를 검정할 수 있는 마커로 사용할 수 없다. 그러나, 상기 품종에 대해 CMTm18(213bp/234bp), CMTm35(142bp/149bp), CMTm54(139bp/141bp), CMTm80(77bp/81bp), CMTm119(163bp/165bp), 및 CMTm128(87bp/101bp), CMTm164(183bp/200bp) 프라이머 세트를 이용한 증폭 결과는 2개의 특이적인 대립유전자를 나타내었다. 따라서, 이들 마커는 '농협애호박' 품종의 양친을 식별할 수 있으므로 상기 품종의 순도를 검정할 수 있는 마커로 사용될 수 있다.
순도를 검정하고자 하는 호박의 F1 품종의 게놈 DNA를 추출한다. 상기 게놈 DNA를 추출하는 방법은 상기 호박으로부터 게놈 DNA를 추출하는 방법과 동일한 방법으로 실시한다.
순도를 검정하고자 하는 호박의 F1 품종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 상기 선별된 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭한다.
상기 증폭 산물에서 대립 유전자의 크기가 품종 특이적이고 그 개수가 2개로 나타나면, 상기 호박의 F1 품종은 양친 간의 정상적인 교배가 이루어진 순종인 것으로 판별한다. 상기 증폭 산물에서 대립 유전자의 수가 1개로 나타나면, 상기 호박의 F1 품종은 양친 간의 교배가 되지 않은 것으로 판별한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 58의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 29쌍의 프라이머 세트 중 하나 이상의 프라이머 세트, DNA 중합 효소 및 PCR 완충 용액을 포함하는 호박 일대 잡종 품종의 순도 검정용 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 본 발명의 프라이머 세트 중 하나 이상, DNA 중합 효소 및 PCR 완충 용액을 포함한다. 이외에 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기 영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
본 발명의 호박 품종 식별용 마커 만을 사용하여 국내외 종자 시장에서 판매되고 있는 주요 호박 품종 160개를 식별할 수 있다. 따라서, 호박 품종의 진위성 규명을 통한 품종 보호 침해 여부의 사전 모니터링 및 침해 여부 확인, 품종 보호 출원시 대조 품종의 선정, F1 종자 생산시 순도확인 등과 같은 다양한 분야에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a 내지 1d는 본 발명에 따른 마커에 의해 분석된 각 호박 품종을 코드화하고 NTSYSPC 컴퓨터 프로그램을 활용하여 호박 품종 식별 및 품종별 유전적 유사도를 나타낸 것이다.
도 2a 내지 2t는 국내에서 육성되는 160개 호박 품종을 대상으로 본 발명의 29개의 프라이머 세트를 이용하여 증폭하였을 때 대립 유전자의 크기(bp)에 따라 밴드의 유무를 코드화한 것으로, 밴드가 존재할 때에는 “1”로 나타내었고, 밴드가 존재하지 않을 때에는 “0”으로 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 그러나 본 발명이 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 호박 품종 식별을 위한 마커의 평가
(1) 호박 시료
본 발명에서는 하기 표 2에 기재된 호박 160개 품종을 호박 품종 식별용 프라이머 세트의 선별 및 호박 품종 식별 가능성 검정을 위해 사용하였다.
