KR102615873B1 - 수수 품종을 판별하기 위한 Indel 마커 및 이의 이용 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 수수 품종, 구체적으로 국내 육성 수수 7개 품종을 판별하는 Indel 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 Indel 마커는 PCR 반응으로 증폭하였을 때 다형화 현상이 나타나게 하는 장점을 유지하면서도, 고밀도 유전자지도 제작에는 충분하지 않는 SSR 마커의 단점을 보완할 수 있으며, 나아가 수수 품종의 유전자 정보를 디지털 신호로 전환함으로써 신속하고 객관적으로 수수 품종을 인식할 수 있음은 물론, 충분한 수의 마커를 조합하여 사용함으로써, 국내 육성 수수 7개 품종을 판별할 수 있다.
본 발명의 Indel 마커는 PCR 반응으로 증폭하였을 때 다형화 현상이 나타나게 하는 장점을 유지하면서도, 고밀도 유전자지도 제작에는 충분하지 않는 SSR 마커의 단점을 보완할 수 있으며, 나아가 수수 품종의 유전자 정보를 디지털 신호로 전환함으로써 신속하고 객관적으로 수수 품종을 인식할 수 있음은 물론, 충분한 수의 마커를 조합하여 사용함으로써, 국내 육성 수수 7개 품종을 판별할 수 있다.
Description
본 발명은 수수 품종, 구체적으로 국내 육성 수수 7개 품종을 판별하는 Indel 마커 및 이의 이용에 관한 것이다.
수수는 세계 5대 작물에 해당하는 작물로 고온이나 염해에도 강해 환경적응성이 우수하고 항산화 활성도 높은 작물이다. 또한 수수는 노화와 만성 질환 예방 등 항산화 활성에 관련이 있는 것으로 보고되었다 (Kim et al., 2006; Awika et al., 2003; Kil et al., 2009).
그러나, 수수의 경우 자식성 식물이지만 타식율이 높아 품종 순도를 유지하기 위해 많은 노력이 들어간다. 이에, 종자 보급을 위한 보급체계단계에서 재래종과의 혼입을 막고 기본식물, 원원종, 원종, 보급종이 순도관리가 되고 있는지에 대한 검증을 하여 보급종자의 품종관리와 종자보증을 하기 위하여 국산 수수 품종을 선정하고, 이에 대해 다양한 품질향상 기술을 개발할 필요가 있다.
이와 관련하여, 지식재산권 등의 강화를 통하여 국내에서 개발된 수수 품종의 권리 확보가 중요해지고 있어 사람의 고유 신분증과 같은 품종 인식기술개발이 절실하게 필요하게 되었다.
이에 따라, 분자 육종시스템에서 유용 형질 탐색, 생물의 종 인식, 품종 분류동정 및 집단 개체군의 유연관계 분석 등의 목적으로 분자마커(molecular marker)가 널리 이용되고 있다. 분자마커의 경우, 환경변이에 영향을 받지 않고 어린 시기에 형질을 탐색할 수 있기 때문에 대량의 자원을 정확하고 빠르게 분석할 수 있는 장점이 있다.
