KR101987278B1

KR101987278B1 - 글루코브라시신 고함량 양배추 판별용 snp 마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101987278B1
Application number: KR1020180106299A
Authority: KR
Inventors: 김혜란; 이정여; 노영희
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2018-09-06
Filing date: 2018-09-06
Publication date: 2019-09-30

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 양배추 FMOGS - OX5 유전자의 염기서열 중 3,015번째 및 3,030번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

글루코브라시신 고함량 양배추 판별용 SNP 마커 및 이의 용도{Single nucleotide polymorphism marker for discriminating cabbage of high content of glucobrassicin and uses thereof}

본 발명은 글루코브라시신 고함량 양배추 판별용 SNP 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

양배추류(Brassica oleracea)는 양배추(cabbage), 브로콜리(broccoli), 케일(kale), 콜라비(kohlrabi), 콜리플라워(cauliflower), 방울양배추(brussels sprouts) 등의 다양한 경제적 작물들을 포함하고 있다. 양배추의 경우 전세계적으로 식용되고 있는 작물로써 시장규모가 월등히 크며, 재배면적 기준으로 세계 4대 채소에 들어갈 만큼 많이 소비되고 있다. 양배추에는 항암작용에 효과가 있는 것으로 알려진 글루코시놀레이트(glucosinolate)가 함유되어 있는데, 글루코시놀레이트는 아미노산과 당으로부터 만들어지는 황을 함유하는 이차 대사 산물로 가수분해에 의해 배추과 작물의 특정한 향과 맛을 내는데 기여하는 물질이다. 지금까지 공통적인 구조를 가진 100개 이상의 글루코시놀레이트 성분이 자연상태에 존재하며, 현재 식용으로 이용되는 양배추 식물에는 글루코브라시신(glucobrassicin), 네오글루코브라시신(neoglucobrassicin), 4-히드록시글루코브라시신(4-hydroxyglucobrassicin), 4-메톡시글루코브라시신(4-methoxyglucobrassicin), 시니그린(sinigrin), 글루코나핀(gluconapin), 글루코브라시카나핀(glucobrassicanapin), 프로고이트린(progoitrin), 글루코베르베린(glucoiberverin), 글루코에루신(glucoerucin), 글루코라파사틴(glucoraphasatin), 글루코이베린(glucoiberin), 글루코라파닌(glucoraphanin), 글루코라페닌(glucoraphenin), 글루코알리신(glucoalyssin), 글루코나스투르티인(gluconasturtiin)의 총 16가지 글루코시놀레이트 성분이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 이외에도 양배추에는 비타민(U, A, B1, B2, C), 미네랄(칼슘, 칼륨, 마그네슘 등), 엽산 및 플라보놀(flavonol), 류코안토시아닌(leucoanthocyanin), 클로로겐(chlorogen) 등의 페놀류를 상당량 함유하고 있으며 항체, 효소 및 호르몬을 생성하는데 필요한 필수 아미노산의 일종인 라이신(lysine)도 함유하고 있어 영양가치가 높다.

지금까지 밝혀진 대부분의 글루코시놀레이트 성분들은 인간에게 이로운 기능성 물질로 인식되어 왔으며, 특정 글루코시놀레이트 성분을 증가시키거나 해로운 글루코시놀레이트 성분을 감소시킨 품종을 개발하기 위한 연구가 지속적으로 수행되어 왔다. 브로콜리의 야생종인 브라시카 빌로사(Brassica villosa)의 높은 글루코라파닌(glucoraphanin) 함량 형질을 도입하기 위해 전통적인 육종방법으로 약 20년에 걸쳐 글루코라파닌 함량이 기존 브로콜리보다 3배 많이 함유된 품종이 개발되었고, 해로운 물질로 알려진 프로고이트린 함량이 종자에서 감소된 유채가 장기간에 걸쳐 개발되었다. 하지만, 전통적인 육종 방법은 작물을 유전적으로 고정시키고 계통을 육성시키는 기간이 대략 6년 이상 소요되고, 생산력을 검정하고 지역 적응시험을 거쳐 품종화하는 기간까지 합하면 총 10~20년을 필요로 한다.