연번 품종명 육성회사 연번 품종명 육성회사 연번 품종명 육성회사
1 신토좌 코레곤 55 사철꽃토좌 농우 109 아까지망10 아시아
2 흑종 신젠타 56 에이스플러스 동부 110 홍작 대림
3 셀파 코레곤 57 프렌즈토좌 동부 111 흑작 대림
4 농협조생풋 농협 58 선봉풋 신젠타 112 호반장 세종
5 농협애호박 농협 59 기토라 동부 113 쿄료쿠지 경원
6 수호신대목 신젠타 60 맘마밤 신젠타 114 코테이토좌 동서농예
7 사철쥬키니 동부 61 매니아밤 신젠타 115 겨우내빛나 남농원예
8 멋진 동부 62 하니맛단 사카타 116 미소라 대연
9 천진상풋 농우 63 대연애 대연 117 뚝심토좌골드 농우
10 한솔 신젠타 64 스카이골드 꾸이 118 사랑애 동부
11 BN911 신젠타 65 써니골드 꾸이 119 에스알에스05518 신젠타
12 아마구리 해성 66 무병장수 동부 120 경원꽃토좌 경원
13 고은애 동부 67 마라톤 동부 121 불사신 경원
14 알찬 해성 68 천만토좌 농우 122 미니맘 농협
15 오복토좌 농우 69 수문장토좌 농우 123 새솔 대연
16 슈퍼꽃토좌 농우 70 버티미꽃토좌 농우 124 미니맹꽁이 대연
17 농협그린애 농협 71 용암토좌 농우 125 나누리 대연
18 T1골드 동부 72 케이원토좌 보라 126 경원애 경원
19 보물 다끼이 73 불로초 대연 127 경원단 경원
20 한손 다끼이 74 세계일토좌 사카타 128 부시귤단 제일
21 황금단 다끼이 75 서울조생청풋 신젠타 129 다농새론국수 다농
22 나리유타카 사카타 76 미니쿠키밤 동부 130 원정토좌 원농
23 감미락 다끼이 77 쵸코밤 동부 131 유티알토좌 대연
24 넘버에잇 다끼이 78 미성 농협 132 만세토좌 동부
25 RS114 신젠타 79 강근 아시아 133 비슬애 홍익
26 신토홍토 신젠타 80 알에스파워 농우 134 한반도대목 홍익
27 유니온 다끼이 81 깔끄미 농우 135 강한토좌 동부
28 강력꽃토좌 농우 82 크린업 농우 136 단푸름 한결씨드앤택
29 윈윈토좌 동부 83 꿀단지단 농우 137 스파르타 한결씨드앤택
30 마춤토좌 동부 84 팔팔꽃토좌 동부 138 구리비스플러스 아시아
31 고향 농협 85 좋은밤 엄영헌 139 오마이하계 원농
32 빛나 대연 86 부부애 삼성 140 올커니대목 홍익
33 윤이나 대연 87 명작애 삼성 141 멜로토좌 경원
34 반짝이골드 동부 88 브라보밤 삼성 142 후지피카 경원
35 아리랑 다끼이 89 액션밤 삼성 143 대박토좌 동부
36 슈퍼흑종 사카타 90 슈퍼볼밤 삼성 144 스트라이크 동부
37 에이스 동부 91 와세에비스 다끼이 145 매직플라워 동부
38 내병토좌골드 동부 92 큐티 씨드원 146 슈퍼맨토좌 농우
39 내고향맷돌 동부 93 슈퍼매직토좌 농우 147 일촌토좌 동부
40 활력토좌골드 농우 94 상생꽃토좌 농우 148 하모니 동부
41 꿀맛단 농협 95 샛별 농우 149 샤이니 피피에스
42 신선애 농우 96 늘푸른토좌 동부 150 강산애 동부
43 호반애 신젠타 97 싱그런토좌 동부 151 다빈치 아시아
44 부티나 동부 98 일반종자1 성우 152 아지히까리 동부
45 미니골드단 사카타 99 사이코우 동부 153 강심장 피피에스
46 슈퍼에스에이치 사카타 100 아지구로이 농협 154 경원풋 경원
47 다보도플러스풋 동부 101 아지에이스 농협 155 힘찬토좌 경원
48 히로인 대연 102 오로라 고농 156 에프원놀부 꾸이
49 에스유토좌 사카타 103 오마이 원농 157 꼬꼬짱 권농
50 으뜸꽃토좌 농우 104 벌꿀장 다농 158 꼬맛짱 동부
51 강력뉴사카타 사카타 105 광나에프지30 대연 159 투게더 장춘
52 명품토좌 신젠타 106 플러스알파 경원 160 경원쥬키니 경원
53 부자토좌 동부 107 청풍애 고려농산
54 복주풋 농우 108 호말애 아시아
(2) 게놈 DNA의 추출
상기 표 2에 기재된 공시된 호박 종자를 50공 플러그 육묘판에 파종하고 3주일 경과 후, 연한 부위의 유엽을 채취하여 게놈 DNA의 분리 재료로 이용하였다. 채취한 호박의 유엽이 보관되어 있는 2 mL 튜브에 텅스텐 구슬 2개를 넣고 액체 질소(-196℃)를 이용하여 급속 동결시킨 다음, 볼텍싱(vortexing) 과정을 반복하면서 조직을 고르게 마쇄하였다. 충분히 마쇄된 조직으로부터 NucleoSpin® PlantⅡ(Macherey-Nagel Cat. 740 770.250) 키트를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 추출된 게놈 DNA를 1.0% 아가로스 겔에서 전기영동하여 DNA의 농도를 정량한 후, 각 DNA를 ㎕당 10 ng의 농도로 희석하여 PCR 분석에 이용하였다.