가장 먼저, 염색체 내 제한효소 인식부위의 변이의 의해 발생하는 염기서열 길이 차이를 이용한 RFLPs(Restriction Fragment Length Polymorphisms) 방법이 개발되었으나 이 방법은 방사선 동위원소를 사용해야 하는 번거로움이 있다. 이후 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 이용한 핵산지문법(fingerprinting)으로서, RAPD(randomly amplified polymorphic DNA) 방법 등이 개발되었다. PCR 방법은 10~20여 개의 뉴클레오티드로 구성된 작은 올리고뉴클레오타이드(이하 프라이머)을 생물체의 DNA 또는 RNA와 결합(annealing)시킨 후, 내열성 DNA 중합 효소(Taq DNA Polymerase)를 첨가하여 합성반응이 반복적으로 이루어지게 하는 방법이다. 이것은 다른 방법에 비해 소량의 DNA(1-50ng)만을 요구하며, 간편하고 빠르게 결과를 확인할 수 있다는 장점을 갖고 있다. PCR 방법으로 분석하는 상기 방법 중 RAPD 방법은 비특이적 PCR 산물이 증폭되므로 재현성이 떨어지는 단점이 있고, AFLP(Amplified Fragment Length polymorphism) 방법은 높은 DNA 다형성(polymorphism) 검출로 각광을 받고 있지만 재현성이 떨어지는 밴드의 출현과 분석이 복잡하며, SSR(single sequence repeat) 방법은 DNA 반복 배열인 초위성체(microsatellite) 영역의 염기배열 정보를 근거로 PCR 프라이머를 제작하여 개체 내의 초위성체를 분석하는 방법으로 상기 단순염기서열의 반복수는 품종 간 또는 개체 간에 다르게 때문에 이 부분을 PCR 반응으로 증폭하였을 때 다형화 현상이 나타나게 되며 이를 동물과 식물의 유전 연구에 활발히 이용하고 있으나, 콩에서 기 개발된 SSR 마커의 수가 고밀도 유전자지도 제작에는 충분하지 않는 단점이 있다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 국산 수수 품종 판별을 위해 예의 연구 노력한 결과, 품종별로 특이적인 Indel(insertion-deletion) 변이 서열을 확인하였고, 이로부터 품종간 구별이 가능한 다형성을 보이는 4쌍의 Indel 마커를 선별하였으며, 상기 마커를 이용하여 국내 수수 7개 품종을 판별할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1 내지 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드; 또는 상기 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드;를 포함하는, 수수 품종 판별용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 서열번호 1 내지 서열번호 8의 염기서열에서 선택되는 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 및 이들의 조합;으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 수수 품종 판별용 프라이머 세트를 포함하는, 수수 품종 판별용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 (a) 시료로부터 분리된 DNA를 주형으로 하여 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 수득한, 증폭된 PCR 산물을 분석하는 단계를 포함하는, 수수 품종 판별 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 수수 품종 판별용 키트를 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 발명의 하나의 양태는 서열번호 1 내지 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드; 또는 상기 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드;를 포함하는, 수수 품종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에서 용어, "수수(Sorghum bicolor)"는 외떡잎 식물 벼목 화본과의 한해살이풀을 의미한다. 상기 수수는 밀, 벼, 옥수수, 콩 및 보리와 함께 세계 주요 6대 곡류 작물로 생육 기간이 짧고, 건조하고 고온의 지역 및 척박한 토양에서도 생육이 왕성하여 우리나라 전지역에서 재배가 가능하다 (Kim et al., 2006; Cho et al., 2004; Zhao et al., 2000).
본 발명에서 용어, "올리고뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥을 의미한다. 상기 올리고뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드와 혼용될 수 있다.
본 발명에서 용어, “프라이머(primer)"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 하며, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라, 온도 및 이온 강도와 같은 이용 조건에 의존할 것이다. 구체적 예로, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 구아닌 및 시토신의 함량(GC contents), GC배열, 어닐링(annealing) 온도 및 이온 강도 등 여러 조건을 고려하여 결정해야 한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트(dNTPs)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 발명에서 프라이머로 이용된 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 구체적인 예로써 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent) 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 프라이머는 변형시킬 수 있으며, 예를 들어 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 치환 또는 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있을 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트는, 구체적으로 서열번호 1 내지 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
상기 프라이머 세트는
i) 서열번호 2n-1의 정방향 프라이머; 및
ii) 서열번호 2n의 역방향 프라이머;로 구성되는 프라이머 세트를 포함하고,
상기 n은 1 내지 4의 자연수로, i) 및 ii)의 n은 동일한 값을 갖는 4쌍의 프라이머 세트로 구성될 수 있다.