하지만 분자마커 개념이 도입된 분자 육종은 선발의 효율성과 정확성으로 인해 육종 연한을 기존 육종에 비해 1/3 이상 단축할 수 있고 환경에 의한 영향도 없으며, 조기에 정밀 검정을 통해 비용을 절감시킬 수 있는 이점이 있다. 분자마커는 신뢰할 수 있고 시간 및 비용을 효율적으로 절약할 수 있으므로, 농업경제학에서 부작용없이 육종 능력과 작물의 품질 및 특성을 향상시키기 위한 도구로 사용되고 있다.

따라서 분자마커와 같은 육종기술을 육종도구로 이용하면, 단기간에 좋은 품질을 생산할 수 있을 뿐만 아니라 한 품종이 여러 가지 우수한 형질을 함유할 수 있도록 육성할 수 있기 때문에 고부가가치 품종을 개발할 수 있다.

분자마커의 효율적인 개발을 위해서는 유전체 정보를 필요로 한다. 최근 양배추류의 표준유전체로서 꽃양배추(Brassica oleracea var. acephala, TO1000)와 양배추(Brassica oleracea var. capitata)의 전체 유전체 정보가 보고되었다. 총 447Mb와 385Mb의 유전체 정보가 각각 TO1000와 양배추에서 해독이 되었으며 59,225개 또는 45,458개의 유전자 정보가 보고되어 분자마커를 개발하는데 있어 중요한 유전체자원으로 활용할 수 있게 되었다.

양배추의 글루코브라시신은 가수분해되어 인돌 화합물(indole-3-carbinol)을 생성하고, 인돌 화합물은 대사과정에서 여성 호르몬이 암 유발물질로 변환되는 것을 억제하는 역할을 한다고 알려져 있다. 이에 본 발명에서는 인간에게 유용한 기능성 성분인 글루코브라시신의 함량이 높은 양배추 개발을 효율적으로 하기 위해 글루코브라시신 함량 관련 분자마커를 개발하였다.

한편, 한국등록특허 제1448074호에는 '석회결핍 둔감형 양배추 품종의 조기 선별을 위한 바이오 마커 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1464247호에는 '양배추 시들음병 저항성 또는 감수성 품종 선별용 SNP 마커 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 글루코브라시신 고함량 양배추 판별용 SNP 마커 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 글루코브라시신 함량이 높은 양배추 그룹과 낮은 그룹의 유전체를 분석하여 FMOGS -OX5(Flavin-containing monooxygenase FMO GS-OX5) 유전자 부위에서 SNP(single nucleotide polymorphism) 분자마커를 발굴하였고, 상기 SNP 마커를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 양배추 시료의 유전형을 분석한 결과, 본 발명의 SNP 마커 및 이의 프라이머 세트가 글루코브라시신 고함량 양배추와 저함량 양배추를 효과적으로 판별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 양배추 FMOGS - OX5 유전자의 염기서열 중 3,015번째 및 3,030번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 구성되는 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 글루코브라시신(glucobrassicin) 고함량 양배추를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물, HRM 프라이머 세트, 프로브 및 마이크로어레이를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 HRM 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 글루코브라시신 고함량 양배추 조기 판별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 HRM 프라이머 세트를 이용하여 글루코브라시신 고함량 양배추를 조기에 판별하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명의 SNP 분자마커는 글루코브라시신의 함량이 높은 양배추를 조기에 효율적으로 판별할 수 있어 육종에 소요되는 시간, 비용 및 노력을 절감할 수 있으며, 재배 농가 및 소비자에게도 고품질의 양배추 생산 및 공급을 가능하게 할 것으로 기대된다.