(3) 품종식별용 SSR 마커 선발
호박 품종식별에 효율적인 마커를 선발하기 위하여, 호박 22품종('경원쥬키니', '진성쥬키니', '부시자동애', '투게더', '에스알에스05518', '비엔224', '제일부시단', '미도지망', '하이로지망', '데까지망', '부시귤단', '자부심토좌', '멋진', '깔나원', '신토좌', '부시단', '구리비스', '구리지망', '귤단', '슈퍼매직토좌', '신선애', '좋은애')의 게놈 DNA를 기 보고된 300개 SSR 프라이머 세트를 이용하여 증폭하였다. 증폭 산물에 대하여 모세관 전기영동 장치(HDA-GT12TM System, eGEnE, Inc.)와 컴퓨터 프로그램 (Biocalculator 2.0)을 활용하여 각 시료별 대립유전자의 차이를 분석하였다. 분석 결과, 밴드의 패턴이 깨끗하며 다형성 정도가 높은 마커 29개를 선정하였다. 이들 29개 마커에 대해 자동 염기 서열 분석기를 통한 정밀 분석을 수행하기 위하여, 정방향 프라이머가 형광 발생 물질 FAM, VIC, NED 및 PET 중 하나로 형광 표지된 올리고뉴클레오타이드를 제작하였다.
(4) PCR 증폭 및 전기 영동
상기 게놈 DNA 및 마커를 재료로 하여 PCR을 실시하였다. PCR 반응액의 조성은 게놈 DNA 20 ng, 0.1 μM의 상기 마커, 2.0 ㎕ dNTP 혼합물(2.5 mM), Taq 중합효소 1U(Takara CAT. RR011A), 및 2.5 ㎕의 10X PCR 완충용액(50 mM KCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2.0 mM MgCl2)을 증류수에 첨가하여 전체 부피를 30 ㎕로 조절하였다. PCR(C1000, BioRad, 미국) 증폭은 94℃에서 5분 동안 게놈 DNA를 충분히 변성시킨 다음, 변성은 94℃에서 30초, 어닐링은 50℃에서 30초, 그리고 신장을 72℃에서 45초간 40회 반복 수행하였다. PCR 산물의 최종 신장을 위하여 72℃에서 10분 동안 반응시켰다. 각각의 프라이머 세트에 대한 어닐링 온도를 하기 표 3에 나타내었다. PCR이 완료된 후, 2.8% 아가로스 겔에서 전기영동하여 증폭 여부를 확인하였다. 증폭된 시료들은 다음 실험을 위해 -20℃에서 보관하였다. PCR에 증폭된 시료들은 초순수 150 ㎕에 적정 농도로 희석한 다음, 희석된 1.5 ㎕의 PCR 산물을 탈이온된 포름아마이드(deionized formamide) 10 ㎕, 대립유전자 크기를 측정하는 사이즈 마커(size marker)(LIZ500 size standard) 0.25 ㎕와 잘 혼합하여 섞은 다음, 94℃에서 2분간 변성시켰다. 변성시킨 유전자 증폭 산물을 자동 염기 서열 분석장치(Genetic Analyzer 3730XL, Applied Biosystem)를 활용하여 전기영동 하였다. 각 품종별 초위성체 분자 표지에 대한 대립유전자 크기는 GeneMapper4.0 컴퓨터 프로그램(Applied Biosystem)을 이용하여 정확하게 측정하였다.
(5) 본 발명에 따른 마커의 호박 품종 식별 가능성 검정
상기에서 자동염기서열분석기로 확인한 대립유전자 크기를 이용하여 본 발명에 따른 마커의 호박 품종 식별 가능성을 조사하였다. 하기 식 1을 사용하여 PIC(polymorphism information content)값을 산출하였다. 하기 식에서 Pij는 마커 i의 밴드들 중에서 j번째 공통 밴드 패턴의 빈도수이다(Anderson et al., 1993, Genome 36: 181-186).
그 결과, 각 마커에 따른 어닐링 온도(℃), 증폭 산물의 크기(bp), 대립유전자의 수 및 PIC 값을 하기 표 3에 나타내었다.