일예로, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6로 구성되는 프라이머 세트; 또는 서열번호 7 및 서열번호 8 로 구성되는 프라이머 세트;로 구성될 수 있다.
한편, 전술한 프라이머 세트와 동일한 영역을 증폭할 수 있고 동일한 기능을 하는 프라이머라면, 본 발명의 범위에 포함될 수 있다.
또한, 서열번호 1 내지 8로 구성되는 4쌍의 프라이머 세트 중 1쌍 이상, 2쌍 이상, 3쌍 이상 또는 4쌍의 프라이머 세트를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 수수 품종 판별용 프라이머 세트는, 표적 서열의 증폭을 위하여 사용될 수 있으며, 특히, 수수 품종 판별을 위한 Indel 서열의 증폭을 위하여 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 프라이머 세트는 수수 게놈 DNA의 Chr01, Chr02, Chr07 및 Chr09로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 존재하는 Indel 서열, 즉, Indel의 마커를 검출 또는 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트일 수 있다.
본 발명에서 용어, "Indel(Insertion/deletion) 마커"는 DNA의 염기배열에서 일부 염기가 중간에 삽입되거나(insertion) 결실된(deletion) 변이를 총칭한다. 상기 Indel 마커는 표준유전체와 실험에 사용된 품종의 유전체 정보를 비교 분석하는 방법을 통해 표준유전체보다 삽입(insertion) 또는 결실(deletion)된 영역을 탐색하고 그 정보를 바탕으로 프라이머를 제작한다. 따라서 그 증폭 결과는 표준유전체와 비교하여 밴드 크기가 큰 경우(insertion)와 작은 경우(deletion)의 두 종류 타입을 나타낼 수 있다.
상기 "마커(marker)"는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고점으로 사용되는 염기서열을 의미한다.
상기 용어, "표준유전체"는 본 발명의 품종 판별에 있어 기준이 되는 작물의 품종의 유전체를 의미한다. 상기 표준유전체는 특정된 것이 아니라, 원하는 품종으로 설정할 수 있다.
상기 용어, "유전자좌"는 분자 마커의 유전자 지도상의 위치를 의미한다.
본 발명의 프라이머 세트는 황금찰, 남풍찰, 동안메, 소담찰, 바르메, 노을찰 및 더하메로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 품종을 판별할 수 있는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에서, 본 발명에서 선별된 4쌍의 프라이머 세트를 이용하여 국내 수수 7개 품종에 대해 PCR 수행 후 다형성 분석한 결과, 국내 수수 7개 품종을 판별할 수 있음을 확인하였다(도 1).
본 발명의 다른 하나의 양태는 서열번호 1 내지 서열번호 8의 염기서열에서 선택되는 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 및 이들의 조합;으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 수수 품종 판별용 프라이머 세트를 포함하는, 수수 품종 판별용 조성물을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (a) 시료로부터 분리된 DNA를 주형으로 하여 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 수득한, 증폭된 PCR 산물을 분석하는 단계를 포함하는, 수수 품종 판별 방법을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
상기 (a) 단계는 시료로부터 분리된 DNA를 주형으로 하여, 본 발명의 수수 품종 판별용 조성물 또는 본 발명의 수수 품종 판별용 키트를 이용하여 PCR을 수행하는 것일 수 있다. 상기 본 발명의 수수 품종 판별용 조성물 또는 본 발명의 수수 품종 판별용 키트는 이전 양태에서 전술한 바와 같다.
상기 (a) 단계는 수수 식물 개체 또는 종자로부터 분리된 시료를 이용하여 게놈 DNA를 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 시료는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일예로, 종자, 분리된 조직 또는 분리된 세포일 수 있다.
상기 (a) 단계는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의하여 수행될 수 있다. 상기 본 발명의 프라이머 세트는 이전 양태에서 전술한 바와 같다.