도 1은 양배추 FMOGS - OX5 유전자 내의 SNP 위치(a)와 SNP 마커 선발 과정(b)을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명에서 개발한 2개의 SNP 분자마커(FMOGS_OX5_TB2 및 FMOGS_OX5_YN_TB89)의 HRM(high resolution melting) 분석결과이다. AA 및 TT; 글루코브라시신 저함량 양배추, GG 및 CC; 글루코브라시신 고함량 양배추.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 양배추 FMOGS-OX5(Flavin-containing monooxygenase FMO GS-OX5) 유전자의 염기서열 중 3,015번째 및 3,030번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 구성되는 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 글루코브라시신(glucobrassicin) 고함량 양배추를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 글루코브라시신 고함량 양배추는 1.07~45 μmol/g 건조중량의 글루코브라시신을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오티드는 8 내지 100개의 연속된 뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "뉴클레오티드"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이며, 특별하게 다르게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.

본 발명의 SNP 마커를 양배추의 글루코브라시신 함량 판별에 사용할 수 있는 것은 양배추의 FMOGS - OX5 유전자인 서열번호 1로 표시되는 염기서열 중 SNP 변이 위치인 3,015번째가 A 또는 G; 및 3,030번째가 T 또는 C로 다르게 나타나는 것에 근거한 것이다. 예를 들어, 서열번호 1의 3,015번째 뉴클레오티드에 해당하는 SNP는 A 또는 G; 및 3,030번째 뉴클레오티드에 해당하는 SNP는 T 또는 C로 염기다형성을 나타내는데, 이 SNP에서 AA 또는 TT 동형접합 유전자형을 갖는 양배추는 글루코브라시신 함량이 낮은 양배추이고, GG 또는 CC 동형접합 유전자형을 갖는 양배추는 글루코브라시신 함량이 높은 양배추로 판단할 수 있다.

한편, 본 발명에서 사용된 용어 SNP 위치에서의 "동형접합 유전자형(homozygotic genotype)"이란 SNP 변이 위치에 해당하는 상동 염색체(homologous chromosome) 상의 대립형 염기(allelic base)가 서로 동일한 염기인 경우를 의미한다.

본 발명은 상기 서열번호 1의 염기서열에서 SNP 위치의 염기 변이체에 관한 것이나, 이러한 SNP 염기 변이가 이중 가닥의 gDNA(게놈 DNA)에서 발견되는 경우, 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 따라서 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열에서 SNP 위치의 염기도 상보적인 염기가 된다. 이러한 측면에서, 본 명세서에 제시된 모든 서열은, 특별한 언급이 없는 한, 게놈 DNA의 센스 가닥에 있는 서열을 기준으로 한 것이다.

본 발명은 또한, 서열번호 1의 양배추 FMOGS - OX5 유전자의 염기서열 중 3,015번째 또는 3,030번째 염기에 위치한 SNP를 증폭하기 위한, 글루코브라시신 고함량 양배추 판별용 HRM 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명에서 용어 "HRM(high resolution melting)"은 핵산 서열에서의 변이를 확인하기 위해 사용된 상대적으로 새로운 포스트 PCR 분석 방법이다. 이 방법은 PCR 해리곡선에서 작은 차이를 감지하는 것을 기초로 하며, PCR 후 해리곡선의 패턴 분석을 통해 유전형을 분석하는 기술이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 HRM 프라이머 세트는 서열번호 2 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 또는 서열번호 4 및 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 서열번호 2 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 1로 표시되는 염기서열 중 3,015번째 SNP 변이 위치를 확인할 수 있는 프라이머 세트이고, 서열번호 4 및 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 1로 표시되는 염기서열 중 3,030번째 SNP 변이 위치를 확인할 수 있는 프라이머 세트이다.