<식 1>
Figure 112013096005457-pat00001
연번 SSR 마커명 어닐링 온도(℃) 대립유전자의 크기(bp) 대립유전자의 수 PIC 값
1 CMTp137 50 118-170 7 0.552
2 CMTp245 50 115-133 6 0.327
3 CMTp252 50 156-189 9 0.759
4 CMTp254 50 116-136 7 0.673
5 CMTp257 50 110-145 6 0.587
6 CMTm7 50 112-183 14 0.894
7 CMTm18 50 197-334 11 0.861
8 CMTm19 50 097-115 7 0.696
9 CMTm20 50 094-124 7 0.675
10 CMTm34 50 104-125 5 0.613
11 CMTm35 50 104-149 10 0.690
12 CMTm37 50 136-160 4 0.574
13 CMTm48 50 096-250 10 0.740
14 CMTm52 50 191-251 9 0.821
15 CMTm54 50 120-141 5 0.650
16 CMTm60 50 100-124 8 0.628
17 CMTm61 50 096-102 3 0.562
18 CMTm63 50 108-134 6 0.743
19 CMTm80 50 069-099 6 0.687
20 CMTm87 50 157-162 6 0.675
21 CMTm88 50 119-139 4 0.479
22 CMTm91 50 112-172 13 0.645
23 CMTm111 50 107-112 3 0.650
24 CMTm119 50 135-261 12 0.868
25 CMTm128 50 084-122 12 0.851
26 CMTm135 50 116-122 2 0.500
27 CMTm137 50 082-106 7 0.717
28 CMTm162 50 082-109 10 0.665
29 CMTm164 50 175-200 6 0.766
총계 215 16.051
상기 표 3에서 살핀 바와 같이, 본 발명에서 활용된 마커 중 2개(CMTp245, CMTm88)는 0.50보다 낮은 PIC 값을 나타내었고, 나머지 27개는 0.500 내지 0.894로 높은 PIC 값을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 마커를 이용하면 호박 품종을 충분히 식별할 수 있다.
또한, 각 마커에 대하여 각각의 대립유전자의 증폭 산물 유무를 NTSYS pc(version 2.10b)(Rohlf, 2000, Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System-Version 2.10b. Applied Biostatistics Inc., New York.) 컴퓨터 프로그램에 입력하고 Jaccard's 방법(Sneath and Sokal 1973, Numerical taxonomy : The Principles and Practice of Numerical Classification, W. H. Freeman, San Francisco.)에 준하여 유전적 유사도 값을 계산하였다. 유전적 유사도를 이용하여 UPGMA(Unweighted Pair-group Method with Arithmetical Average)(Sneath and Sokal, 1973)에 의해 집괴 분석하여 계통도(dendrogram)를 작성하였고 그 결과를 도 1a 내지 1d에 나타내었다. 도 1a 내지 1d에 따르면, 본 발명의 프라이머 세트는 국내에서 유통되고 있는 160개 호박 품종의 식별을 가능하게 함을 알 수 있다.
실시예 2: 호박 품종 식별
(1) 본 발명의 마커를 이용한 품종 식별표 작성
국내에서 육성되는 160개 호박 품종 각각으로부터 게놈 DNA를 실시예 1의 (2)의 방법에 따라 추출하였다. 본 발명의 29개 마커를 프라이머 세트로 이용하여 실시에 1의 (4)의 방법에 따라 PCR을 실시하였다. PCR 결과로부터 본 발명의 마커에 대한 밴드의 유무를 판별하여 밴드가 존재할 경우에는 점수 1로 코드화하고 밴드가 존재하지 않을 경우에는 0으로 코드화함으로써, 160개 호박 품종 각각에 대한 품종 식별표를 작성하였다. 그 결과를 도 2a 내지 2t에 나타내었다. 도 2a 내지 2t에 나타낸 바와 같이, 각 마커에 따라 각 호박 품종은 서로 다른 형태의 밴드 패턴을 나타내었다. 예를 들어, 표 2에서 호박의 품종연번 5번인 '농협애호박' 품종은 분자 표지 CMTp137로 증폭할 경우 147 bp에서 1개의 대립유전자가, CMTm35로 증폭할 경우 142 bp와 149 bp 크기의 2개 대립유전자가 존재한다.
