KR102654961B1 - 호박 품종 식별용 마커 조성물 및 이를 이용한 식별 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 호박 품종 식별용 SNP 마커 조성물, 상기 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 호박 품종 식별용 조성물, 상기 식별용 조성물을 포함하는 호박 품종 식별용 키트 및 호박 품종 식별 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 호박 품종 식별용 SNP 마커를 이용하여 호박의 재배 초기 단계에서 품종 판별을 신속하고 정확하게 수행할 수 있으며, 통합적인 분류에 의해 호박 육성 품종에 대한 보증의 표지 인자로 활용할 수 있다.
본 발명에 따른 호박 품종 식별용 SNP 마커를 이용하여 호박의 재배 초기 단계에서 품종 판별을 신속하고 정확하게 수행할 수 있으며, 통합적인 분류에 의해 호박 육성 품종에 대한 보증의 표지 인자로 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 호박 품종 식별용 SNP 마커 조성물, 상기 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 호박 품종 식별용 조성물, 상기 식별용 조성물을 포함하는 호박 품종 식별용 키트 및 호박 품종 식별 방법에 관한 것이다.
육종에 이용되고 있는 대부분의 작물에서 해마다 많은 양의 유전자원이 수집되고 있으며, 수집된 유전자원의 종 내 혹은 아종내 자원구분은 정확한 유전자원의 관리를 위하여 필요하며 출원되는 품종의 신속한 판별은 신품종 보호를 위하여 매우 중요하다. 또한, 국제 식물 신품종 보호동맹(International Union for the Protection of New Varieties of Plants, UPOV)에 우리나라가 가입하고 종자산업법이 발효되면서 육종가의 권리 보호 및 농가소득 증대를 위하여 과학적인 국내외 농산물 품종 구분 필요성이 대두되고 있다.
현재 품종 구별은 전통적인 멘델의 법칙을 적용한 표현형 위주의 형태학적 형질 및 효소나 단백질 변이와 같은 생화학적 특성에 의해 이루어지고 있다. 그러나, 이와 같은 방식은 변이의 빈도가 낮고 모든 작물에 대한 적용에 한계가 있으며, 생산자의 재배 조건에 따라 다른 결과를 초래할 수 있어서 정확한 품종 판별이 곤란하기 때문에 분자 수준에서의 품종 구별 방법이 활발하게 연구되고 있다.
호박(Cucurbita spp.)은 박과의 덩굴성 식물로 열대 및 남아메리카가 원산지이며, 그 열매를 호박으로 지칭하며 품종에 따라 크기, 형태 및 색깔에 차이가 있다.
국내 호박 종자시장은 2018년에 117억 규모로 2014년에 비해 약 1.5 배 이상 증가하여 향후에도 성장세를 이어갈 것으로 예측된다. 호박의 경제적 중요성이 증가함에 따라 신품종 육성이 활발히 이루어지고 있으며 지적재산권인 품종보호권 강화 및 유사복제품종 개발 차단의 중요성이 강조되고 있다.
다만, 호박은 재배환경에서 외부 형태로 종 감별은 가능하나 일부 종은 초기 단계에서 정확한 분류가 어려워 재배과정을 통해 통합적인 분류가 필요하므로, 이러한 점을 보완하고 종을 빠르고 정확히 판별하기 위해서는 분자생물학적 분석이 뒷받침되어야 한다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 호박속 종을 분류하기 위한 마커를 개발하기 위해 예의 연구 노력한 결과, rbcL, psbA-trnH 및 matK 유전자의 호박 종 특이적 SNP 염기서열에 의해 호박속 종 분류가 가능함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 전술한 문제 및 이와 연관된 다른 문제를 해결하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 예시적 목적은 서열번호 1 내지 5로 표시되는 염기서열의 399번째, 552번째, 857번째 및 859번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 6 내지 10으로 표시되는 염기서열의 2번째, 107번째, 113번째 및 260번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 11 내지 15로 표시되는 염기서열의 30번째, 37번째, 38번째, 51번째, 53번째 및 160번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는,
10 내지 500개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 뉴클레오티드를 포함하는 호박(Cucurvita spp.) 품종 식별용 SNP 마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 예시적 목적은 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 호박 품종 식별용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 상기 호박 품종 식별용 조성물을 포함하는 호박 품종 식별용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 다음의 단계를 포함하는 호박 품종 식별 방법을 제공하는 것이다.
(a) 호박 시료로부터 핵산을 분리하는 단계;
(b) 상기 분리된 핵산으로부터 상기 SNP 마커를 검출하는 단계.
본 명세서에 개시된 발명의 기술적 사상에 따라 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 문제점을 해결하기 위한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제는 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 내지 5로 표시되는 염기서열의 399번째, 552번째, 857번째 및 859번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로서, 10 내지 500개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 뉴클레오티드를 포함하는 호박(Cucurvita spp.) 품종 식별용 SNP 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 6 내지 10으로 표시되는 염기서열의 2번째, 107번째, 113번째 및 260번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로서, 10 내지 500개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 뉴클레오티드를 포함하는 호박(Cucurvita spp.) 품종 식별용 SNP 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 11 내지 15로 표시되는 염기서열의 30번째, 37번째, 38번째, 51번째, 53번째 및 160번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로서, 10 내지 500개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 뉴클레오티드를 포함하는 호박(Cucurvita spp.) 품종 식별용 SNP 마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "SNP 마커"란, 개체 또는 종을 식별하기 위해 이용되는 DNA 서열 상의 단일 염기 다형성 대립유전자 염기쌍을 의미한다. SNP는 비교적 그 빈도가 높고 안정하며 유전체 전체에 분포되어 있고 이에 의하여 개체의 유전적 다양성이 발생하므로, SNP 마커는 개체 간의 유전적 근접성을 알려주는 지표의 역할을 할 수 있다. SNP 마커는 일반적으로 단일 염기 다형성에 수반되는 표현형의 변화를 포함하지만 경우에 따라 그렇지 않을 수도 있다.
본 발명의 용어 "다형성(polymorphism)"이란, 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 의미하며 다형성 부위 중에서, 개체에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일 염기 다형성이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 5% 또는 10% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.
본 발명의 용어 "대립유전자(allele)"란, 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 의미한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.