본 발명의 프라이머 세트는 바람직하게는 상기 2개의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 프라이머 세트를 포함하며, 2개의 프라이머 세트, 즉, 서열번호 2 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 4 및 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 모두 포함할 수 있다. 2개의 프라이머 세트를 동시에 이용하면 글루코브라시신 고함량 양배추를 더욱 효율적으로 구별할 수 있다.

상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 2, 3, 4 및 5의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 2의 프라이머(20개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 2, 3, 4 및 5의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다. 또한, 상기 서열번호 중 짝수번호의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 정방향 프라이머이며, 짝수 번호의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 역방향 프라이머이다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, HRP(horse radish peroxidase), 알칼리 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, ³²P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 비오틴(biotin)) 등이 있다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30bp의 길이로 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.

본 발명은 또한, 상기 HRM 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 글루코브라시신 고함량 양배추 조기 판별용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 키트는 증폭된 산물을 분석하기 위해 HRM(High resolution meling) 분석 또는 염기서열 결정에 필요한 시약을 추가로 포함할 수 있다. 상기 dNTPs는 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하며, DNA 폴리머라제는 내열성 DNA 중합효소로서 Taq DNA 폴리머라제, T4 DNA 폴리머라제 등 시판되는 폴리머라제를 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다. 또한, 본 발명에 있어서, 글루코브라시신 고함량 양배추를 판별하기 위한 키트는 하기 프로브 또는 하기 마이크로어레이가 포함된 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

양배추 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 HRM 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 단계의 산물을 HRM(high resolution melting) 분석을 통해 유전자형을 분석하는 단계를 포함하는, 글루코브라시신 고함량 양배추를 조기에 판별하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 양배추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega, 미국)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 SNP 변이 염기 증폭용 HRM 프라이머를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명은 또한, 서열번호 1의 양배추 FMOGS - OX5 유전자의 염기서열 중 3,015번째 및 3,030번째 염기에 위치한 SNP로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 구성되는 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 글루코브라시신 고함량 양배추를 판별하기 위한 프로브 및 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명에서 용어 "프로브"는 혼성화 프로브로서, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 자연적인 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 바람직하게는 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일 가닥, 더 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어 "혼성화(hybridization)"는 상보적인 단일 가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 완전히 매칭되거나 일부 미스매치로 실질적으로 매칭되는 2개의 핵산 가닥 사이에서 일어날 수 있다. 혼성화를 위한 상보성은 혼성화 조건, 특히 온도에 따라 달라질 수 있다.

본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 프로브는 SNP 뉴클레오티드인 서열번호 1의 3,015번째 및 3,030번째 위치의 뉴클레오티드를 포함하는 8 내지 100 개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함한다. 더 바람직하게는, 상기 프로브의 3'-말단 또는 5'-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3'-말단 또는 5'-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다. 혼성화에 적합한 조건은 당업계에 통상적으로 알려진 내용을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 대립형질 중 하나에만 혼성화하도록 충분히 엄격해야 하며, 온도, 이온 세기(완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.

본 발명에서 글루코브라시신 고함량 양배추를 판별하기 위한 마이크로어레이는 본 발명의 SNP 마커가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이를 의미한다. "마이크로어레이"란 기판상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함된다.

용어 "기판"은 혼성화 특성을 보유하고, 혼성화의 배경 수준이 낮게 유지되는 조건 하에 마커가 부착될 수 있는 임의의 기판을 말한다. 통상적으로, 상기 기판은 미세역가(microtiter) 플레이트, 막(예를 들면, 나일론 또는 니트로셀룰로오스), 미세구(비드) 또는 칩일 수 있다. 막에 적용하거나 고정하기 전에, 핵산 프로브를 변형시켜 고정화를 촉진시키거나 혼성화 효율을 개선시킬 수 있다. 상기 변형은 단독중합체 테일링(homopolymer tailing), 지방족기, NH₂기, SH기 및 카르복실기와 같은 상이한 반응성 작용기와의 커플링, 또는 비오틴, 합텐(hapten) 또는 단백질과의 커플링을 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. TBDH 집단의 글루코브라시신(glucobrassicin) 성분 분석