(2) 호박 품종 식별
품종을 식별하고자 하는 호박의 종자를 50공 플러그 육묘판에 파종하고 3주일 경과 후, 연한 부위의 유엽을 채취하여 게놈 DNA의 분리 재료로 이용하였다. 채취한 호박의 유엽이 보관되어 있는 2 mL 튜브에 텅스텐 구슬 3개를 넣고 액체 질소(-196℃)를 이용하여 급속 동결시킨 다음 볼텍싱 과정을 반복하면서 조직을 고르게 마쇄하였다. 충분히 마쇄된 조직으로부터 NucleoSpin® PlantⅡ 키트를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 추출된 게놈 DNA를 1.0% 아가로스 겔에서 전기영동하여 DNA의 농도를 정량한 후, 각 DNA를 ㎕당 10 ng의 농도로 희석하였다.
본 발명의 29개 마커를 이용하여 상기 추출한 게놈 DNA를 주형으로 PCR 증폭 후 전기영동 하였다. PCR 증폭 및 전기영동은 실시예 1에 기술된 방법과 동일한 방법을 사용하였다. 전기영동 결과를 도 2a 내지 2t의 결과와 비교하였다. 비교 결과, 품종을 식별하고자 했던 호박은 '농협애호박' 품종(품종연번 5)에 대한 증폭 산물과 밴드의 유무 및 크기 면에서 동일한 형태를 나타내었으므로, '농협애호박' 품종임을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 호박 F1 종자 순도 검정용 마커의 선별
도 2a 내지 2t에 의하면, '농협애호박' 품종의 경우 CMTp137(147bp), CMTp245(124bp), CMTp252(161bp), CMTp254(134bp), CMTp257(119bp), CMTm7(167bp), CMTm19(100bp), CMTm20(124bp), CMTm34(110bp), CMTm37(136bp), CMTm48(96bp), CMTm52(245bp), CMTm60(104bp), CMTm61(102bp), CMTm63(108bp), CMTm87(168bp), CMTm88(125bp), CMTm91(126bp), CMTm111(107bp), CMTm135(122bp), CMTm137(101bp), 및 CMTm162(96bp) 마커를 이용한 PCR 증폭은 1개의 대립유전자에 해당하는 밴드만을 나타내어 양친을 구분하지 못하므로 F1 종자의 순도 검정에는 사용할 수 없다. 그러나, 마커 CMTm18(213bp/234bp), CMTm35(142bp/149bp), CMTm54(139bp/141bp), CMTm80(77bp/81bp), CMTm119(163bp/165bp), 및 CMTm128(87bp/101bp), CMTm164(183bp/200bp)를 이용한 PCR 증폭은 F1 품종의 양친 특이적인 2개의 대립유전자에 해당하는 밴드를 나타내었다. 따라서, 이들 마커는 호박 '농협애호박' 품종이 양친의 정상적인 교배로 생성되었음을 판단하기 위한 마커로 사용될 수 있다.
실시예 4: 호박 F1 종자의 순도 검정
순도를 검정하고자 하는 '농협애호박' 품종의 종자에 대해 상기 실시예 2의 (2)에서 기재된 바에 따라 DNA를 분리하였다. 분리한 DNA에 대해서 마커 CMTm18, CMTm35, CMTm54, CMTm80, CMTm119, CMTm128, 및 CMTm164를 사용하여 PCR 증폭하였다. 증폭 조건은 상기 실시예 1의 (4)에서 기재된 바와 동일한 방법을 사용하였다.
상기 PCR 증폭을 통해 마커별로 각 대립유전자에 상응하는 2개의 증폭 산물을 얻었다. 이를 도 2a 내지 2t의 품종 식별표와 대조한 결과, 각 마커별 증폭 산물의 유무 및 크기는 농협애호박 품종의 것과 일치하였다. 따라서, 실험한 '농협애호박' F1 품종의 종자는 양친의 정상적인 교배로부터 생성된 순종임을 알 수 있었다.
