KR101960072B1 - 수수 계통의 시안화수소 함량 판별용 분자마커 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 수수 계통의 시안화수소 함량 판별용 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명을 통해, 시안화수소 고함량 수수 계통을 효율적으로 판별하여 시안화수소 저함량 수수 계통을 육성할 수 있어 육종에 소요되는 시간, 비용 및 노력을 절감하는 데 매우 유용할 것으로 기대되며, 본 발명의 방법으로 육성한 베타시아노알라닌 합성유전자의 변이를 가진 품종의 판별을 통해 육성한 우량품종의 보급은 재배 농가 및 소비자에게도 고품질의 수수 생산 및 공급을 가능하게 할 것으로 기대된다.

Description

수수 계통의 시안화수소 함량 판별용 분자마커 및 이의 용도{Molecular marker for discriminating hydrogen cyanide content of sorghum line and uses thereof}
본 발명은 수수 계통의 시안화수소 함량 판별용 분자마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
수수(Sorghum bicolor)에는 안토시아닌과 같은 페놀성 화합물뿐만 아니라 다양한 이차대사물질이 존재한다. 그 중에 둘린(dhurrin)은 타이로신(L-tyrosine)으로부터 생합성되고, 시안화기(CN-)와 글루코스(glucose)를 함유하는 청산화합물로, 수수에 대량으로 함유되어 있는 대표적인 이차대사물질이다. 둘린이 분해되는 과정에서 시안화수소(HCN)가 발생하는데 수수를 섭식하는 과정에서 초식동물이나 인간에게 중독을 일으킨다. 이러한 둘린은 성숙된 종자에는 극미량으로 존재하여 해가 없으나 유묘기의 수수에서는 건중량 대비 최대 6% 가량의 축적이 일어난다. 수수가 유용한 특성을 지녔음에도 불구하고, 시안화수소 중독에 대한 예방이나 높은 사료생산에 대한 비용의 발생은 수수의 작물로서의 이용에 대한 경쟁력을 감소시킨다.
이차대사물질인 둘린은 수수에서 질소저장화합물, 파이토알렉신 (phytoalexin), 삼투압조절인자 등의 기능을 한다고 알려져 있다. 둘린은 CYP79A1, CYP71E1 및 UGT85B1 효소에 의해 타이로신으로부터 생합성되며, α-히드록시니트릴리아제(α-hydroxynitrile lyase)에 의해 p-히드록시벤즈알데히드(p-hydroxybenzaldehyde)와 시안화수소로 분해된다. 이렇게 생성된 시안화수소는 수수 자체에도 독성을 띄기 때문에 해독과정이 존재한다. 해독과정에서는 β-시아노알라닌 합성효소(β-cyanoalanine synthase)에 의해 시안화수소와 시스테인(L-cysteine)이 결합하여 황화수소(H2S)를 발생시키며, β-시아노알라닌(β-cyanoalanine)을 형성시킨다. 이후, 니트릴리아제(SbNIT4s)에 의해 암모니아(NH3)와 아스파르테이트(L-aspartate) 또는 아스파라긴(L-asparagine)으로 변환된다.
수수에서의 둘린 연구는 둘린의 생합성 및 분해에 관련된 유전자에 대한 연구가 주를 이루고 있다. 미국에서는 SCP(sorghum conversion program)를 통해 다양한 형질을 가진 수수 계통이 육성되어 이를 이용한 GWAS(genome-wide associated study) 연구도 활발하다. 계통에 따른 둘린의 함량과 연관성이 있는 SNP를 탐색한 예가 있으며, 이는 식물체에서 둘린 함량의 선별에 SNP 마커를 이용할 수 있는 가능성을 제시하였다. 수수는 재배화(domestication) 과정에서 시안화가스의 발생량이 적은 계통을 선별하였다. 그러나 시안화가스가 적게 발생하는, 달리 표현하면 둘린의 함량이 적은 계통을 육성하기 위해서는 전통적인 육종방법이 행해져야 한다. 그러나 전통적인 육종 방법은 작물을 유전적으로 고정시키고 계통을 육성시키는 기간이 대략 6년 이상 소요되고, 생산력을 검정하고 지역 적응시험을 거쳐 품종화하는 기간까지 합하면 총 10~20년이 소요된다. 또한, 여전히 수수에 다량으로 포함되어 있는 둘린으로 인해 종자를 제외한 수수 식물체 부위를 사료로 사용하기 위해서는 사일리지를 제작하는 것과 같은 전처리 과정이 필요하다. 뿐만 아니라, 둘린의 함량을 측정하기 위해서는 전처리 후 색도계(colorimeter) 또는 HPLC와 같은 분석 장비를 사용하여야 한다.
하지만 분자마커의 개념이 도입된 분자 육종에서는 선발의 효율성과 정확성으로 인해 육종 연한을 기존 육종에 비해 1/3 이상 단축할 수 있으며, 환경에 의한 영향도 없고, 조기에 정밀 검정을 통해 비용 절감의 이점이 있다. 분자마커는 시간 및 비용을 효율적으로 절약하고 신뢰할 수 있는 도구이다. 따라서 분자마커와 같은 육종기술의 이용은 단기간 내에 원하는 형질을 함유하는 품종을 육성할 수 있다. 분자마커의 효율적인 개발을 위해서는 유전체 정보를 필요로 한다. 2009년 수수의 표준유전체로서 Sorghum bicolor cv. BTx623의 전체 유전체 정보가 보고되었다. 총 732.2 Mb의 유전체 정보가 수수에서 해독되었으며 34,129개의 유전자 정보가 보고되어 분자마커를 개발하는데 있어 중요한 유전체자원으로 활용할 수 있게 되었다.
수수의 둘린 성분이 분해되어 발생하는 시안화수소를 해독시키는 과정에서 주요하게 작용하는 효소가 β-시아노알라닌 합성효소(β-cyanoalanine synthase) 단백질이다. 최근 연구에서 전사체 분석을 통해 β-시아노알라닌 합성 유전자의 발현 양상을 조사하였으나 종자 성숙에 국한되었으며, 둘린의 분해과정에서 발생하는 시안화수소의 해독과정과의 직접적인 연결점을 찾지 못하였다. 그러나 시안화수소의 해독과정에 관여하는 현재까지 알려진 유일한 단백질이며, β-시아노알라닌 합성 단백질에 대한 연구는 둘린과 같은 청산화합물 저감 수수 계통을 육성하는 데 중요한 정보를 제공할 것이다.
한편, 한국등록특허 제1492798호는 수수 종자의 혈당 강하 관련 펩티드 마커 및 이를 이용한 혈당 강하 수수종자 검정 방법을 개시하고 있으나, 본 발명의 수수 계통의 시안화수소 함량 판별용 분자마커 및 이의 용도에 대해 아직까지 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 수수의 이차대사물질 중 인체 및 가축에 부정적인 성분으로 보고된 둘린이 분해되어 발생하는 시안화수소의 해독과정에 관여하는 베타시아노알라닌 합성(β-cyanoalanine synthase) 유전자를 대상으로, 계통에 따른 베타시아노알라닌 합성유전자의 변이영역을 탐색한 결과, 수수 유전체에 대한 모델 계통인 소르검 비콜로르(S. bicolor)와 비교하여 야생 계통인 소르검 할레펜스(S. halepense)의 베타시아노알라닌 합성유전자의 염기서열 중 254번째 염기, 316번째 염기, 319번째 염기 및 321번째 염기에 위치한 Indel(insertion deletion polymorphism)과 347번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)로 인해 두 번째 엑손(exon) 부위에서 조기종결코돈(pre-mature stop codon)이 생성되어, 시안화수소 함량이 낮은 소르검 비콜로르(S. bicolor)와 시안화수소 함량이 높은 소르검 할레펜스(S. halepense) 계통을 판별할 수 있는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 베타시아노알라닌 합성유전자의 염기서열 중 254번째 염기, 316번째 염기, 319번째 염기 및 321번째 염기에 위치한 Indel(insertion deletion polymorphism)과 347번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 85개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 수수 계통의 시안화수소 함량을 판별하기 위한 분자마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는 프로브 및 마이크로어레이를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 수수 계통의 시안화수소 함량 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 역전사효소; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 수수 계통의 시안화수소 함량을 판별하기 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 수수에서 mRNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 mRNA를 주형으로 하여 cDNA를 합성한 후, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 수수 계통의 시안화수소 함량을 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명을 통해, 시안화수소 고함량 수수 계통을 효율적으로 판별하여 시안화수소 저함량 수수 계통을 육성할 수 있어 육종에 소요되는 시간, 비용 및 노력을 절감하는 데 매우 유용할 것으로 기대되며, 본 발명의 방법으로 육성한 베타시아노알라닌 합성유전자의 변이를 가진 품종의 판별을 통해 육성한 우량품종의 보급은 재배 농가 및 소비자에게도 고품질의 수수 생산 및 공급을 가능하게 할 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 구현 예에 따른 수수에서 모델 계통인 소르검 비콜로르(S. bicolor)와 비교하여 야생 계통인 소르검 할레펜스(S. halepense)의 베타시아노알라닌 합성유전자의 엑손 상의 Indel(254번째 염기, 316번째 염기, 319번째 염기 및 321번째 염기)과 SNP(347번째 염기)의 위치를 나타낸 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 베타시아노알라닌 합성유전자의 염기서열 중 254번째 염기, 316번째 염기, 319번째 염기 및 321번째 염기에 위치한 Indel(insertion deletion polymorphism)과 347번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 85개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 수수 계통의 시안화수소 함량을 판별하기 위한 분자마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예의 분자마커 조성물에서, 상기 연속된 뉴클레오티드는 85 내지 300개의 연속된 뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "뉴클레오티드"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이며, 특별하게 다르게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.
본 발명의 분자마커를 수수 계통의 시안화수소 함량 판별에 사용할 수 있는 것은 서열번호 1로 표시되는 소르검 비콜로르(S. bicolor)의 베타시아노알라닌합성 유전자의 염기서열 중 indel 변이 위치인 254번째, 316번째, 319번째 및 321번째 염기에 삽입 또는 결실이 있고, SNP 변이 위치인 347번째 염기가 G 또는 A로 다르게 나타나는 것에 근거한 것이다. 예를 들어, 서열번호 1의 염기서열 중 indel 변이 위치인 254번째인 G 염기가 ACGG 염기로 삽입되고, 316번째 및 317번째인 GC 염기가 C 염기로 결실되고, 319번째 및 320번째인 GC 염기가 C 염기로 결실되고, 321번째 내지 323번째인 AGC 염기가 C 염기로 결실되며, SNP 변이 위치인 347번째 염기에서 A/A 동형접합 유전자형을 갖는 계통은 시안화수소 함량이 높은 수수 계통으로 판단할 수 있으며, 서열번호 1의 염기서열 중 254번째 염기가 G이고, 316번째 및 317번째 염기가 G 및 C이고, 319번째 및 320번째 염기가 G 및 C이고, 321번째 내지 323번째 염기가 A, G 및 C이며, 347번째 염기에서 G/G 동형접합 유전자형을 갖는 계통은 시안화수소 함량이 낮은 수수 계통으로 판단할 수 있다.
본 발명에서 용어 “마커(marker)”는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고 점으로 사용되는 염기서열을 말한다. 이 용어는 또한 마커 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 세트로 사용되는 핵산과 같은 마커 서열에 상보적인 핵산 서열에도 적용된다. 분자마커(molecular marker)의 유전자지도상의 위치는 유전자좌(genetic locus)로 일컬어진다.
본 발명에서 용어 "SNP(single nucleotide polymorphism)"는 단일 염기에서의 다형성(polymorphism)을 의미한다. 즉, 어느 집단에 있어 전체 게놈에 있는 일부 염기가 염색체마다 다른 경우가 존재하는 것을 말하며, 통상적으로 SNP는 300 내지 1000개의 염기에 하나 정도 존재하는 것으로 알려져 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 용어 SNP 위치에서의 "동형접합 유전자형(homozygotic genotype)" 이란 SNP 변이 위치에 해당하는 상동 염색체(homologous chromosome) 상의 대립형 염기(allelic base)가 서로 동일한 염기인 경우를 의미하며, SNP 변이 위치에서의 "이형접합 유전자형(heterozygotic genotype)" 란 SNP 변이 위치에 해당하는 상동 염색체상의 대립형 염기가 서로 다른 염기인 경우를 의미한다.
본 발명에서 용어 “인델(InDel)”은 DNA의 염기배열에서 일부 염기가 중간에 삽입되거나(insertion) 결실된(deletion) 변이를 총칭한다. 상기 인델(InDel) 마커는 표준유전체와 실험에 사용된 품종의 유전체 정보를 비교분석하는 방법을 통해 표준유전체보다 삽입(insertion) 또는 결실(deletion)된 영역을 탐색하고 그 정보를 바탕으로 프라이머를 제작한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 베타시아노알라닌 합성유전자의 염기서열 중 254번째 염기, 316번째 염기, 319번째 염기 및 321번째 염기에 위치한 Indel(insertion deletion polymorphism)과 347번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 85개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 수수 계통의 시안화수소 함량 판별용 프라이머 세트를 제공한다. 상기 프라이머 세트는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로 구성되며, 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 중 어느 하나의 프라이머가 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 예를 들면 정방향 프라이머가 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우에는 역방향 프라이머는 도 1에 기재된 역방향 프라이머를 이용할 수 있다. 즉, 역방향 프라이머는 원하는 PCR 산물이 적당한 크기로 증폭될 수 있는 것이면 특별이 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 베타시아노알라닌 합성유전자의 염기서열 중 254번째 염기, 316번째 염기, 319번째 염기 및 321번째 염기에 위치한 Indel(insertion deletion polymorphism)과 347번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 85개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 수수 계통의 시안화수소 함량 판별용 프로브를 제공한다.
바람직하게는, 서열번호 1의 염기서열 중 indel 위치인 254번째인 G가 ACGG로 삽입(insertion)되고, 316번째 및 317번째인 GC가 C로 결실(deletion)되고, 319번째 및 320번째인 GC가 C로 결실되고, 321번째 내지 323번째인 AGC가 C로 결실되며, SNP 위치인 347번째 염기가 A인 폴리뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는 수수 계통의 시안화수소 함량 판별용 프로브를 제공한다. 상기 프로브를 이용하면 시안화수소 함량이 대조구 수수 계통보다 높은 수수 계통을 판단할 수 있다.
본 발명에서 용어 "프로브"는 혼성화 프로브로서, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 자연적인 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로 부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 바람직하게는 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일 가닥, 더 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 베타시아노알라닌 합성유전자의 염기서열 중 254번째 염기, 316번째 염기, 319번째 염기 및 321번째 염기에 위치한 Indel(insertion deletion polymorphism)과 347번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 85개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 수수 계통의 시안화수소 함량 판별용 마이크로어레이를 제공한다.
바람직하게는, 서열번호 1의 염기서열 중 indel 위치인 254번째인 G가 ACGG로 삽입(insertion)되고, 316번째 및 317번째인 GC가 C로 결실(deletion)되고, 319번째 및 320번째인 GC가 C로 결실되고, 321번째 내지 323번째인 AGC가 C로 결실되며, SNP 위치인 347번째 염기가 A인 폴리뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는 수수 계통의 시안화수소 함량 판별용 마이크로어레이를 제공한다. 상기 마이크로어레이를 이용하면 시안화수소 함량이 대조구 수수 계통보다 높은 수수 계통을 판단할 수 있다.
본 발명에서 수수 계통의 시안화수소 함량 판별용 마이크로어레이는 본 발명의 분자마커가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이를 의미한다. "마이크로어레이"란 기판 상에 올리고뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 올리고뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함된다.
용어 "기판"은 혼성화 특성을 보유하고, 혼성화의 배경 수준이 낮게 유지되는 조건 하에 마커가 부착될 수 있는 임의의 기판을 말한다. 통상적으로, 상기 기판은 미세역가(microtiter) 플레이트, 막(예를 들면, 나일론 또는 니트로셀룰로오스), 미세구(비드) 또는 칩일 수 있다. 막에 적용하거나 고정하기 전에, 핵산 프로브를 변형시켜 고정화를 촉진시키거나 혼성화 효율을 개선시킬 수 있다. 상기 변형은 단독중합체 테일링(homopolymer tailing), 지방족기, NH2기, SH기 및 카르복실기와 같은 상이한 반응성 작용기와의 커플링, 또는 비오틴, 합텐(hapten) 또는 단백질과의 커플링을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 역전사효소; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 수수 계통의 시안화수소 함량을 판별하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 dNTPs는 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하며, DNA 폴리머라제는 내열성 DNA 중합효소로서 Taq DNA 폴리머라제, Tth DNA 폴리머라제 등 시판되는 폴리머라제를 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다. 또한, 본 발명에 있어서, 프로고이트린 저함량 양배추를 선별하기 위한 키트는 상기 프로브 또는 상기 마이크로어레이가 포함된 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 수수에서 mRNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 mRNA를 주형으로 하여 cDNA를 합성한 후, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 수수 계통의 시안화수소 함량을 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 수수에서 mRNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 mRNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다. 상기 분리된 mRNA를 주형으로 하여 cDNA를 합성한 후, 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR 이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현 예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭 시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭산물이 합성되면서 방사성이 증폭산물에 혼입되어 증폭산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 가장 바람직하게는, 은염색 키트(Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 가시화될 수 있다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있다. 증폭산물을 검출하는 방법 중의 하나로서,모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 증폭 단계의 산물은 서열번호 1의 염기서열 중 254번째인 G 염기가 ACGG 염기로 삽입되고, 316번째 및 317번째인 GC 염기가 C 염기로 결실되고, 319번째 및 320번째인 GC 염기가 C 염기로 결실되고, 321번째 내지 323번째인 AGC 염기가 C 염기로 결실되며, SNP 위치인 347번째 염기에서 G 대신에 A 염기를 가지는 경우에는 시안화수소 함량이 대조구 수수 계통보다 높은 것으로 판단할 수 있다. 상기 대조구는 시안화수소 함량이 낮은 수수 계통인 소르검 비콜로르(Sorghum bicolor)인 것을 특징으로 한다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1. 수수의 RNA 추출 및 RNA 시퀀싱
수수 유전체에 대한 모델 계통인 소르검 비콜로르 BTx623(Sorghum bicolor BTx623)과 야생종인 소르검 할레펜스(S. halepense)를 수집하여 생장상(growth chamber)에서 25℃ 및 14시간의 주광(daylight)의 조건으로 생육시켰으며, 생장 후, 26일 시점에 각 계통에 대해 식물 유래의 상층부(shoot)를 수확하였다. -70℃에서 동결 보존한 수수 상층부를 막자사발에 넣고 해사(sea sand)를 첨가하여 즉시 50㎖의 액체질소로 냉각하면서 분말 상태로 분쇄하였다. 수수의 RNA 추출을 위해, 100mg의 시료 분말을 1㎖의 RNAiso 플러스(Takara, 일본) RNA 추출 용액이 담긴 2㎖의 원심분리 튜브에 넣고 볼텍싱(vortexing) 하였으며, 상온에서 5분간 방치 후 BCP(1-bromo-3-chloropropane) 용액 100㎕를 첨가한 후 15초간 볼텍싱하였다. 상온에서 5분간 방치 후 12,000g 및 4℃에서 15분 정도 원심분리하여 500㎕의 상층액을 새 튜브에 옮긴 뒤 500㎕의 이소프로판올(Isopropanol)을 첨가하였다. 20여 차례 손으로 뒤집어 주면서 잘 섞은 뒤 12,000g 및 4℃에서 10분 정도 원심분리한 후, 침전된 RNA 펠릿(pellet)를 그대로 둔 채 상등액을 모두 버리고 75% 에틸 알코올(ethyl ethanol) 1㎖을 첨가하여 펠릿이 떨어질 때까지 볼텍싱한 후 12,000g 및 4℃에서 5분 정도 원심분리하였다. 상등액을 모두 제거한 뒤 펠릿을 대기중에 3분간 건조시켰으며, RNA 펠릿에 RNase가 오염되지 않은 증류수를 첨가하였다. 추출한 RNA는 100bp DNA 래더(ladder)와 함께 1% 아가로오스 겔에서 확인하였다.
이후 RNA 시퀀싱 분석을 위해, 추출된 두 계통의 RNA를 대상으로 cDNA 라이브러리를 제작하고 일루미나사(Illumina, USA)의 HiSeq2500 염기서열 해독기에서 표준 프로토콜(protocol)에 따라 두 계통의 RNA 염기서열을 해독하였으며, 생산된 101bp의 단편서열(read)을 생물정보분석에 사용하였다. 생물정보분석을 위한 레퍼런스 게놈으로는 파이토좀(http://www.phytozome.net)의 소르검 비콜로르(S. bicolor) ver. 3.1.1 레퍼런스 게놈(Goodstein et al., 2012, Nucleic Acids Res., 40, 1178~1186)을 사용하여 BWA 알고리즘(Li and Durbin, 2009)으로 분석하였다.
실시예 2. 변이영역 탐색
염기서열과 유전자형은 Two-pass STAR(Dobin et al., 2013, Bioinformatics, 29, 15-21), picard ver. 2.10.10(http://picard.sourceforge.net) 및 GATK ver. 3.8-0(McKenna et al., 2010, Genome Res., 20(9), 1297~1303) 프로그램을 사용하여 분석하였다. 어노테이션(annotation)은 SnpEff 프로그램(Cingolani et al., 2012, Fly(Austin)., 6(2), 80~92)을 사용하였다. 수수 유전체에 대한 모델 계통인 BTx623(Sorghum bicolor)을 기준으로 하여 야생 계통인 소르검 할레펜스(S. halepense)의 mRNA 염기서열 중에 표준 유전체의 유전체 정보와 차이가 나타나는 유전자 변이를 탐색하였고, 이때 예측된 결과에서 높은 임팩트(high impact)로 분류된 변이를 본 발명에서는 단일염기다형(SNP) 및 삽입결실다형(Indel) 변이로 규정하였다.
SNP 및 Indel 변이에 대한 분석은 둘린의 생합성 및 분해경로에 상에서 기능하는 것으로 알려진 12개 유전자(CYP79A1, CYP71E1, UGT85B1, Dhurrinase1, Dhurrinase2, Dhurrinase3, Dhurrinase4, alpha- Hydroxynitrile lyase, NIT4A, NIT4B1, NIT4B2 및 beta- cyanoalanine synthase)를 대상으로 수행하였으며, 이 중에 소르검 할레펜스(S. halepense)의 RNA 염기서열 내에서 베타시아노알라닌 합성효소(beta-cyanoalanine synthase) 유전자의 염기서열 중 254번째 염기, 316번째 염기, 319번째 염기 및 321번째 염기에 위치한 Indel(insertion deletion polymorphism)과 347번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)가 탐색되었으며, 본 발명에서는 베타시아노알라닌 합성유전자를 두 계통 간의 주요한 변이가 나타나는 유전자로 규정하였다(도 1).
<110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> Molecular marker for discriminating hydrogen cyanide content of sorghum line and uses thereof <130> PN17392 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 553 <212> DNA <213> Sorghum bicolor <400> 1 aacacactgg tgtggtgagt ggtgagtggc ccgcctgtcg agtctcctct cctcttccgt 60 cctccaccac ccaccaatca tcatcaccac caaagctgag ctgagctgag ctctcctgag 120 tccctcacta ctagctaagc taagctaagc taagctagta gctcgaatgg agaggatgct 180 ggcaaggctg atgcggcggc ggagctcctc ccccctgtcc gacctcctcc accatggagg 240 agcagcagcg gcgggctcgc tgcaggccgc cgccggcgcc actgcggcct ccccctggct 300 cttctcccac caccagcagc agcagcagca gcacacggcg gccgccgcgc tgccgggtct 360 caagatcagg gactccgcgt cccagctgat tgggaggaca ccgatggtgt acctgaacaa 420 ggtgacggag ggatgcggcg cccggatcgc tgccaagctc gagttcctgc agccttcctt 480 cagcgtcaaa gacagaccag caatttcaat gttggaagat gctgaaaaga ggggactgat 540 cactccagga aag 553

Claims (9)

  1. 서열번호 1의 베타시아노알라닌 합성유전자의 염기서열 중 254번째 염기, 316번째 염기, 319번째 염기 및 321번째 염기에 위치한 Indel(insertion deletion polymorphism)과 347번째 염기에 위치하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 85개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 소르검 비콜로르(Sorghum bicolor) 및 소르검 할레펜스(S. halepense) 수수 계통의 시안화수소 함량을 판별하기 위한 분자마커 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 분자마커는 서열번호 1의 염기서열 중 indel 위치인 254번째인 G가 ACGG로 삽입(insertion)되고, 316번째 및 317번째인 GC가 C로 결실(deletion)되고, 319번째 및 320번째인 GC가 C로 결실되고, 321번째 내지 323번째인 AGC가 C로 결실되며, SNP 위치인 347번째 염기가 A로 이루어진 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 분자마커 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 소르검 비콜로르(Sorghum bicolor) 및 소르검 할레펜스(S. halepense) 수수 계통의 시안화수소 함량 판별용 프라이머 세트.
  4. 제1항 또는 제2항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는 소르검 비콜로르(Sorghum bicolor) 및 소르검 할레펜스(S. halepense) 수수 계통의 시안화수소 함량 판별용 프로브.
  5. 제1항 또는 제2항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는 소르검 비콜로르(Sorghum bicolor) 및 소르검 할레펜스(S. halepense) 수수 계통의 시안화수소 함량 판별용 마이크로어레이
  6. 제3항의 프라이머 세트; 역전사효소; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 소르검 비콜로르(Sorghum bicolor) 및 소르검 할레펜스(S. halepense) 수수 계통의 시안화수소 함량을 판별하기 위한 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 소르검 비콜로르(Sorghum bicolor) 및 소르검 할레펜스(S. halepense) 수수 계통의 시안화수소 함량을 판별하기 위한 키트.
  8. 수수에서 mRNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 mRNA를 주형으로 하여 cDNA를 합성한 후, 제3항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 소르검 비콜로르(Sorghum bicolor) 및 소르검 할레펜스(S. halepense) 수수 계통의 시안화수소 함량을 판별하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물은 서열번호 1의 염기서열 중 indel 위치인 254번째인 G가 ACGG로 삽입(insertion)되고, 316번째 및 317번째인 GC가 C로 결실(deletion)되고, 319번째 및 320번째인 GC가 C로 결실되고, 321번째 내지 323번째인 AGC가 C로 결실되며, SNP 위치인 347번째 염기가 A인 경우, 시안화수소 함량이 대조구 수수 계통보다 높은 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 소르검 비콜로르(Sorghum bicolor) 및 소르검 할레펜스(S. halepense) 수수 계통의 시안화수소 함량을 판별하는 방법.
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