또한, 상기 (a) 단계의 PCR 수행 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 구체적으로, 주형으로 사용되는 DNA는 각각의 개별 수수 식물 또는 종자로부터 분리된 DNA일 수 있고, 2 이상의 수수 식물 또는 종자를 포함하는 혼합 물질로부터 분리된 DNA일 수도 있다.
상기 (b) 단계는 상기 (a) 단계에서 수득한, 증폭된 PCR 산물을 분석하는 것일 수 있다.
상기 증폭된 PCR 산물의 분석은 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 구체적으로, (a) 단계에 의하여 증폭된 DNA 마커의 서열을 결정하여, 목적하는 DNA 마커가 검출되었는지의 여부를 확인할 수 있다. 구체적인 방법으로서 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 프라이머 세트를 사용하여 증폭시킨 PCR 산물을 보다 효과적으로 인식하기 위하여, 상기 프라이머의 5' 또는 3' 말단에 형광물질 등으로 표지할 수 있다. 이때, 사용되는 형광물질은 특별히 이에 제한되지 않으나, FAM(6-carboxyfluorescein), HEX (2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), NEDTM 등을 사용할 수 있다. 그러나, 본 발명의 특이적 프라이머 세트는 증폭된 PCR 산물의 명확한 크기 차이로 인하여, 별다른 형광물질의 표지 없이도 겔 상에서 밴드 사이즈로 이를 명확히 구분할 수 있다.
본 발명의 Indel 마커는 표준유전체와 실험에 사용된 품종의 유전체 정보를 비교분석하는 방법을 통해 표준유전체보다 삽입(insertion) 또는 결실(deletion)된 영역을 탐색하고, 그 정보를 바탕으로 프라이머를 제작한 것이다. 따라서 그 증폭 결과는 표준유전체와 비교할 때, 밴드크기가 큰 경우(insertion)와 작은 경우(deletion) 두 종류의 밴드를 나타낸다. 상기에서 표준유전체는 특정된 것이 아니라, 원하는 품종으로 설정할 수 있다. 일예로, 상기 표준유전체는 Phytozome 12-Sorghum bicolor Rio v2.1(sorghum Rio)일 수 있다.
따라서, 본 발명의 Indel 마커를 사용함으로써 인식하고자 하는 콩 품종이 표준유전체 또는 다른 콩 품종과 상이한 고유의 증폭 결과를 나타내므로, 이들 간의 증폭 산물을 비교함으로써 품종을 인식할 수 있다(도 1).
일예로, 상기 콩 품종을 인식함에 있어, 증폭된 산물을 표준 콩 품종 또는 다른 콩 품종의 증폭된 산물과 비교하여 코드화할 수 있다.
구체적 예로, 증폭된 Indel 마커 정보를 "0", "1", "2", "3" 등의 디지털 신호로 전환하고, "0"은 흰색, "1", "2", "3"은 검정색의 1차원 또는 2차원 형태의 바코드로 표시함으로써, 보다 객관적이고 신속하게 콩 품종을 인식할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, Indel 마커의 증폭결과를 상기와 같이 바코드화하여 나타내었으며, 품종마다 모두 고유한 패턴이 그려질 수 있음을 확인하였다. 또한, 이를 2차원 바코드 또는 QR 코드로 표현할 경우, 각 염색체별 고유 패턴을 한눈에 쉽게 알 수 있어, 각 품종을 인식함에 있어 매우 효과적이다(실시예 5 및 도 2).
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는, 수수 품종 판별용 키트를 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명의 키트는, 이에 제한되는 것은 아니나, PCR 키트, DNA 분석용(예, DNA 칩) 키트일 수 있다.
본 발명의 키트는 본 발명의 조성물을 이용하여 수수 게놈 DNA의 Chr01, Chr02, Chr07 및 Chr09로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 존재하는 Indel 서열을 증폭하여 확인함으로써, 국내 수수 품종을 판별 또는 구별하는데 사용될 수 있다. 구체적인 일례로서, 본 발명에서 제공하는 상기 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다.