<110> Korea Seed and Variety Service <120> A method for identifying pumpkin varieties using microsatellites markers <130> PN103102 <160> 58 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTp137_F <400> 1 tgaaatctct gcgagacaaa ag 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTp137_R <400> 2 aattcagatt gagagggagg tg 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTp245_F <400> 3 aggtaactgc accccagcta 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTp245_R <400> 4 cccatctctc aagctcatcc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTp252_F <400> 5 tctcactcat ccaccacacc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTp252_R <400> 6 cgtttcgagt catttgttcg 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTp254_F <400> 7 ccccacatcc atatatccac a 21 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTp254_R <400> 8 ctccaatgca caaccttgc 19 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTp257_F <400> 9 cacgaagatt tgatggcctt a 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTp257_R <400> 10 ggattgggat ggtgaagatg 20 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm7_F <400> 11 aaccaaactc cggcaaga 18 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm7_R <400> 12 gttctctccg ttcaggatgg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm18_F <400> 13 atgggtttca ccaaaagctg 20 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm18_R <400> 14 aagcggacga ctgacgac 18 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm19_F <400> 15 gcatgggaga tgaaggttag 20 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm19_R <400> 16 atttcctggt ggtatgagat tc 22 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm20_F <400> 17 gtgggccata tcgattcact 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm20_R <400> 18 cgaaagtcgc agagaacaca 20 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm34_F <400> 19 tgaaactaca ctacatgacc ttgg 24 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm34_R <400> 20 tgggttggta gacttgtagt tga 23 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm35_F <400> 21 catcaggtta ttgagtttta ctcagac 27 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm35_R <400> 22 tcgtctgccc caataattc 19 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm37_F <400> 23 cgtgtttgtg ttggaaaagc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm37_R <400> 24 aagcaaaccc acagaaggag 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm48_F <400> 25 aagcctttgg ggacctttac 20 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm48_R <400> 26 ttgaaacctt caaacaagaa attg 24 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm52_F <400> 27 gctctccatt ttccagcttc 20 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm52_R <400> 28 gacgcagagg gagattaatg a 21 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm54_F <400> 29 gtgtggatgc aaatggtgag 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm54_R <400> 30 gggaatcgag ggttttgaat 20 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm60_F <400> 31 tcctccaaag cataccaact gt 22 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm60_R <400> 32 gcgccatttt attgattgga t 21 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm61_F <400> 33 gccattattc cactccatgc 20 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm61_R <400> 34 tgcctgcacc tgttttagc 19 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm63_F <400> 35 gcagaagata ccgtcggagt 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm63_R <400> 36 aaggtgaacg ggaatgtgag 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm80_F <400> 37 ggcctaatgg gttgtgaaga 20 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm80_R <400> 38 agtggaatcc atttgttcgt g 21 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm87_F <400> 39 aatctgcaaa cggacttcaa t 21 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm87_R <400> 40 tcacagtgat ccccaaactc 20 <210> 41 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm88_F <400> 41 catcgacatt cgcctcatc 19 <210> 42 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm88_R <400> 42 aggcagcttc caaatcagc 19 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm91_F <400> 43 ccctagaatt agtgggcaat 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm91_R <400> 44 taggcctaaa aagacccaat 20 <210> 45 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm111_F <400> 45 ctccattccc atggcttc 18 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm111_R <400> 46 ccatgagctt gagagaggtg 20 <210> 47 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm119_F <400> 47 gaagctgccg gaagttagc 19 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm119_R <400> 48 