본 발명에 있어서, 호박은 박과의 덩굴성 식물로 그 열매를 호박으로 지칭하며, 서양종호박(Cucurbita maxima), 페포종호박(Cucurbita pepo), 흑종호박(Cucurbita ficifolia), 동양종호박(Cucurbita moschata) 및 녹조종호박(Cucurbita argyrosperma)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1 내지 5로 표시되는 염기서열의 399번째, 552번째, 857번째 및 859번째 염기는 각각, 399번째 염기가 A 또는 G 이고, 552번째 염기가 T 또는 C 이고, 857번째 염기가 G 또는 A 이고, 859번째 염기가 G 또는 T일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1 내지 5로 표시되는 염기서열의 399번째, 552번째, 857번째 및 859번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 폴리뉴클레오티드는,
312번째, 807번째, 825번째, 903번째, 919번째 및 920번째 중 어느 하나 이상의 염기에 위치한 SNP를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 312번째, 807번째, 825번째, 903번째, 919번째 및 920번째 염기는 각각, 312번째 염기가 T 또는 C이고, 807번째 염기가 A 또는 G 이고, 825번째 염기가 T 또는 G 이고, 903번째 염기가 C 또는 T 이고, 919번째 염기가 T 또는 G 이고, 920번째 염기가 C 또는 A일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 399번째, 552번째, 857번째 및 859번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 399번째 염기가 G, 552번째 염기가 T, 857번째 염기가 G, 그리고 859번째 염기가 G 일 경우 서양종호박으로 식별되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 399번째, 552번째, 857번째 및 859번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 399번째 염기가 A, 552번째 염기가 T, 857번째 염기가 G, 그리고 859번째 염기가 G 일 경우 페포종호박으로 식별되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 3으로 표시되는 염기서열의 399번째, 552번째, 857번째 및 859번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 399번째 염기가 G, 552번째 염기가 C, 857번째 염기가 G, 그리고 859번째 염기가 G 일 경우 흑종호박으로 식별되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 4로 표시되는 염기서열의 399번째, 552번째, 857번째 및 859번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 399번째 염기가 G, 552번째 염기가 T, 857번째 염기가 A, 그리고 859번째 염기가 T 일 경우 동양종호박으로 식별되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 399번째, 552번째, 857번째 및 859번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 399번째 염기가 G, 552번째 염기가 T, 857번째 염기가 A, 그리고 859번째 염기가 G 일 경우 녹조종호박으로 식별되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 6 내지 10으로 표시되는 염기서열의 2번째, 107번째, 113번째 및 260번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 각각, 2번째 염기가 A 또는 G 이고, 107번째 염기가 A 또는 G 이고, 113번째 염기가 C 또는 T 이고, 260번째 염기가 T 또는 C일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 11 내지 15로 표시되는 염기서열의 30번째, 37번째, 38번째, 51번째, 53번째 및 160번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 각각, 30번째 염기가 C 또는 G 이고, 37번째 염기가 A 또는 T 이고, 38번째 염기가 G 또는 T 이고, 51번째 염기가 A 또는 T 이고, 53번째 염기가 A 또는 T 이고, 160번째 염기가 A 또는 C일 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 실시예에서는 matK 바코드 구간의 312번째, 399번째, 552번째, 807번째, 825번째, 857번째, 859번째, 903번째, 919번째 및 920번째 염기가 호박 종 특이적 SNP 염기서열임을 확인하였으며, 그 중 399번째, 552번째, 857번째 및 859번째 염기에 위치한 SNP에 의해 페포종, 동양종, 서양종, 흑종 및 녹조종의 호박 품종 판별이 가능함을 확인하였고, rbcL 바코드 구간의 2번째, 107번째, 113번째 및 260번째 염기에 위치한 SNP에 의해 페포종, 서양종 및 흑종의 호박 품종 판별이 가능함을 확인하였으며, psbA-trnH 바코드 구간의 중 30번째, 37번째, 38번째, 51번째, 53번째 및 160번째 염기에 위치한 SNP에 의해 페포종, 서양종 및 흑종의 호박 품종 판별이 가능함을 확인하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 다른 양태로서, 본 발명은 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 호박 품종 식별용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제"는 상기 호박 품종 식별용 SNP 마커에 포함된 SNP에 특이적으로 결합하여 인식할 수 있도록 하거나 상기 SNP를 증폭시킬 수 있는 제제로서, 구체적으로는 상기 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는, SNP가 포함된 다형성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브(probe) 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제제는 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 프라이머 세트 또는 프로브일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 23, 24, 27, 28 및 29로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 34 내지 38로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 39 내지 46으로 표시되는 프라이머 세트 중 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 22, 25, 26, 30, 31, 32 및 33으로 표시되는 프라이머 세트를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미하며, 주로 특정 구간을 증폭하는 프라이머 세트의 형태로 사용된다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 이때, PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명에 있어서 SNP 마커의 증폭에 사용되는 프라이머는 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 상기 프라이머 서열은 상기 SNP 마커와 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 상기 SNP 마커와 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것이 바람직하다.
본 발명의 용어 "프로브(probe)"는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는, 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 라벨링(labeling) 되어 있어 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단일 사슬 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중 사슬 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 호박 품종 식별용 조성물을 포함하는, 호박 품종 식별용 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, "키트"는 마커를 검출 또는 증폭시킬 수 있는 제제를 포함하는 조성물, 상기 검출 또는 증폭을 위한 시약 및 제한효소를 포함하는 키트일 수 있다. 상기 증폭을 위한 시약은 dNTPs, DNA 폴리머라아제 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 dNTPs는 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하며, DNA 폴리머라아제는 내열성 DNA 중합효소로서 Taq DNA 폴리머라아제, Tth DNA 폴리머라아제 등 시판되는 폴리머라아제를 이용할 수 있다. 상기 제한효소는 BfaI 또는 BsaAI 중 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물일 수 있다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함할 수 있다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 상기 SNP 마커를 증폭하기 위한 시약을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 증폭하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼(buffer)를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, 호박 품종 식별 방법을 제공한다.
(a) 호박 시료로부터 핵산을 분리하는 단계;
(b) 상기 분리된 핵산으로부터 제1항에 따른 SNP 마커를 검출하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 상기 서열번호 1 내지 5로 표시되는 염기서열의 312번째, 807번째, 825번째, 903번째, 919번째 및 920번째 중 하나 이상의 염기에 위치한 SNP 마커를 추가적으로 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계는
(i) 상기 분리된 핵산을 주형으로 하여, 상기 호박 품종 식별용 조성물을 이용하여 PCR을 수행하는 단계;
(ii) 상기 PCR을 수행하는 단계에서 증폭된 PCR 산물을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (i)단계는 상기 SNP 마커를 증폭시키기 위한 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 23, 24, 27, 28 및 29로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 34 내지 38로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 39 내지 46으로 표시되는 프라이머 세트 중 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 22, 25, 26, 30, 31, 32 및 33으로 표시되는 프라이머 세트를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 시료로부터 핵산을 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 페놀:클로로포름 추출에 후속한 에탄올 침전화 방법을 이용할 수도 있다. 상기 분리된 핵산을 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머를 이용하여 DNA 중합효소를 첨가하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Q 복제효소(replicase)를 통한 증폭을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 호박 품종 식별용 SNP 마커를 이용하여 호박의 재배 초기 단계에서 품종 판별을 신속하고 정확하게 수행할 수 있으며, 통합적인 분류에 의해 호박 육성 품종에 대한 보증의 표지 인자로 활용할 수 있다.
도 1은 호박 5종에 대한 matK, rbcL 및 psbA-trnH의 Neighbour-Joining tree 계통도를 나타낸 것이다.
도 2는 matK 뉴클레오티드 서열에 기초한 호박 5종의 계통수 분석(phylogenetic analysis) 결과이다.
도 3은 rbcL 뉴클레오티드 서열에 기초한 호박 5종의 계통수 분석(phylogenetic analysis) 결과이다.
도 4는 psbA-trnH 뉴클레오티드 서열에 기초한 호박 5종의 계통수 분석(phylogenetic analysis) 결과이다.
도 5는 전기영동도(electropherogram)에 의해 matK 바코드 구간의 SNPs를 확인한 결과이다.
도 2는 matK 뉴클레오티드 서열에 기초한 호박 5종의 계통수 분석(phylogenetic analysis) 결과이다.
도 3은 rbcL 뉴클레오티드 서열에 기초한 호박 5종의 계통수 분석(phylogenetic analysis) 결과이다.
도 4는 psbA-trnH 뉴클레오티드 서열에 기초한 호박 5종의 계통수 분석(phylogenetic analysis) 결과이다.
도 5는 전기영동도(electropherogram)에 의해 matK 바코드 구간의 SNPs를 확인한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 호박 종판별을 위한 DNA 바코드 구간 선별
rbcL, matK 및 psbA-trnH 바코드 구간이 호박속 식물의 종 판별을 위해 유용한지 여부를 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
구체적으로, 서양종호박(Cucurbita maxima), 페포종호박(Cucurbita pepo), 흑종호박(Cucurbita ficifolia), 동양종호박(Cucurbita moschata) 및 녹조종호박(Cucurbita argyrosperma)의 cDNA로부터 표 1에 나타낸 프라이머를 이용해 rbcL, matK 및 psbA-trnH 바코드 구간을 각각 PCR 증폭한 후 ㈜바이오닉스(Bionics Inc., jeonju, Korea)에 의뢰하여 ABI Prism 3730xl DNA Analyzer (Applied Biosystems, FosterCity, CA)로 염기서열을 분석하였다. 이로부터 확보한 호박 5종의 rbcL, matK 및 psbA-trnH 각각의 염기서열(표 2)을 이용하여 Neighbour-Joining tree 계통도를 만들어 booststrap value 분석법에 의해 1,000번 반복 수행하여 분석을 수행하였다. 모든 분기점의 Booststrap value는 60% 이상으로 계통도에 표기하였으며 대부분 높은 booststrap value 지지도를 보였다.
| 구분 | 프라이머 | ||
| 서열 (5'→ 3') | 서열번호 | ||
| matK | F | ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC | 16 |
| R | GAAACGGTCTCTCCAACGCAT | 17 | |
| rbcL | F | TAATCCCCTATCCCCTTCATCTG | 18 |
| R | TCATTGCACACGGCTTTACCTAT | 19 | |
| psbA-trnH | F | CGCGCATGGTGGATTCACAATCC | 20 |
| R | GTTATGCATGAACGTAATGCTC | 21 | |
| 구분 | bp | 품종 | 서열번호 |
| matK | 935 | 서양종호박(Cucurbita maxima) | 1 |
| 페포종호박(Cucurbita pepo) | 2 | ||
| 흑종호박(Cucurbita ficifolia) | 3 | ||
| 동양종호박(Cucurbita moschata) | 4 | ||
| 녹조종호박(Cucurbita argyrosperma) | 5 | ||
| rbcL | 541 | 서양종호박(Cucurbita maxima) | 6 |
| 페포종호박(Cucurbita pepo) | 7 | ||
| 흑종호박(Cucurbita ficifolia) | 8 | ||
| 동양종호박(Cucurbita moschata) | 9 | ||
| 녹조종호박(Cucurbita argyrosperma) | 10 | ||
| psbA-trnH | 187 | 서양종호박(Cucurbita maxima) | 11 |
| 페포종호박(Cucurbita pepo) | 12 | ||
| 흑종호박(Cucurbita ficifolia) | 13 | ||
| 동양종호박(Cucurbita moschata) | 14 | ||
| 녹조종호박(Cucurbita argyrosperma) | 15 |
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, matK 바코드 구간의 경우 서양종호박을 군외군으로 하여, 페포종호박과 흑종호박이 88% booststrap 신뢰도로 하나의 분계조를 이루면서 유집되었고, 각각 86% 및 96%의 높은 신뢰도를 보이며 소분계조를 형성하였다. 동양종호박과 녹조종호박은 89%의 booststrap 신뢰도로 유집되었고 87%의 신뢰도를 보이며 동양종호박이 분기되어 가각 독립된 분계를 형성하여 해당 분기군이 잘 식별되어, 결과적으로 5개 종이 5개의 그룹을 이루어 뚜렷이 식별됨을 확인하였다.
rbcL 바코드 구간의 경우 서양종호박을 군외군으로 하여, 페포종호박 및 흑종호박이 각각 79% 및 90%의 booststrap 신뢰도를 보이면서 단계통군을 형성하였다. 이후 동양종호박과 녹조종호박이 63% booststrap 신뢰도를 보이면서 유입되었다. 페포종호박, 서양종호박 및 흑종호박은 각각의 종으로 분계를 이루면서 잘 식별됨이 확인되었으나, 동양종호박 및 녹조종호박은 하나의 그룹을 형성하는 것이 확인되었다.
psbA-trnH 바코드 구간의 경우 서양종호박을 군외군으로 하여, 페포종호박, 서양종호박 및 흑종호박은 각각 67%, 86% 및 94%의 booststrap 신뢰도를 보이면서 단계통군을 형성하여 각각의 종으로 분계조를 이루면서 잘 식별되었으나, 동양종호박 및 녹조종호박은 1개의 그룹을 형성하는 것이 확인되었다.
이러한 결과를 통해, matK, rbcL 및 psbA-trnH 3개의 바코드 구간이 호박속 품종 식별에 유용하다는 것을 확인하였다.
실시예 2 : DNA 바코드 구간 내 종 특이적 SNP 서열 선별
2-1. 계통수(phylogenetic tree) 분석
matK, rbcL 및 psbA-trnH 세 가지 바코드 구간에서 호박 종 특이적 SNP 염기서열을 확보하기 위하여, matK, rbcL 및 psbA-trnH의 염기서열로 BioEdit(ver. 7.2) 프로그램 (http://bioedit.software.informer.com) 을 이용해 계통수(phylogenetic tree) 분석을 수행하였다.
구체적으로, 각 염기서열을 BioEdit(ver. 7.2) 프로그램 (http://bioedit.software.informer.com)의 pair wise alignment를 이용해 양방향 시퀸싱 결과를 정렬한 후 공통염기배열(Consensus Sequence) 결과를 얻었다. 이후 MEGA-X (Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 10.1.8)를 사용하여 최종적으로 정렬하였고, Nucleotid diversity(π) 및 Tajima’s test(D)값은 DnaSP(ver. 5.10.01) 프로그램을 사용하여 얻었다. 염기서열을 이용한 Neighbor joining 계통수 작성은 MEGA X(ver 10.1.8)를 이용하여 수행하였으며, 계통수의 지지도를 알아보기 위해 Bootstrap 값 반복횟수 1,000회로 수행하였다. 각 바코드 구간의 염기서열은 독립적으로 계통수를 작성하였으며, 각 구간의 정렬된 염기서열로부터 Kimura-2-Parameter (K2P) 모델을 이용하여 Neighbour-Joining tree를 작성하였다.
그 결과, matK의 호박 종 특이적 SNPs는 도 2에 나타낸 바와 같이 935bp 길이의 정렬된 matK 염기서열의 312, 399, 552, 807, 825, 857, 859, 903, 919 및 920번째에 위치해 있음을 확인하였다.
rbcL의 호박 종 특이적 SNPs는 도 3에 나타낸 바와 같이 541bp 길이의 정렬된 rbcL 염기서열의 2, 107, 113 및 260번째에 위치해 있음을 확인하였다.
psbA-trnH의 호박 종 특이적 SNPs는 도 4에 나타낸 바와 같이 187bp 길이의 정렬된 psbA-trnH 염기서열의 30, 37, 38, 51, 53 및 160번째에 위치해 있음을 확인하였다.
matK, rbcL 및 psbA-trnH 세 가지 바코드 구간의 호박 종 특이적 SNPs의 각 염기서열은 다음과 같다 (표 3).
2-2. 다중 스낵샵 분석(multiplex snapshot assay)
확보한 SNP 염기서열에 의해 호박 품종 식별이 가능한지 확인하기 위하여, 다중 스낵샵 분석(multiplex snapshot assay)을 수행하였다. SNaPshot 반응은 각각의 SNaPshot Primer에 염기서열 마다 다른 색의 형광표지가 된 single ddNTP가 중합되면 반응이 종료된다. SNaPshot Primer마다 bp 길이가 다르며 종 특이 SNP위치의 형광표지 색이 다르기 때문에 서로 다른 조합의 종특이 SNPs를 읽으면 호박속의 종 분류가 가능하다.
SNaPshot을 수행하기 위하여, matK, rbcL 및 psbA-trnH 세 가지 바코드 구간에 대한 SNPs 특이적 프라이머를 제작하였다(표 4).
| 마커 | 프라이머 | Sequence (5' → 3') | 서열번호 |
| matK | matK_312 | TGAATAAGTGGAAATATTACCTTGT | 22 |
| matK_399 | TATCCAAGCGTTCTCTTGACTTTTT | 23 | |
| matK_552 | ATTGGCTAAAGCGAAATTTTGTAA | 24 | |
| matK_807 | TATTGGAAGAATTCTTTACGGAGCA | 25 | |
| matK_825 | GAGCAAGAACAGGTTCTTTCTTT | 26 | |
| matK_857 | CTTCCCAAGAGCTTCTTTTACTTTACAGA | 27 | |
| matK_859 | CTTCCCAAGAGCTTCTTTTACTTTACAGAA G | 28 | |
| matK_859_2 | CTTCCCAAGAGCTTCTTTTACTTTACAGAG G | 29 | |
| matK_903 | TTTGGATATTATTTGCATCAA | 30 | |
| matK_919 | GATTTGGCCAATCAT | 31 | |
| matK_920 | GATTTGGCCAATCATG | 32 | |
| matK_920_2 | GATTTGGCCAATCATT | 33 | |
| rbcL | rbcL_2 | GCTGGGATCAAGCTGGTGTTA | 34 |
| rbcL_107 | CCGGGAGTTCCACCCGAGGAAGC | 35 | |
| rbcL_113 | ACCCGAGGAAGCGGGGGC | 36 | |
| rbcL_113_2 | ACCCGAGGAAGCAGGGGC | 37 | |
| rbcL_260 | AATATATTGCTTATGTAGCTTATCC | 38 | |
| psbA-trnH | psbA-trnH_30 | CCCTATATATAAGTATATATTA | 39 |
| psbA-trnH_37 | AAGTATATATTAGAAAAAT | 40 | |
| psbA-trnH_38 | AAGTATATATTAGAAAAATT | 41 | |
| psbA-trnH_38_2 | AAGTATATATTAGAAAAATA | 42 | |
| psbA-trnH_51 | AAGTATAAATTA | 43 | |
| psbA-trnH_53 | AAGTATAAATTATA | 44 | |
| psbA-trnH_53 | AAGTATAAATTAAA | 45 | |
| psbA-trnH_160 | TTCAAGAACTTGTATACACTAAGAC | 46 |
증폭된 matK, rbcL 및 psbA-trnH 각각의 DNA바코드 구간 PCR 산물 15㎕ 당 2U exonuclease (BioLabs.Inc) 및 5U shrimp alkaline phosphatase (SAP; BioLabs.Inc)를 넣고 볼텍싱한 후 37℃에서 1시간, 75℃에서 15분 반응시켜 잔여 dNTPs 와 primers를 불활성화하였다. 이후, 6개의 SNP 유전자 좌가 동시에 분석되는 Multiplex minisequencing reaction반응에는 PCR 산물 3㎕, SNPs 특이적 프라이머 mix 1㎕, SNaPshot Multiplex Ready Reaction Mix (Applied Biosystems, CA, USA) 5㎕, 증류수 1㎕를 넣어 총 부피 10㎕가 되게 하였다. PCR 반응 조건은 96℃에서 2분 동안 predenaturation후 96℃에서 denaturation 10초, 50℃에서 annealing 5℃초, 60℃에서 extension 30초로 구성된 반응을 25 cycle 반복 후 최종적으로 60℃에서 1분간 final extension하였다. Multiplex minisequencing reaction산물에 SAP를 넣고 37℃에서 1시간, 75℃에서 15분 반응시켜 형광 표지 된 dideoxynucleoside triphosphates(ddNTPs)를 제거하였다. Multiplex minisequencing 산물 0.5㎕에 9㎕ of Hi-Di formamide 0.5㎕와 GeneScan-120 LIZ size standard (Applied Biosystems, CA, USA)0.5㎕를 넣고 가볍게 볼텍싱 해준 뒤 원심분리 하였다. 반응 산물은 95℃에서 5분간 denature 한 뒤, 50 cm capillary array와 POP-7 polymer를 사용한 3500 DNA sequencer (Applied Biosystems and Hitachi, Foster City, CA, USA)를 이용하여 분석하였고, 데이터 분석은 GeneMapper software(version 5.0; Applied Biosystems)를 사용하여 수행하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, matK 유전자의 경우 399, 552, 857 및 859번째 서열의 종 특이적 SNPs를 이용하여 페포종, 동양종, 서양종, 흑종 및 녹조종의 5종 호박 품종 판별이 가능함을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION)
<120> MARKER COMPOSITION FOR IDENTIFICATION OF CUCURBITA SPP. AND
IDENTIFICATION METHOD USING THE SAME
<130> KPA2021-178
<160> 46
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 935
<212> DNA
<213> Cucurbita maxima
<400> 1
tttttttcaa aaagaaatca aagattagtc ttgttcctat acaattctta tgtatgtgaa 60
tacgaatcca ttttcctttt tctacgtaac caatcttctc atatacgatt aacttcttat 120
aggggccttt ttgaacgaat atatttctat ggaaaaatcg aacatcttgt caaagtgttt 180
gctaattatt tttcggctat cttacgggtc ttcaaggatc ctttcataca ttatgttaga 240
tatcaaggaa aattgattct ggtttcaaaa gatacgccac ttctgatgaa taagtggaaa 300
tattaccttg ttaatttatg gcaatgtcat ttttatgtgt ggtcacaacc agaaaggatc 360
catataaacc aattatccaa gcgttctctt gactttttgg gctatatttc aagtgtgcga 420
ttaaatcctt cagtggtatg gagtcagatg ctagaaaatt catttctaat agataatgct 480
accaagaaaa tcgatacact agttcctatt attactctgc ttggatcatt ggctaaagcg 540
aaattttgta atgtgttagg gcatcccatt agtaagccga cctggatcga ttcgtcggat 600
ttttctatta ttgatcgatt tgtgcgtata tccagaaatc tttctcatta ttacagagga 660
tcctcaaaaa aaaagaattt gtatcgaatc cagtatatac ttcgcctttc ttgtcttaaa 720
actttggctc gtaaacacaa aagtactgta cgcgttcttt ttaaaaggtt aaattcgcaa 780
ttattggaag aattctttac ggagcaagaa caggttcttt ctttgatctt cccaagagct 840
tcttttactt tacagagggt atataggggg aaaatttggt atttggatat tatttgcatc 900
aacgatttgg ccaatcatga atgattggtt ctgac 935
<210> 2
<211> 935
<212> DNA
<213> Cucurbita pepo
<400> 2
tttttttcaa aaagaaatca aagattagtc ttgttcctat acaattctta tgtatgtgaa 60
tacgaatcca ttttcctttt tctacgtaac caatcttctc atatacgatt aacttcttat 120
aggggccttt ttgaacgaat atatttctat ggaaaaatcg aacatcttgt caaagtgttt 180
gctaattatt tttcggctat cttacgggtc ttcaaggatc ctttcataca ttatgttaga 240
tatcaaggaa aattgattct ggtttcaaaa gatacgccac ttctgatgaa taagtggaaa 300
tattaccttg ttaatttatg gcaatgtcat ttttatgtgt ggtcacaacc agaaaggatc 360
catataaacc aattatccaa gcgttctctt gactttttag gctatatttc aagtgtgcga 420
tcctcaaaaa aaaagaattt gtatcgaatc cagtatatac ttcgcctttc ttgtcttaaa 480
ttaaatcctt cagtggtatg gagtcagatg ctagaaaatt catttctaat agataatgct 540
accaagaaaa ttgatacact agttcctatt attactctgc ttggatcatt ggctaaagcg 600
aaattttgta atgtgttagg gcatcccatt agtaagccga cctggatcga ttcgtcggat 660
ttttctatta ttgatcgatt tgtgcgtata tccagaaatc tttctcatta ttacagagga 720
actttggctc gtaaacacaa aagtactgta cgcgttcttt ttaaaaggtt aaattcgcaa 780
ttattggaag aattctttac ggagcaagaa caggttcttt cttttatctt cccaagagct 840
tcttttactt tacagagggt atataggggg aaaatttggt atttggatat tatttgcatc 900
aacgatttgg ccaatcattc atgattggtt ctgac 935
<210> 3
<211> 935
<212> DNA
<213> Cucurbita ficifolia
<400> 3
tttttttcaa aaagaaatca aagattagtc ttgttcctat acaattctta tgtatgtgaa 60
tacgaatcca ttttcctttt tctacgtaac caatcttctc atatacgatt aacttcttat 120
aggggccttt ttgaacgaat atatttctat ggaaaaatcg aacatcttgt caaagtgttt 180
gctaattatt tttcggctat cttacgggtc ttcaaggatc ctttcataca ttatgttaga 240
tatcaaggaa aattgattct ggtttcaaaa gatacgccac ttctgatgaa taagtggaaa 300
tattaccttg tcaatttatg gcaatgtcat ttttatgtgt ggtcacaacc agaaaggatc 360
catataaacc aattatccaa gcgttctctt gactttttgg gctatatttc aagtgtgcga 420
ttaaatcctt cagtggtatg gagtcagatg ctagaaaatt catttctaat agataatgct 480
accaagaaaa tcgatacact agttcctatt attactctgc ttggatcatt ggctaaagcg 540
aaattttgta acgtgttagg gcatcccatt agtaagccga cctggatcga ttcgtcggat 600
ttttctatta ttgatcgatt tgtgcgtata tccagaaatc tttctcatta ttacagagga 660
tcctcaaaaa aaaagaattt gtatcgaatc cagtatatac ttcgcctttc ttgtcttaaa 720
actttggctc gtaaacacaa aagtactgta cgcgttcttt ttaaaaggtt aaattcgcaa 780
ttattggaag aattctttac ggagcaagaa caggttcttt ctttgatctt cccaagagct 840
tcttttactt tacagagggt atataggggg aaaatttggt atttggatat tatttgcatc 900
aatgatttgg ccaatcattc atgattggtt ctgac 935
<210> 4
<211> 935
<212> DNA
<213> Cucurbita moschata
<400> 4
tttttttcaa aaagaaatca aagattagtc ttgttcctat acaattctta tgtatgtgaa 60
tacgaatcca ttttcctttt tctacgtaac caatcttctc atatacgatt aacttcttat 120
aggggccttt ttgaacgaat atatttctat ggaaaaatcg aacatcttgt caaagtgttt 180
gctaattatt tttcggctat cttacgggtc ttcaaggatc ctttcataca ttatgttaga 240
tatcaaggaa aattgattct ggtttcaaaa gatacgccac ttctgatgaa taagtggaaa 300
tattaccttg ttaatttatg gcaatgtcat ttttatgtgt ggtcacaacc agaaaggatc 360
catataaacc aattatccaa gcgttctctt gactttttgg gctatatttc aagtgtgcga 420
ttaaatcctt cagtggtatg gagtcagatg ctagaaaatt catttctaat agataatgct 480
accaagaaaa tcgatacact agttcctatt attactctgc ttggatcatt ggctaaagcg 540
aaattttgta atgtgttagg gcatcccatt agtaagccga cctggatcga ttcgtcggat 600
ttttctatta ttgatcgatt tgtgcgtata tccagaaatc tttctcatta ttacagagga 660
tcctcaaaaa aaaagaattt gtatcgaatc cagtatatac ttcgcctttc ttgtcttaaa 720
actttggctc gtaaacacaa aagtactgta cgcgttcttt ttaaaaggtt aaattcgcaa 780
ttattggaag aattctttac ggagcaggaa caggttcttt ctttgatctt cccaagagct 840
tcttttactt tacagaagtt atataggggg aaaatttggt atttggatat tatttgcatc 900
aacgatttgg ccaatcatga atgattggtt ctgac 935
<210> 5
<211> 935
<212> DNA
<213> Cucurbita argyrosperma
<400> 5
tttttttcaa aaagaaatca aagattagtc ttgttcctat acaattctta tgtatgtgaa 60
tacgaatcca ttttcctttt tctacgtaac caatcttctc atatacgatt aacttcttat 120
aggggccttt ttgaacgaat atatttctat ggaaaaatcg aacatcttgt caaagtgttt 180
gctaattatt tttcggctat cttacgggtc ttcaaggatc ctttcataca ttatgttaga 240
tatcaaggaa aattgattct ggtttcaaaa gatacgccac ttctgatgaa taagtggaaa 300
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catataaacc aattatccaa gcgttctctt gactttttgg gctatatttc aagtgtgcga 420
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aaattttgta atgtgttagg gcatcccatt agtaagccga cctggatcga ttcgtcggat 600
ttttctatta ttgatcgatt tgtgcgtata tccagaaatc tttctcatta ttacagagga 660
tcctcaaaaa aaaagaattt gtatcgaatc cagtatatac ttcgcctttc ttgtcttaaa 720
actttggctc gtaaacacaa aagtactgta cgcgttcttt ttaaaaggtt aaattcgcaa 780
ttattggaag aattctttac ggagcaagaa caggttcttt ctttgatctt cccaagagct 840
tcttttactt tacagaaggt atataggggg aaaatttggt atttggatat tatttgcatc 900
aacgatttgg ccaatcatga atgattggtt ctgac 935
<210> 6
<211> 541
<212> DNA
<213> Cucurbita maxima
<400> 6
aagattataa attgacttat tatactcctg aatatgaaac caaagatact gatatcttgg 60
cagcattccg agtaactcct caaccgggag ttccacccga ggaagcaggg gccgctgtag 120
ctgctgaatc ttctactggt acatggacaa ctgtgtggac cgatgggctt accagtcttg 180
atcgttacaa aggacgatgc tatggaatcg agcctgttcc tggagaagaa aatcaatata 240
ttgcttatgt agcttatccc ctagaccttt ttgaagaagg ttctgttact aacatgttta 300
cttccattgt gggtaatgta tttggattca aggctctgcg tgctctacgt ctggaggatt 360
tgcgaatccc tactgcttat attaaaactt tccaaggccc gcctcatggt atccaggttg 420
aaagagataa attgaacaag tatggtcgcc ctctattggg atgtactatt aaaccaaaat 480
tgggattatc cgctaagaat tatggtagag cagtttatga atgtctacgc ggtggacttg 540
a 541
<210> 7
<211> 541
<212> DNA
<213> Cucurbita pepo
<400> 7
aagattataa attgacttat tatactcctg aatatgaaac caaagatact gatatcttgg 60
cagcattccg agtaactcct caaccgggag ttccacccga ggaagcaggg gccgctgtag 120
ctgctgaatc ttctactggt acatggacaa ctgtgtggac cgatgggctt accagtcttg 180
atcgttacaa aggacgatgc tatggaatcg agcctgttcc tggagaagaa aatcaatata 240
ttgcttatgt agcttatcct ctagaccttt ttgaagaagg ttctgttact aacatgttta 300
cttccattgt gggtaatgta tttggattca aggctctgcg tgctctacgt ctggaggatt 360
tgcgaatccc tactgcttat attaaaactt tccaaggccc gcctcatggt atccaggttg 420
aaagagataa attgaacaag tatggtcgcc ctctattggg atgtactatt aaaccaaaat 480
tgggattatc cgctaagaat tatggtagag cagtttatga atgtctacgc ggtggacttg 540
a 541
<210> 8
<211> 541
<212> DNA
<213> Cucurbita ficifolia
<400> 8
aggattataa attgacttat tatactcctg aatatgaaac caaagatact gatatcttgg 60
cagcattccg agtaactcct caaccgggag ttccacccga ggaagcaggg gctgctgtag 120
ctgctgaatc ttctactggt acatggacaa ctgtgtggac cgatgggctt accagtcttg 180
atcgttacaa aggacgatgc tatggaatcg agcctgttcc tggagaagaa aatcaatata 240
ttgcttatgt agcttatccc ctagaccttt ttgaagaagg ttctgttact aacatgttta 300
cttccattgt gggtaatgta tttggattca aggctctgcg tgctctacgt ctggaggatt 360
tgcgaatccc tactgcttat attaaaactt tccaaggccc gcctcatggt atccaggttg 420
aaagagataa attgaacaag tatggtcgcc ctctattggg atgtactatt aaaccaaaat 480
tgggattatc cgctaagaat tatggtagag cagtttatga atgtctacgc ggtggacttg 540
a 541
<210> 9
<211> 541
<212> DNA
<213> Cucurbita moschata
<400> 9
aagattataa attgacttat tatactcctg aatatgaaac caaagatact gatatcttgg 60
cagcattccg agtaactcct caaccgggag ttccacccga ggaagcgggg gccgctgtag 120
ctgctgaatc ttctactggt acatggacaa ctgtgtggac cgatgggctt accagtcttg 180
atcgttacaa aggacgatgc tatggaatcg agcctgttcc tggagaagaa aatcaatata 240
ttgcttatgt agcttatccc ctagaccttt ttgaagaagg ttctgttact aacatgttta 300
cttccattgt gggtaatgta tttggattca aggctctgcg tgctctacgt ctggaggatt 360
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aaagagataa attgaacaag tatggtcgcc ctctattggg atgtactatt aaaccaaaat 480
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<211> 541
<212> DNA
<213> Cucurbita argyrosperma
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aagattataa attgacttat tatactcctg aatatgaaac caaagatact gatatcttgg 60
cagcattccg agtaactcct caaccgggag ttccacccga ggaagcgggg gccgctgtag 120
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ttgcttatgt agcttatccc ctagaccttt ttgaagaagg ttctgttact aacatgttta 300
cttccattgt gggtaatgta tttggattca aggctctgcg tgctctacgt ctggaggatt 360
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aaagagataa attgaacaag tatggtcgcc ctctattggg atgtactatt aaaccaaaat 480
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a 541
<210> 11
<211> 187
<212> DNA
<213> Cucurbita maxima
<400> 11
ccccctaccc tatatataag tatatattag aaaaatttaa gtataaatta aaaagttatg 60
taaaattttt taataaaaaa ggagcaatac caatcctctt gagaaaacaa gaaattggtt 120
attgctcctt tactttcaag aacttgtata cactaagaca gaagtcttat ccattgatag 180
atggaac 187
<210> 12
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ccccctaccc tatatataag tatatattag aaaaatagaa gtataaatta aaaagttatg 60
taaaattttt taataaaaaa ggagcaatac caatcctctt gagaaaacaa gaaattggtt 120
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atggaac 187
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ccccctaccc tatatataag tatatattac aaaaatagaa gtataaatta tatagttatg 60
taaaattttt taataaaaaa ggagcaatac caatcctctt gagaaaacaa gaaattggtt 120
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atggaac 187
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<211> 187
<212> DNA
<213> Cucurbita moschata
<400> 14
ccccctaccc tatatataag tatatattag aaaaatagaa gtataaatta aaaagttatg 60
taaaattttt taataaaaaa ggagcaatac caatcctctt gagaaaacaa gaaattggtt 120
attgctcctt tactttcaag aacttgtata cactaagaca gaagtcttat ccattgatag 180
atggaac 187
<210> 15
<211> 187
<212> DNA
<213> Cucurbita argyrosperma
<400> 15
ccccctaccc tatatataag tatatattag aaaaatagaa gtataaatta aaaagttatg 60
taaaattttt taataaaaaa ggagcaatac caatcctctt gagaaaacaa gaaattggtt 120
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atggaac 187
<210> 16
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 16
atgtcaccac aaacagagac taaagc 26
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 17
gaaacggtct ctccaacgca t 21
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 18
taatccccta tccccttcat ctg 23
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 19
tcattgcaca cggctttacc tat 23
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 20
cgcgcatggt ggattcacaa tcc 23
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 21
gttatgcatg aacgtaatgc tc 22
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 22
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<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 23
tatccaagcg ttctcttgac ttttt 25
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 24
attggctaaa gcgaaatttt gtaa 24
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 25
tattggaaga attctttacg gagca 25
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 26
gagcaagaac aggttctttc ttt 23
<210> 27
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 27
cttcccaaga gcttctttta ctttacaga 29
<210> 28
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 28
cttcccaaga gcttctttta ctttacagaa g 31
<210> 29
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 29
cttcccaaga gcttctttta ctttacagag g 31
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 30
tttggatatt atttgcatca a 21
<210> 31
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 31
gatttggcca atcat 15
<210> 32
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 32
gatttggcca atcatg 16
<210> 33
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 33
gatttggcca atcatt 16
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 34
gctgggatca agctggtgtt a 21
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
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<220>
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Claims (28)
- 서열번호 1 내지 5로 표시되는 염기서열의 399번째, 552번째, 857번째 및 859번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는,
10 내지 500개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 호박(Cucurvita spp.) 품종 식별용 SNP 마커 조성물로서,
상기 호박은 서양종호박(Cucurbita maxima), 페포종호박(Cucurbita pepo), 흑종호박(Cucurbita ficifolia), 동양종호박(Cucurbita moschata) 및 녹조종호박(Cucurbita argyrosperma)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 호박(Cucurvita spp.) 품종 식별용 SNP 마커 조성물.
- 제1항에 있어서,
서열번호 6 내지 10으로 표시되는 염기서열의 2번째, 107번째, 113번째 및 260번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 11 내지 15로 표시되는 염기서열의 30번째, 37번째, 38번째, 51번째, 53번째 및 160번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는,
10 내지 500개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 추가적으로 포함하는 것인, 호박 품종 식별용 SNP 마커 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 서열번호 1 내지 5로 표시되는 염기서열의 399번째, 552번째, 857번째 및 859번째 염기는 각각, 399번째 염기가 A 또는 G 이고, 552번째 염기가 T 또는 C 이고, 857번째 염기가 G 또는 A 이고, 859번째 염기가 G 또는 T 인, 호박 품종 식별용 SNP 마커 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 서열번호 1 내지 5로 표시되는 염기서열의 399번째, 552번째, 857번째 및 859번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 폴리뉴클레오티드는,
312번째, 807번째, 825번째, 903번째, 919번째 및 920번째 중 어느 하나 이상의 염기에 위치한 SNP를 더 포함하는, 호박 품종 식별용 SNP 마커 조성물.
- 제4항에 있어서,
상기 312번째, 807번째, 825번째, 903번째, 919번째 및 920번째 염기는 각각, 312번째 염기가 T 또는 C이고, 807번째 염기가 A 또는 G 이고, 825번째 염기가 T 또는 G 이고, 903번째 염기가 C 또는 T 이고, 919번째 염기가 T 또는 G 이고, 920번째 염기가 C 또는 A인, 호박 품종 식별용 SNP 마커 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 399번째, 552번째, 857번째 및 859번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 399번째 염기가 G, 552번째 염기가 T, 857번째 염기가 G, 그리고 859번째 염기가 G 일 경우 서양종호박으로 식별되는 것인, 호박 품종 식별용 SNP 마커 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 399번째, 552번째, 857번째 및 859번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 399번째 염기가 A, 552번째 염기가 T, 857번째 염기가 G, 그리고 859번째 염기가 G 일 경우 페포종호박으로 식별되는 것인, 호박 품종 식별용 SNP 마커 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 서열번호 3로 표시되는 염기서열의 399번째, 552번째, 857번째 및 859번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 399번째 염기가 G, 552번째 염기가 C, 857번째 염기가 G, 그리고 859번째 염기가 G 일 경우 흑종호박으로 식별되는 것인, 호박 품종 식별용 SNP 마커 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 서열번호 4로 표시되는 염기서열의 399번째, 552번째, 857번째 및 859번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 399번째 염기가 G, 552번째 염기가 T, 857번째 염기가 A, 그리고 859번째 염기가 T 일 경우 동양종호박으로 식별되는 것인, 호박 품종 식별용 SNP 마커 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 399번째, 552번째, 857번째 및 859번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 399번째 염기가 G, 552번째 염기가 T, 857번째 염기가 A, 그리고 859번째 염기가 G 일 경우 녹조종호박으로 식별되는 것인, 호박 품종 식별용 SNP 마커 조성물.
- 제2항에 있어서,
상기 서열번호 6 내지 10으로 표시되는 염기서열의 2번째, 107번째, 113번째 및 260번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 각각, 2번째 염기가 A 또는 G 이고, 107번째 염기가 A 또는 G 이고, 113번째 염기가 C 또는 T 이고, 260번째 염기가 T 또는 C인, 호박 품종 식별용 SNP 마커 조성물.
- 제2항에 있어서,
상기 서열번호 11 내지 15로 표시되는 염기서열의 30번째, 37번째, 38번째, 51번째, 53번째 및 160번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 각각, 30번째 염기가 C 또는 G 이고, 37번째 염기가 A 또는 T 이고, 38번째 염기가 G 또는 T 이고, 51번째 염기가 A 또는 T 이고, 53번째 염기가 A 또는 T 이고, 160번째 염기가 A 또는 C인, 호박 품종 식별용 SNP 마커 조성물.
- 제1항의 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 호박 품종 식별용 조성물로서,
상기 호박은 서양종호박(Cucurbita maxima), 페포종호박(Cucurbita pepo), 흑종호박(Cucurbita ficifolia), 동양종호박(Cucurbita moschata) 및 녹조종호박(Cucurbita argyrosperma)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 호박 품종 식별용 조성물.
- 제13항에 있어서,
상기 제제는 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 프라이머 세트 또는 프로브인 것인, 호박 품종 식별용 조성물.
- 삭제
- 제14항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 23, 24, 27, 28 및 29로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는, 호박 품종 식별용 조성물.
- 제16항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 22, 25, 26, 30, 31, 32 및 33으로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 34 내지 38로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 39 내지 46으로 표시되는 프라이머 세트 중 선택되는 어느 하나 이상을 추가적으로 포함하는 것인, 호박 품종 식별용 조성물.
- 제13항, 제14항, 제16항 및 제17항 중 어느 한 항의 호박 품종 식별용 조성물을 포함하는, 호박 품종 식별용 키트로서,
상기 호박은 서양종호박(Cucurbita maxima), 페포종호박(Cucurbita pepo), 흑종호박(Cucurbita ficifolia), 동양종호박(Cucurbita moschata) 및 녹조종호박(Cucurbita argyrosperma)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 호박 품종 식별용 키트.
- 삭제
- 제18항에 있어서,
상기 키트는 제1항의 SNP 마커를 증폭하기 위한 시약을 더 포함하는, 호박 품종 식별용 키트.
- 제20항에 있어서,
상기 증폭하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼(buffer)를 포함하는 것인, 호박 품종 식별용 키트.
- 다음의 단계를 포함하는, 호박 품종 식별 방법 :
(a) 호박 시료로부터 핵산을 분리하는 단계;
(b) 상기 분리된 핵산으로부터 제1항에 따른 SNP 마커를 검출하는 단계; 및
(c) 상기 검출한 SNP 마커로부터 서양종호박(Cucurbita maxima), 페포종호박(Cucurbita pepo), 흑종호박(Cucurbita ficifolia), 동양종호박(Cucurbita moschata) 및 녹조종호박(Cucurbita argyrosperma)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 호박 품종을 식별하는 단계.
- 제22항에 있어서,
상기 (b) 단계는 제1항의 서열번호 1 내지 5로 표시되는 염기서열의 312번째, 807번째, 825번째, 903번째, 919번째 및 920번째 중 하나 이상의 염기에 위치한 SNP 마커를 추가적으로 검출하는 단계를 포함하는 것인, 호박 품종 식별 방법.
- 제22항에 있어서,
상기 (b) 단계는,
(i) 상기 분리된 핵산을 주형으로 하여, 제13항에 따른 호박 품종 식별용 조성물을 이용하여 PCR을 수행하는 단계;
(ii) 상기 PCR을 수행하는 단계에서 증폭된 PCR 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 호박 품종 식별 방법.
- 제24항에 있어서,
상기 (i)단계는 상기 SNP 마커를 증폭시키기 위한 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응을 수행하는 단계를 포함하는, 호박 품종 식별 방법.
- 제25항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 23, 24, 27, 28 및 29로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는, 호박 품종 식별 방법.
- 제26항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 22, 25, 26, 30, 31, 32 및 33으로 표시되는 프라이머 세트를 추가적으로 포함하는 것인, 호박 품종 식별 방법.
- 제26항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 34 내지 38로 표시되는 프라이머 세트 및 39 내지 46으로 표시되는 프라이머 세트 중 선택되는 어느 하나 이상을 추가적으로 포함하는 것인, 호박 품종 식별 방법.
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Patent Citations (1)
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Non-Patent Citations (1)
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| Nam Ngoc Nguyen et al., Horticulture Research, 7:121, 2020.* |
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