양배추류국제표준집단(TBDH) 118 계통의 종자를 0.5X MS 배지에 파종하여 약 20일 정도 자란 유묘기 샘플을 수확하여 동결건조하였고, 각 샘플의 동결건조 분말을 100 mg씩 사용하여 글루코브라시신을 추출하였다. 글루코브라시신은 메탄올을 사용하여 추출한 후 HPLC로 분석하였으며, 0.1 mg/㎖ 시니그린(sinigrin)을 표준시료로 사용하여 정량에 사용하였다.

2. 글루코브라시신 함량이 높은 계통 및 낮은 계통 dptj 글루코시놀레이트 생합성 관련 유전자의 SNP 분석

글로코시놀레이트 성분 분석 결과를 통해 글루코브라시신 함량이 높거나 낮은 계통의 TBDH를 선별하고, 글루코시놀레이트 생합성 관련 유전자의 SNP를 비교분석하였다.

3. 글루코브라시신 함량 관련 SNP ( single nucleotide polymorphism ) 발굴 및 검증

상기 글루코시놀레이트 생합성 관련 유전자의 SNP 분석 결과로부터 글루코브라시신 함량과 관련된 SNP 마커 후보 33개를 선발하였고, 선별된 SNP를 HRM 기반 유전형분석(genotyping)을 할 수 있는 프라이머 세트를 제작하였다. 제작된 프라이머 세트를 검증하기 위해, 종묘회사에서 육종소재로 사용되고 있는 양배추 계통 및 양배추 217개체(코레곤종묘 집단 1(#1626); 92개체, 코레곤종묘 집단 2(#1627); 92개체 및 아시아종묘; 33개체)의 유전형 분석 및 글루코브라시신 함량 분석을 수행하여 최종적으로 SNP 마커 2개를 선발하였다.

PCR 반응은 총 반응혼합물 양을 10 ㎕로 하였고, 0.4 μM 프라이머, 250 μM dNTP, 0.1 unit Taq 중합효소와 주형 DNA 10 ng 및 0.5x LCgreen을 혼합하였다. 증폭을 위한 조건으로 사이클을 시작하기 전 시료를 94℃에서 5분간 전변성(pre-denaturation)하였고, 94℃에서 45초, 각 프라이머의 적정 결합(annealing) 온도에서 45초, 72℃에서 45초간 합성을 1 사이클로 하여 총 40 사이클을 수행하였고, 40 사이클 증폭 후에는 완전한 DNA 확장(extension)을 위해 72℃에서 7분간 최종신장(final elongation)을 수행하였다. 증폭 단편의 다형성은 LightScanner(Idaho Technology Inc. 미국)를 이용하여 분석하였다.

실시예 1. TBDH 집단의 글루코브라시신 성분 분석

TBDH 집단 118 계통의 글루코시놀레이트를 추출하여 HPLC 분석한 결과, 평균 글루코브라시신 함량이 2.286 μmol/g dry wt로 확인되었다(표 1 내지 3). TBDH 집단의 계통 간 글루코브라시신 평균차이를 검정하기 위해서 ANOVA test를 수행하였으며, 사후 검정으로는 Duncan' test를 이용하였고, 통계의 유의 수준은 P<0.05로 하였다.

TBDH 집단의 모본(TO1000)와 부본(Early big)을 포함하여 글루코브라시신의 함량이 높은 계통 TBDH220, TBDH195와 글루코브라시신의 함량이 낮은 계통 TBDH342, TBDH187을 선발하여 글루코시놀레이트 생합성 관련 유전자의 SNP 분석을 차세대염기서열분석법을 이용하여 수행하였다(표 4).

실시예 2. SNP 마커의 선별 및 선별된 SNP 마커의 검증

글루코브라시신 함량 관련 분자마커를 발굴하기 위해 차세대염기서열분석법을 이용하여 상기 글루코브라시신 함량이 높거나 낮은 TBDH 계통을 선발한 후 글루코시놀레이트 생합성 관련 유전자의 서열을 분석하여 글루코브라시신 함량과 연관된 유전자 상에서 SNP 마커를 발굴하였고, HRM validaion을 수행하여 후보 SNP 마커 33개를 선발하였다. 글루코시놀레이트 합성에 관여하는 유전자는 기존에 보고되었던 논문들을 기준으로 36개를 선별하였다. TBDH 집단의 모본(TO1000), 부본(Early big)을 포함하여 글루코브라시신 함량이 높은 그룹(TBDH220, TBDH195) 2개 계통과 글루코브라시신 함량이 낮은 그룹(TBDH342, TBDH187) 2개 계통에서 글루코시놀레이트 생합성 관련 유전자의 서열을 획득한 후 SNP를 분석하였다. 그 결과, 글루코시놀레이트 생합성 관련 유전자 36개 중 글루코브라시신 함량에 따라 구별되는 SNP를 보이는 유전자는 FMOGS - OX5 , BCAT4, IQD1 -1, MAM1 , MYB122 및 ST5c이었고, 후보 SNP 마커는 FMOGS - OX5 13개, BCAT4 5개, IQD1 -1 2개, MAM1 1개, MYB122 4개 및 ST5c 8개로 총 33개였다.

상기 선발된 33개의 SNP 마커를 검증하기 위해 각각의 SNP 위치 염기를 확인할 수 있는 HRM 프라이머 세트를 제작하고, TBDH 118개체, 코레곤종묘 집단1 92개체, 코레곤종묘 집단2 92개체 및 아시아종묘 33개체의 유전자원 샘플에서 유전형 분석과 글루코브라시신 함량 분석을 수행하였다.

그 결과, FMOGS - OX5 유전자(서열번호 1)의 염기서열 중 3,015번째 또는 3,030번째에서 AA 또는 TT의 유전형이 확인된 양배추는 글루코브라시신의 함량이 낮은 것으로 확인되었고(0.08~1.06 umol/g dry wt.), FMOGS - OX5 유전자의 염기서열 중 3,015번째 또는 3,030번째에서 GG 또는 CC의 유전형이 확인된 양배추에서는 글루코브라시신의 함량이 높은 것으로 확인되어(1.07~40.9 umol/g dry wt.), FMOGS - OX5 유전자(서열번호 1) 상에 위치하는 SNP 마커 및 이를 증폭하는 HRM 프라이머 세트를 이용하면, 글루코브라시신 고함량 또는 저함량의 양배추를 조기에 판별할 수 있을 것으로 사료되었다(도 2).

글루코브라시신 함량 관련 FMOGS - OX5의 SNP 마커를 위한 HRM용 프라이머 정보

프라이머 명칭	서열정보(5'→3')
FMOGS_OX5_TB2	F: CGCGTCTTTCATATCCGTAAT (서열번호 2)
FMOGS_OX5_TB2	R: GCAAGTAAACTCCGCTAAGG (서열번호 3)
FMOGS_OX5_YN_TB9	F: CTCCTTCACGATATCGCCGT (서열번호 4)
FMOGS_OX5_YN_TB9	R: ACTCCGCTAAGGTTAACGAACT (서열번호 5)

FMOGS_OX5_TB2; FMOGS - OX5 유전자의 염기서열 중 3,015번째 SNP 증폭용 프라이머 세트.

FMOGS_OX5_YN_TB9; FMOGS - OX5 유전자의 염기서열 중 3,030번째 SNP 증폭용 프라이머 세트.

굵은 글씨체; 3,015번째 및 3,030번째 염기에 위치한 SNP 부분.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Single nucleotide polymorphism marker for discriminating cabbage of high content of glucobrassicin and uses thereof <130> PN18242 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 3057 <212> DNA <213> Brassica oleracea var. capitata <400> 1 atggcacccg catgcaccag aatcaactca ctccacgtgg cagtgatcgg agccggagca 60 gccggactcg cagccgcacg cgagctacgc cgcgaatcac actccgtcgt ggtcttcgag 120 cgcggcacac aaatcggagg tctctgggtg tacacacctc aaaccgaacc cgacccgctc 180 agcctcgacc cgaaccgaac catagtccac tccagcgtct acgactcgct ccgcaccaac 240 ctcccaagag agtgcatggg ttacagagac ttccctttcg tgccccgaga cgacgacgga 300 tccagggacc cgagaaggta tcctagtcac agcgaagtcc tcgcttacct tcaagacttc 360 gcgagagagt tcaagctcga ggagatggtt cggttcgaga ctgaagtggt ttgtgttgag 420 cctgaagggc aaaaatggga gatccggtca aaaagttccg atgggatctt caaagatgag 480 atctttgatt ctgtcgtcgt gtgtaatgga cactatacag agcctcgagt tgctcatgtt 540 cctggtaata attaattgat taaaagtctt aatctttctt tgtcttttga tgattttgaa 600 gtagttcatg tttgatccat gtgaaatctt taggcataga ttcatggcca ggcaagcaga 660 tccatagtca taactataga gttcctgatc cattcaaaga ccaggtaggt tcttacagaa 720 tctattaacc ctttacgctt tatttatttg tccttttcaa caattgttta ttagattctc 780 tacttcttat attatatttc atacaaaaac gtagttagta atgtatcttt atattaatgt 840 tctaaaaatc ggtttaaact atgcctgcgg caaatcggtc cagaggttca aaaaattggt 900 ctaggcttaa gcctaatcaa taatcatcta taaaatgctt aattaccgtc taacatttct 960 tgagatttgc taaatacatt gtgtggattc attaatcttg cattcttggt ctgaaatctt 1020 tgaaaggtgg tggtagtgat tggaaacttt gcgagtggat cagatataag cagggacata 1080 acaggagtgg ccaaagaagt ccatatcgca tctagatcaa atccatctga gacatacgaa 1140 aagcttcccg ggtccaacaa cctatggctt cactctatgg tattacaaca aaagaaacaa 1200 aatgaaagat aataaagatc agagagtgat gtgattctta tgtttttatg cagatagaaa 1260 gcgcacgcaa agatgggtcg attattttca agaatggtaa ggttgtacaa gctgatacta 1320 ttgtgcattg caccggttac aaatatcact tcccgtttct caataccaat agctatataa 1380 ccgttgagga taactgtgtt ggaccgcttt acaaacatgt ctttcctcct gctcttgctc 1440 caacgctttc cttcatcggt ttaccatgga tggtgaagtc tctcattcat tctacggttc 1500 tttcgtggct tctttgatca tcgtttccta atcagattct ttgttatgaa tcacagacat 1560 tgcagttctt tatgtttgag ttacaaagca aatgggtggc tgctgtttta tctggccgtg 1620 tcacgcttcc ttcagaagac aaaatgatgg aagatgtcac cgccttctat gcaaaccgtg 1680 atgctaacaa gcttcccaag agatacacgc ataagctcgg tgagtgtcag gttgattacc 1740 tcaactggat agccgagcaa gtcggtgcac cacctgttga acactggaga gctgaggaag 1800 tacacggcgg gtatcgaaga ctcgccacgc aatcagacac tttccgtgat aagtgggacg 1860 atgatcatct cattcttgag gcttatgaag atttcttgag acagaagctg atttagtgtt 1920 ggaatagttt attgtcttta atacttttaa tttggaacaa aataatattt ctataacaga 1980 ttgaatctaa gaagtaagac ctaagcatgt tgtacatttt cttgttgacg ccatctgttt 2040 agttcacttt ccaccatgct ctttgccgct tctgctgact ctgctgactt ctgagccaac 2100 tccgttgcgt ggttcatctc ctctatagct ttcaggctcg ctcctagttt agtatccgct 2160 tctgtttttc ttgcgttgat ctcttcaagc tcagctgcta tatctgctag cttcttttcg 2220 gtttcagtct ctgtctcccc tgctcctcgt ttcaaagttt catactctag tactgtgatc 2280 tttatctttg aagaagatga ttcgtcctgt ttcttgctct cttgcttctg agatatcatc 2340 ttcatctcct cgcgcacttt ctcatcagcc gctttggcct gttccacttc tcttatcaca 2400 atctctagtc tcttttcagc ttcctccgca gctctcatag cggaatcggt ttctttcttc 2460 aaactctcta tctttctatt catctcttca gcttcgtttc ttgctcccaa agcttctaac 2520 ttcatcccct caagcttcaa gctctcttcc ttgagagctt ccaccttctt cctctcctca 2580 acctctaacc tctctgcttc tttcttctcc atctcttcgc tttctcttct catctcttca 2640 agctccatcc ttatagaatt caccaagctc cggagagagc attcttcatc agaggcctct 2700 tgcagcctcg tagtagcctc attcagctcg tttgtaataa ctttaaccgt gttcatttca 2760 gactcatgag ctttcttcat ctcttccctt aaactctcaa tctccgaggt cgtctcaata 2820 agcttgcctt caagagttct tgctagctca ggctcatact cttttctcaa cactagcagc 2880 ttcttctccg cctcctcaac ggccgtcttg taacactctc tcaaatcatc tttctccttc 2940 acgatatcgc cgtactcttg ctgattctga gtggcagcca ccttgagctg atgaatcgcg 3000 tctttcatat ccgtaatctc tttggaaagt tcgttaacct tagcggagtt tacttgc 3057 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cgcgtctttc atatccgtaa t 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gcaagtaaac tccgctaagg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ctccttcacg atatcgccgt 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 actccgctaa ggttaacgaa ct 22

Claims

서열번호 1의 양배추 FMOGS-OX5(Flavin-containing monooxygenase FMO GS-OX5) 유전자의 염기서열 중 3,015번째 또는 3,030번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 글루코브라시신(glucobrassicin) 고함량 양배추를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물.
제1항에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오티드는 8 내지 100개의 연속된 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 글루코브라시신 고함량 양배추를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물.
서열번호 1의 양배추 FMOGS-OX5 유전자의 염기서열 중 3,015번째 또는 3,030번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한, 글루코브라시신 고함량 양배추 판별용 HRM(high resolution melting) 프라이머 세트.
제3항에 있어서, 상기 HRM 프라이머 세트는 서열번호 2 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 또는 서열번호 4 및 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 HRM 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 글루코브라시신 고함량 양배추 판별용 HRM 프라이머 세트.
제3항 또는 제4항에 따른 올리고뉴클레오티드 HRM 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 글루코브라시신 고함량 양배추 조기 판별용 키트.
제5항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 글루코브라시신 고함량 양배추 조기 판별용 키트.
양배추 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제3항 또는 제4항의 HRM 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 HRM(high resolution melting) 분석을 통해 유전자형을 분석하는 단계를 포함하는, 글루코브라시신 고함량 양배추를 조기에 판별하기 위한 방법.
서열번호 1의 양배추 FMOGS-OX5 유전자의 염기서열 중 3,015번째 또는 3,030번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 글루코브라시신 고함량 양배추 판별용 프로브.
서열번호 1의 양배추 FMOGS-OX5 유전자의 염기서열 중 3,015번째 또는 3,030번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 글루코브라시신 고함량 양배추 판별용 마이크로어레이.