gggaccaccc tcttctcttc 20 <210> 49 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm128_F <400> 49 accaattttt gattttcagt ttgc 24 <210> 50 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm128_R <400> 50 agggggaaga aaagcgaag 19 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm135_F <400> 51 gtggccgtag gtttgtcagt 20 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm135_R <400> 52 tcagagaatc ggagcagaga g 21 <210> 53 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm137_F <400> 53 acgttctttc tgcctccat 19 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm137_R <400> 54 atgcccatta tgcaattctc 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm162_F <400> 55 tggatgggga aattattgga 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm162_R <400> 56 attcagggga gattgggact 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm164_F <400> 57 agcctttcag aagaaccaag 20 <210> 58 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMTm164_R <400> 58 ggcttcaaac aaatactaac ca 22

Claims (8)

  1. 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTp137 프라이머 세트;
    서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTp245 프라이머 세트;
    서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTp252 프라이머 세트;
    서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTp254 프라이머 세트;
    서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTp257 프라이머 세트;
    서열번호 11 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm7 프라이머 세트;
    서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm18 프라이머 세트;
    서열번호 15 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm19 프라이머 세트;
    서열번호 17 및 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm20 프라이머 세트;
    서열번호 19 및 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm34 프라이머 세트;
    서열번호 21 및 서열번호 22의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm35 프라이머 세트;
    서열번호 23 및 서열번호 24의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm37 프라이머 세트;
    서열번호 25 및 서열번호 26의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm48 프라이머 세트;
    서열번호 27 및 서열번호 28의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm52 프라이머 세트;
    서열번호 29 및 서열번호 30의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm54 프라이머 세트;
    서열번호 31 및 서열번호 32의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm60 프라이머 세트;
    서열번호 33 및 서열번호 34의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm61 프라이머 세트;
    서열번호 35 및 서열번호 36의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm63 프라이머 세트;
    서열번호 37 및 서열번호 38의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm80 프라이머 세트;
    서열번호 39 및 서열번호 40의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm87 프라이머 세트;
    서열번호 41 및 서열번호 42의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm88 프라이머 세트;
    서열번호 43 및 서열번호 44의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm91 프라이머 세트;
    서열번호 45 및 서열번호 46의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm111 프라이머 세트;
    서열번호 47 및 서열번호 48의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm119 프라이머 세트;
    서열번호 49 및 서열번호 50의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm128 프라이머 세트;
    서열번호 51 및 서열번호 52의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm135 프라이머 세트;
    서열번호 53 및 서열번호 54의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm137 프라이머 세트;
    서열번호 55 및 서열번호 56의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm162 프라이머 세트; 및
    서열번호 57 및 서열번호 58의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 CMTm164 프라이머 세트를 포함하는, 호박 품종 식별용 프라이머 세트.
  2. 청구항 1의 호박 품종 식별용 프라이머 세트, DNA 중합 효소 및 PCR 완충 용액을 포함하는 호박 품종 식별용 키트.
  3. 호박으로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고 청구항 1의 호박 품종 식별용 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및
    얻어진 증폭 산물로부터 상기 호박의 품종을 결정하는 단계를 포함하는, 호박 품종을 식별하는 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 게놈 DNA는 상기 호박의 종자 또는 어린 식물체의 잎, 줄기 및 과실로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 청구항 3에 있어서, 얻어진 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.
  6. 청구항 3에 있어서, 얻어진 증폭 산물로부터 상기 호박의 품종을 결정하는 단계는, 얻어진 증폭 산물의 검출 결과를, 청구항 1의 호박 품종 식별용 프라이머 세트에 의해 공지된 호박 품종의 핵산을 증폭한 결과와 비교함으로써 수행되는 것인 방법.
  7. 호박으로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고 청구항 1의 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭하는 단계;
    품종 특이적인 대립유전자를 가지면서 대립유전자의 개수가 2개인 증폭 산물을 갖는 프라이머 세트를 선별하는 단계;
    순도를 검정하고자 하는 호박의 F1 품종의 게놈 DNA를 주형으로 하고 선별된 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및
    증폭 결과 품종 특이적인 대립유전자를 가지면서 대립유전자의 개수가 2개인 것으로 나타난 경우, 순도 검정 대상인 호박의 F1 품종은 순종인 것으로 판별하는 단계를 포함하는, 호박 일대 잡종(F1) 품종의 순도를 검정하는 방법.
  8. 청구항 1의 호박 품종 식별용 프라이머 세트, DNA 중합 효소 및 PCR 완충 용액을 포함하는 호박 일대 잡종 품종의 순도 검정용 키트.