예를 들어, PCR 키트는, 이전 양태에서 전술한 프라이머 세트 외에도 DNA 중합효소, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), 반응완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 테스트 튜브, 다른 적절한 컨테이너, 다양한 효소(Taq-폴리머라아제 등), DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 예로서, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 수수 품종 판별용 DNA 칩 키트일 수 있다.
본 발명의 용어 "DNA 칩"이란, 수십만 개의 DNA의 각 염기를 한번에 확인할 수 있는 DNA 마이크로어레이의 하나를 의미한다.
상기 DNA 칩 키트는, 일반적으로 편평한 고체 지지판, 전형적으로는 현미경용 슬라이드보다 크지않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열(gridded array)로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산과 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간에 다중 혼성화(hybridization) 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구일 수 있다.
본 발명에 따른 Indel 마커는 PCR 반응으로 증폭하였을 때 다형화 현상이 나타나게 하는 장점을 유지하면서도, 고밀도 유전자지도 제작에는 충분하지 않는 SSR 마커의 단점을 보완할 수 있다.
나아가, 수수 품종의 유전자 정보를 디지털 신호로 전환함으로써 신속하고 객관적으로 수수 품종을 인식할 수 있음은 물론, 충분한 수의 마커를 조합하여 사용함으로써, 국내 육성 수수 7개 품종을 판별할 수 있다.
따라서, 궁극적으로는 국내 육성 수수 품종의 유전자원 보호에 활용할 수 있으며, 국내 수수 품종의 지식재산권 보호 및 국산 수수 브랜드화 촉진을 통한 국내 수수 산업의 경쟁력을 제고할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 Indel 마커를 이용하여 수수 7개 품종을 판별한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 수수 7개 품종별 Indel 마커의 증폭결과를 코드화한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 수수 7개 품종별 Indel 마커의 증폭결과를 코드화한 결과를 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 국내 육성 수수 품종의 DNA 추출
국내 육성 수수 7개 품종 정보는 하기 표 1과 같다.
| No. | Cultivar name | Years released |
Breeding method (Cross combination) |
Remark |
| 1 | 황금찰 | 2004 | 순계분리 | - 조생종, 내도복, 다수, 찰성 - 불포화 지방산 함량 많음 - 식용 및 가공 겸용 |
| 2 | 남풍찰 | 2012 | 순계분리 | - 중생종, 찰수수, 내도복성, 내재해성- 다수성, 혼합 및 가공용, 228kg/10a |
| 3 | 동안메 | 2012 | 순계분리 | - 중생종, 메수수, 다분얼성, 내도복성- 항산화 활성, 혼합 및 가공용, 310kg/10a |
| 4 | 소담찰 | 2013 | 교배육종(황금찰/중모4001) | - 중생종, 찰수수, 단간, 내도복성 - 기계화 수확가능, 혼반 및 가공용, 295kg/10a |
| 5 | 바르메 | 2019 | 교배육종(중모4001/꼬마단수수) | - 메수수, 단간, 타원형 이삭, 다수성 - 기계화 수확가능, 국수 등 가공용, 436kg/10ha |
| 6 | 노을찰 | 2019 | 교배육종 (RT2907/꼬마단수수) |
- 단간, 찰수수, 난형 이삭, 다수성 - 기계화 수확 가능, 혼반 및 제과제빵용, 371kg/10ha |
| 7 | 더하메 | 2020 | 잡종교배(F1, Hybrid A03017/소담찰) | - 초다수성, 메수수, 단간 - 기계화 수확 적합, 484kg/10ha |
각 품종들의 게놈 DNA는 유묘의 잎으로부터 제조사의 프로토콜에 따라 Dneasy plant pro kit(Qiagen, Germany)을 이용하여 추출하였다.
구체적으로, 유묘기 잎을 작게 잘라 TissueLyser에 넣어 분쇄 후, CD1, CD2, AW1, AW2, AW3용액을 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA는 NanoDrop(Thermo Scientific, United states)으로 DNA의 순도를 검정하여 실험에 이용하였다.
실시예 2. 변이영역 탐색
수수 품종의 유전체내 변이영역 탐색을 위해 동안메, 황금찰, 남풍찰, 소담찰 4 품종을 차세대 염기서열분석(Next Generation Sequencing, NGS)기법으로 전체 염기서열을 분석하였다. 분석한 염기서열을 표준 유전체인 Phytozome 12-Sorghum bicolor Rio v2.1(sorghum Rio)와 비교하여 변이영역을 탐색하였다. 확보된 high quality sequence 데이터는 BWA 0.7.17 프로그램을 이용하여 reference genome에 mapping과정을 수행하여 각 샘플별 mapping 데이터는 Picard ver. 1.112와 GATK ver. 3.5 프로그램을 이용하여 genotyping하였다. 변이영역을 탐색하기 위해 min coverage 5, max coverage 250 및 Quality 20 이상, SNP ratio 0.9이상, progency 4개 이상으로 필터링하여 변이를 탐색하였다. 표준유전체와 상기 4개의 품종을 비교 분석한 수수 유전체 재분석 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
| Cultivars | Trimmed Reads | Properly mapped reads on reference sequence | Unique hit PE reads | Unmapped reads | Average depth(X) |
| 동안메 | 145,962,108 | 133,985,630 | 95,494,314 | 2,861,900 | 18.64 |
| 황금찰 | 202,303,444 | 183,494,650 | 129,658,082 | 4,630,678 | 24.96 |
| 남풍찰 | 244,383,334 | 221,763,996 | 156,760,238 | 5,634,646 | 30.09 |
| 소담찰 | 175,333,904 | 161,877,958 | 113,749,718 | 3,618,808 | 22.12 |
실시예 3. 변이영역 특이 Indel마커 선발
상기 실시예 2에서 분석된 표준 유전체와 동안메, 황금찰, 남풍찰, 소담찰 4품종의 유전체 정보 비교분석 결과를 바탕으로 염기서열의 삽입/결실(Insertion/deletion, Indel)영역을 탐색하였다. Indel 변이 위치를 reference genome에서 찾아 해당 위치의 앞뒤서열을 이용하여 forward 및 reverse PCR primer를 설계하였다. 설계된 primer 서열은 reference genome에 BLAST분석을 진행하여 BLAST 분석 결과, primer가 설계된 원래 자리에 매치되고 그 외 다른 genome 서열에는 매치되지 않는 primer를 선택하였다.
그 중, Indel 크기가 20bp이상이고, 4품종 모두에서 SNP ratio = 1 및 SNP depth 10이상이고, 목표 품종에서 Indel 크기가 20bp 이상을 선발하여 총 11,113개 Indel과 4품종 간 모두에서 차이를 보이거나 높은 표준편차가 나타나는 총 13개의 Indel을 이용하여 Indel primer를 제작하였다.
상기 과정에 의하여 변이영역 특이 Indel 마커 선발을 위해 유전체 해독 정보를 바탕으로 총 130개의 Indel 마커 프라이머를 제작하고, 이 중 품종판별에 이용할 수 있도록 Indel 마커의 특징인 2가지 밴드타입(type)이 정확히 증폭되는 41개의 Indel 마커를 선발하였다.
그 결과, 41개의 Indel 마커 중 남풍찰, 동안메, 황금찰, 소담찰, 바르메, 노을찰, 더하메 7품종을 판별할 수 있는 4개의 Indel 마커를 선별하였다. 선발한 4개의 Indel 마커 프라이머 정보는 하기 표 3에 나타내었다.
| No. |
Indel
Markers |
Reference genome
Chr. 위치 |
Pos | Status | Forward primer | Reverse primer |
| 1 | sorghum _indel_74 |
Chr09 | 42262747 | Intergenic | TTGCCACCAACATCCTCTATTT (서열번호 1) |
CTACACAAGATTGCTCGTGTTG (서열번호 2) |
| 2 | sorghum_indel_76 | Chr01 | 59451409 | Intergenic | AATTTGTCACAAGCAAACTGGG (서열번호 3) |
CTCTCGCTCGTTTCGATTAGTC (서열번호 4) |
| 3 | sorghum _indel_108 |
Chr07 | 6087168 | Intergenic | ACCGGGTTCATATAAATTGCGA (서열번호 5) |
CCTGGATCTGCCCTCTACTAG (서열번호 6) |
| 4 | sorghum_indel_119 | Chr02 | 69495934 | Intergenic | TATCCACCAATCCAATAGCGAG (서열번호 7) |
CGAGTGGCTACAAGGCTAATAT (서열번호 8) |
실시예 4. Indel마커의 품종 판별능 확인
상기 표 3에 나타낸 4쌍의 Indel 마커를 검출할 수 있는 프라이머 쌍을 이용하여 국내 수수 7개 품종에 대해 PCR 수행 후 구별성 및 품종 판별 가능성을 검정하였다. 검정 결과는 도 1에 나타내었다.
구체적으로, PCR 증폭을 위한 반응액은 총 10㎕로 10ng의 주형 DNA, 10pmol의 forward와 reverse primer, 2X TOPsimple PreMix-Tenuto(Enzynomic)으로 구성하였다. PCR 반응조건은 95℃에서 5분간 초기변성(denaturation)을 한 후, 95℃에서 20초간 변성(denaturation), 55℃에서 20초간 어닐링(annealing), 72℃에서 1분간 증폭(extension)을 35회 반복하였으며 최종증폭(final extension)을 12℃에서 실시하였다. PCR 산물은 15bp/1kb alignment marker, 50/800bp size marker를 이용한 QIAxcel Advanced system(Qiagen)을 사용하여 분석하였다.
선발된 Indel 마커는 증폭 산물의 크기가 190~610bp이며, 2% 아가로스 겔에서 짧은 시간에 유전형 차이를 쉽게 확인할 수 있었다.
SNP를 이용한 유전형 분석은 다소 복잡한 플랫폼과 고가의 장비가 필요하므로, 아가로스 겔에서 유전형을 쉽게 확인할 수 있는 PCR 기반의 Indel 마커는 육종 및 연구분야에 매우 유용하다.
본 실시예에서 선발된 20bp 이상의 Indel을 이용한 4쌍의 Indel 마커는 2% 아가로스 겔에서 다형성이 쉽게 구분되었으며, 상기 4쌍의 Indel 마커로 국내에서 육성된 7개 수수 품종을 판별할 수 있음을 확인하였다. 이에, 국내 육성 수수 품종의 유전자원 보호에 활용할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 5. 증폭된 Indel마커 산물의 코드화를 통한 품종인식 분석
증폭된 Indel 마커 정보를 코드화하였다. 구체적으로, Indel 마커 검정결과 나타나는 밴드 size를 바탕으로 각 마커별로 '0', '1', '2', '3'으로 바코드화시켰다. 마커별 바코드화 시킨 밴드 size는 표 4에 나타내었다. 바코드한 데이터를 바탕으로 FORMTEC 프로그램을 통해 QR코드를 제작하였다.
품종별 바코드 및 QR 코드는 하기 표 4 및 도 2에 나타내었다.
| Indel＼품종 | 황금찰 | 남풍찰 | 동안메 | 소담찰 | 바르메 | 노을찰 | 더하메 | Remark |
| Indel 74 |
1 | 1 | 0 | 1 | 1 | 0 | 2 | 0=190bp 1=310bp 2=190,310bp |
| indel 76 | 0 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0=300bp 1=360bp |
| indel 108 | 1 | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0=310bp 1=340bp |
| indel 119 | 2 | 2 | 2 | 1 | 0 | 1 | 3 | 0=410bp 1=420bp 2=610bp 3=410,420,440bp |
| 품종별 바코드 | 1012 | 1102 | 0102 | 1101 | 1110 | 0101 | 2103 |
본 실시예에서 코드화된 결과를 바코드 또는 QR 코드로 표현함으로써 각 염색체별 고유 패턴을 한눈에 쉽게 알 수 있었으며, 각 품종을 인식함에 있어 매우 효과적임을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION)
<120> Indel markers for discriminating malting Sorghum bicolor
varieties and uses thereof
<130> KPA211024-KR
<160> 8
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sorghum_indel_74_F
<400> 1
ttgccaccaa catcctctat tt 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sorghum_indel_74_R
<400> 2
ctacacaaga ttgctcgtgt tg 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sorghum_indel_76_F
<400> 3
aatttgtcac aagcaaactg gg 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sorghum_indel_76_R
<400> 4
ctctcgctcg tttcgattag tc 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sorghum_indel_108_F
<400> 5
accgggttca tataaattgc ga 22
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sorghum_indel_108_R
<400> 6
cctggatctg ccctctacta g 21
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sorghum_indel_119_F
<400> 7
tatccaccaa tccaatagcg ag 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sorghum_indel_119_R
<400> 8
cgagtggcta caaggctaat at 22
Claims (12)
- 서열번호 1 내지 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드; 또는 상기 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드;를 포함하는, 수수 품종 판별용 프라이머 세트로,
상기 프라이머 세트는 황금찰, 남풍찰, 동안메, 소담찰, 바르메, 노을찰 및 더하메로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 품종을 판별하는 것인, 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인, 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는
i) 서열번호 2n-1의 정방향 프라이머; 및
ii) 서열번호 2n의 역방향 프라이머;로 구성되는 프라이머 세트를 포함하고,
상기 n은 1 내지 4의 자연수로, i) 및 ii)의 n은 동일한 값을 갖는 4쌍의 프라이머 세트로 구성되는 것인, 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6로 구성되는 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 서열번호 8 로 구성되는 프라이머 세트;로 구성되는 것인, 프라이머 세트.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 수수 게놈 DNA의 Chr01, Chr02, Chr07 및 Chr09로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 존재하는 Indel 서열을 검출 또는 증폭시킬 수 있는 것인, 프라이머 세트.
- 제1항의 수수 품종 판별용 프라이머 세트를 포함하는, 수수 품종 판별용 조성물로,
상기 조성물은 황금찰, 남풍찰, 동안메, 소담찰, 바르메, 노을찰 및 더하메로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 품종을 판별하는 것인, 조성물.
- (a) 시료로부터 분리된 DNA를 주형으로 하여 제1항 내지 4항 및 제6항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 수득한, 증폭된 PCR 산물을 분석하는 단계를 포함하는, 수수 품종 판별 방법으로,
상기 방법은 황금찰, 남풍찰, 동안메, 소담찰, 바르메, 노을찰 및 더하메로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 품종을 판별하는 것인, 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 (b) 단계의 증폭 산물의 분석은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 (b) 단계의 증폭 산물을 코드화 하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 서열번호 1 내지 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 4쌍의 프라이머 세트를 포함하는 수수 품종 판별용 키트로,
상기 키트는 황금찰, 남풍찰, 동안메, 소담찰, 바르메, 노을찰 및 더하메로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 품종을 판별하는 것인, 키트.
- 제11항에 있어서, 상기 키트는 DNA 중합효소, dNTPs 및 반응완충액을 추가로 포함하는, 키트.
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-
2021
- 2021-08-18 KR KR1020210108882A patent/KR102615873B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
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