KR1020130126723A 2013-10-23 2013-10-23 초위성체 마커를 이용한 호박 품종 식별 방법 KR101555972B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130126723A KR101555972B1 (ko) 2013-10-23 2013-10-23 초위성체 마커를 이용한 호박 품종 식별 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130126723A KR101555972B1 (ko) 2013-10-23 2013-10-23 초위성체 마커를 이용한 호박 품종 식별 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150047016A KR20150047016A (ko) 2015-05-04
KR101555972B1 true KR101555972B1 (ko) 2015-10-15

Family

ID=53386170

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020130126723A KR101555972B1 (ko) 2013-10-23 2013-10-23 초위성체 마커를 이용한 호박 품종 식별 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101555972B1 (ko)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102264690B1 (ko) * 2020-06-18 2021-06-14 세종대학교산학협력단 호박 품종 식별용 마커 조성물 및 이를 이용한 식별 방법
KR102461756B1 (ko) * 2020-12-16 2022-11-01 대한민국 동양계 호박의 여교배 세대단축 육종을 위한 단일염기 다형성 마커세트 및 이의 용도
KR102461763B1 (ko) * 2020-12-16 2022-11-01 대한민국 서양계 호박의 여교배 세대단축 육종을 위한 단일염기 다형성 마커세트 및 이의 용도
KR102654961B1 (ko) * 2021-09-16 2024-04-05 대한민국 호박 품종 식별용 마커 조성물 및 이를 이용한 식별 방법
KR102646426B1 (ko) * 2021-12-01 2024-03-12 대한민국 서양계 호박의 순도검정 및 품종판별을 위한 단일염기 다형성 마커세트 및 이의 용도
KR20230173302A (ko) 2022-06-17 2023-12-27 대한민국(농촌진흥청장) 페포계 호박 순도검정 및 품종판별을 위한 단일염기다형성 마커세트 및 이의 용도

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100823692B1 (ko) 2007-11-07 2008-04-18 주식회사 농우바이오 국내 수박 품종의 유연관계 분석과 품종구별을 위한 ｄｎａ마커

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100823692B1 (ko) 2007-11-07 2008-04-18 주식회사 농우바이오 국내 수박 품종의 유연관계 분석과 품종구별을 위한 ｄｎａ마커

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cucurbit Genetics Cooperative Report. 2004, Vol. 27, pp61-65.
Songklanakarin J. Sci. Technol., 2007, Vol. 29, No. 5, pp1217-1223.
Theor Appl Genet. 2008, Vol. 117, pp37-48.*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20150047016A (ko) 2015-05-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101555972B1 (ko) 초위성체 마커를 이용한 호박 품종 식별 방법
KR101411890B1 (ko) 초위성체 마커를 이용한 무 품종 식별 방법
KR101603156B1 (ko) 초위성체 마커를 이용한 감귤 품종식별 방법
CN112280881B (zh) 用于青花菜种质资源和品种鉴定的snp标记组合及应用
KR20090132213A (ko) 분자 표지를 이용한 배추 품종 식별 방법
Mashilo et al. Genetic diversity of South African bottle gourd [Lagenaria siceraria (Molina) Standl.] landraces revealed by simple sequence repeat markers
KR101642702B1 (ko) 초위성체 마커를 이용한 배 품종식별 방법
KR101174409B1 (ko) 초위성체 마커를 이용한 오이 품종 식별 방법
KR102082987B1 (ko) 양파 계통 판별용 프라이머 세트 및 hrm 분석 방법을 이용한 양파 계통 분석 방법
CN108977563B (zh) 基于萝卜全基因组序列开发的ssr核心引物组及其应用
KR101699149B1 (ko) 수박의 과형 구별용 dna 마커
KR101423299B1 (ko) 초위성체 마커를 이용한 멜론 품종 확인 방법
Lee et al. Genotyping of Sarawak rice cultivars using microsatellite markers.
KR101531303B1 (ko) 초위성체 마커를 이용한 콩 품종 식별 방법
Popescu et al. Evaluation of the genetic variability correlated with multileaflet trait in alfalfa.
KR101301863B1 (ko) 초위성체 프라이머 세트를 이용한 상추 품종식별 방법
KR101359542B1 (ko) 복숭아 품종 식별용 초위성체 프라이머 세트 및 이의 용도
KR101444178B1 (ko) 초위성체 마커를 이용한 고추 품종 식별 방법
Liu et al. Variation in cytosine methylation among pecan cultivars at different developmental stages
KR101301867B1 (ko) 양파 품종식별용 초위성체 프라이머 세트
KR20170019714A (ko) 무 위황병 저항성 판별용 snp 프라이머 세트 및 이의 용도
CN114736987B (zh) 苹果新品种‘秦脆’和‘秦蜜’的分子身份证构建与品种鉴定方法
KR101125745B1 (ko) 분자 표지를 이용한 보리 품종 식별 방법
JP7176782B2 (ja) カンキツ植物における果肉中のカロテノイド含有量を判定する方法、カンキツ植物を製造する方法、及び判定キット
KR101892461B1 (ko) 핵내유전자적 웅성불임성 유전인자인 ｍｓ3 판별용 분자마커 및 이를 이용한 검정방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant