KR102575912B1

KR102575912B1 - 시니그린 저함량 양배추 판별용 snp 마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102575912B1
Application number: KR1020210135699A
Authority: KR
Inventors: 김혜란; 노영희
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2021-10-13
Filing date: 2021-10-13
Publication date: 2023-09-06
Also published as: KR20230052537A

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 양배추 AOP1 (2-oxoglutarate-dependent dioxygenase) 유전자의 염기서열 중 693번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

시니그린 저함량 양배추 판별용 SNP 마커 및 이의 용도{Single nucleotide polymorphism marker for discriminating cabbage having low content of sinigrin and uses thereof}

본 발명은 시니그린 저함량 양배추 판별용 SNP 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

양배추는 국내 3대 주요 수출 작물이며 전세계적으로 가장 많이 재배되고 있는 채소 작물로서, 재배 면적은 1,600,000 ha 정도이며, 종자시장 규모는 약 1,600톤 정도이다. 양배추에는 각종 비타민 (C, A, E, K, B1, B2 등), 엽산, 폴리페놀, 미네랄, argano-sulfur compounds 등 타작물에 비해 영양성분이 많은 편이며, 특히 강력한 항암효과가 알려진 기능성 성분인 글루코시놀레이트(glucosinolate)를 다량 함유하고 있다. 글루코시놀레이트는 아미노산과 당으로부터 만들어지는 황을 함유하는 이차대사산물로서 가수분해에 의해 배추과 작물의 특정한 향과 맛을 내는데 기여하는 물질이며, 작물의 해충, 초식동물 및 병원균으로부터의 방어기작에 관여하는 것으로도 알려져 있다. 글루코시놀레이트의 인체 유용 기능성은 많은 연구를 통해 알려져 있으나, 주로 양배추를 포함한 배추과 작물과 이를 이용한 기능성 식품을 통해서 인체 섭취가 이루어지고 있으며, 대표적 성분은 16종류 정보로 보고되고 있다. 이 중 시니그린(sinigrin)은 인체 섭취 시 미로시나아제(myrosinase) 효소에 의해 이소티오시안산 알릴(ally isothiocyanate)로 분해되며, 이 물질은 인체에서 발암물질에 의해 DNA가 손상되는 것을 방지하며, 항암효과가 높은 물질로 알려져 있다. 이 외에, 시니그린은 항염, 항균, 항산화, 상처회복 기능 등이 알려져 있다. 따라서, 육종현장에서는 시니그린의 함량이 높은 양배추 신품종 개발 노력이 이루어지고 있다.

시니그린의 함량이 높은 신품종을 개발하기 위해서는 육종 소재를 결구될 때까지 (5~11개월 소요) 재배한 후, 실험실 수준에서 성분 분석을 통해 고함량의 시니그린 목표 형질 검정을 해오고 있으나, 이 방법은 시간과 노동력이 많이 소요되며, 환경 영향에 의해 형질검정의 정확성이 매우 떨어진다. 또한, 수확 후 즉각적인 성분 및 함량의 변화로 인해, 시료 채취 후 즉각적인 분석이 필요하다.

한편, 한국공개특허 제2017-0080523호에는 '배추 글루코시놀레이트 함량 조절인자 기반의 SNP 마커 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1987278호에는 '글루코브라시신 고함량 양배추 판별용 SNP 마커 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 양배추 AOP1 유전자에 위치한 염기다형성에 기반한 본 발명의 '시니그린 저함량 양배추 판별용 SNP 마커 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 양배추가 속한 배추과 작물의 국제표준유전집단인 TBDH 집단 130계통과 모·부본의 시니그린 함량을 분석하여 시니그린 고함량 및 저함량 계통을 선발하고 이들의 게놈을 resequencing하여 시니그린 고함량 계통 및 저함량 계통간에 다른 SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출하고, 이 중에서 글루코시놀레이트(glucosinolate) 생합성 및 생분해 유전자 385개의 유전자에서 발굴된 51개 SNPs를 발굴하여 이들을 검증한 결과, 양배추의 9번 염색체(GenBank assession No. CM002792.1)에 위치하는 AOP1 (2-oxoglutarate-dependent dioxygenase) 유전자의 염기서열 부위에서 시니그린 함량을 판별할 수 있는 SNP 분자마커를 개발하였다. 상기 SNP 분자마커를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 양배추 시료의 유전형을 분석한 결과, 본 발명의 SNP 마커 및 이의 프라이머 세트가 0.42 μmol/g 건조중량 이하의 시니그린을 함유하는 저함량 양배추를 효과적으로 판별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 양배추 AOP1 (2-oxoglutarate-dependent dioxygenase) 유전자의 염기서열 중 693번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 시니그린(sinigrin) 저함량 양배추를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 양배추 AOP1 유전자의 염기서열 중 693번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한, 시니그린 저함량 양배추 판별을 위한 HRM(high resolution melting)용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 HRM용 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 시니그린 저함량 양배추 판별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 양배추 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 HRM용 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 HRM 분석을 통해 유전자형을 분석하는 단계를 포함하는, 시니그린 저함량 양배추를 조기에 판별하기 위한 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 양배추 AOP1 유전자의 염기서열 중 693번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 시니그린 저함량 양배추 판별용 프로브 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 양배추 AOP1 유전자의 염기서열 중 693번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 시니그린 저함량 양배추 판별용 마이크로어레이를 제공한다.

시니그린의 함량이 높은 신품종을 개발하기 위해서는 육종 소재를 결구될 때까지(5~11개월 소요) 재배한 후, 실험실 수준에서 성분 분석을 통해 고함량의 시니그린 목표 형질 검증을 실시하고 있으나, 이 방법은 시간과 노동력이 많이 소요되며, 환경에 의해 형질검정의 정확성이 떨어지는 문제점이 있다. 본 발명의 SNP 기반 마커는 시니그린의 함량이 낮은 양배추를, 재배 초기 또는 종자 단계에서 효율적으로 판별할 수 있으므로 육종에 소요되는 시간, 비용 및 노력을 절감할 수 있으며, 재배 농가 및 소비자에게도 고품질의 양배추 생산 및 공급을 가능하게 할 것으로 기대된다.

도 1은 양배추류 국제표준유전집단인 TBDH 집단을 이용하여 작성된 유전자지도를 기반으로 한 시니그린 함량 관련 QTL mapping 결과이다.
도 2는 시니그린 함량 판별용 마커(SIN1)를 이용한 143개체(브로콜리, 양배추, 적양배추, TBDH 집단)의 AOP1 유전자의 유전형 분석 결과이다.
도 3은 143 개체의 AOP1 유전자의 유전자형 검정 결과(도 2)와 시니그린 함량을 정리한 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 양배추 AOP1 (2-oxoglutarate-dependent dioxygenase) 유전자의 염기서열 중 693번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 시니그린(sinigrin) 저함량 양배추를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 시니그린 저함량 양배추는 0.42 μmol/g 건조중량의 시니그린 함량을 초과하지 않는 양배추일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오티드는 8 내지 100개의 연속된 뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "뉴클레오티드"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이며, 특별하게 다르게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.

본 발명의 SNP 마커를 양배추의 시니그린 함량 판별에 사용할 수 있는 것은 양배추의 AOP1 유전자인 서열번호 1로 표시되는 염기서열 중 SNP 변이 위치인 693번째가 A 또는 G로 다르게 나타나는 것에 근거한 것이다. 예를 들어, 서열번호 1의 693번째 뉴클레오티드에 해당하는 SNP는 A 또는 G로 염기다형성을 나타내는데, 이 SNP위치에서 AA 동형접합 유전자형을 갖는 양배추는 0.42 μmol/g 건조중량 초과의 시니그린을 함유하는 양배추이고, 이 SNP 위치에서 GG 동형접합 유전자형을 갖는 양배추는 시니그린 함량이 0 이거나 0.42 μmol/g 건조중량 이하인 시니그린 저함량 양배추로 판단할 수 있다.

한편, 본 발명에서 사용된 용어 SNP 위치에서의 "동형접합 유전자형(homozygotic genotype)"이란 SNP 변이 위치에 해당하는 상동 염색체(homologous chromosome) 상의 대립형 염기(allelic base)가 서로 동일한 염기인 경우를 의미한다.

본 발명은 상기 서열번호 1의 염기서열에서 SNP 위치의 염기 변이체에 관한 것이나, 이러한 SNP 염기 변이가 이중 가닥의 gDNA(게놈 DNA)에서 발견되는 경우, 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 따라서 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열에서 SNP 위치의 염기도 상보적인 염기가 된다. 이러한 측면에서, 본 명세서에 제시된 모든 서열은, 특별한 언급이 없는 한, 게놈 DNA의 센스 가닥에 있는 서열을 기준으로 한 것이다.

본 발명은 또한, 서열번호 1의 양배추 AOP1 (2-oxoglutarate-dependent dioxygenase) 유전자의 염기서열 중 693번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한, 시니그린(sinigrin) 저함량 양배추 판별을 위한 HRM(high resolution melting)용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명에서 용어 "HRM(high resolution melting)"은 핵산 서열에서의 변이를 확인하기 위해 사용된 상대적으로 새로운 포스트 PCR 분석 방법이다. 이 방법은 PCR 해리곡선에서 작은 차이를 감지하는 것을 기초로 하며, PCR 후 해리곡선의 패턴 분석을 통해 유전형을 분석하는 기술이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 HRM 프라이머 세트는 서열번호 2 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 서열번호 2 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 1로 표시되는 염기서열 중 693번째 SNP 변이 위치를 확인할 수 있는 프라이머 세트이다.

상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 2 및 3의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 2의 프라이머(24개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 2의 서열 내의 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 2 및 3의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다. 또한, 상기 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 정방향 프라이머이며, 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 역방향 프라이머이다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, HRP(horse radish peroxidase), 알칼리 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, ³²P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 비오틴(biotin)) 등이 있다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30bp의 길이로 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 상기 올리고뉴클레오티드 HRM 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 시니그린(sinigrin) 저함량 양배추 판별용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 키트는 증폭된 산물을 분석하기 위해 HRM 분석 또는 염기서열 결정에 필요한 시약을 추가로 포함할 수 있다. 상기 dNTPs는 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하며, DNA 폴리머라제는 내열성 DNA 중합효소로서 Taq DNA 폴리머라제, T4 DNA 폴리머라제 등 시판되는 폴리머라제를 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다. 또한, 본 발명에 있어서, 시니그린 저함량 양배추를 판별하기 위한 키트는 하기 프로브 또는 하기 마이크로어레이가 포함된 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또한,

양배추 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 HRM용 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 단계의 산물을 HRM(high resolution melting) 분석을 통해 유전자형을 분석하는 단계를 포함하는, 시니그린(sinigrin) 저함량 양배추를 조기에 판별하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 양배추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega, 미국)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 SNP 변이 염기 증폭용 HRM 프라이머를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명은 또한, 서열번호 1의 양배추 AOP1 (2-oxoglutarate-dependent dioxygenase) 유전자의 염기서열 중 693번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 시니그린(sinigrin) 저함량 양배추 판별용 프로브 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어 "프로브"는 혼성화 프로브로서, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 자연적인 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 바람직하게는 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일 가닥, 더 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어 "혼성화(hybridization)"는 상보적인 단일 가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 완전히 매칭되거나 일부 미스매치로 실질적으로 매칭되는 2개의 핵산 가닥 사이에서 일어날 수 있다. 혼성화를 위한 상보성은 혼성화 조건, 특히 온도에 따라 달라질 수 있다.

본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 프로브는 SNP 뉴클레오티드인 서열번호 1의 693번째 위치의 뉴클레오티드를 포함하는 8 내지 100 개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함한다. 더 바람직하게는, 상기 프로브의 3'-말단 또는 5'-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3'-말단 또는 5'-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다. 혼성화에 적합한 조건은 당업계에 통상적으로 알려진 내용을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 대립형질 중 하나에만 혼성화하도록 충분히 엄격해야 하며, 온도, 이온 세기(완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.

본 발명은 또한, 서열번호 1의 양배추 AOP1 (2-oxoglutarate-dependent dioxygenase) 유전자의 염기서열 중 693번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 시니그린(sinigrin) 저함량 양배추 판별용 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명에서 시니그린 저함량 양배추를 판별하기 위한 마이크로어레이는 본 발명의 SNP 마커가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이를 의미한다. "마이크로어레이"란 기판상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함된다.

용어 "기판"은 혼성화 특성을 보유하고, 혼성화의 배경 수준이 낮게 유지되는 조건 하에 마커가 부착될 수 있는 임의의 기판을 말한다. 통상적으로, 상기 기판은 미세역가(microtiter) 플레이트, 막(예를 들면, 나일론 또는 니트로셀룰로오스), 미세구(비드) 또는 칩일 수 있다. 막에 적용하거나 고정하기 전에, 핵산 프로브를 변형시켜 고정화를 촉진시키거나 혼성화 효율을 개선시킬 수 있다. 상기 변형은 단독중합체 테일링(homopolymer tailing), 지방족기, NH₂기, SH기 및 카르복실기와 같은 상이한 반응성 작용기와의 커플링, 또는 비오틴, 합텐(hapten) 또는 단백질과의 커플링을 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. TBDH 집단의 시니그린 성분 분석

양배추가 속한 배추과 작물의 C genome의 국제표준유전집단인 TBDH 집단 130 계통과 모부본의 종자를 0.5X MS 배지에 파종하여 약 20일 정도 자란 유묘기 샘플을 수확하여 동결건조하였고, 각 샘플의 동결건조 분말을 100 mg씩 사용하여 시니그린을 추출하였다. 시니그린은 메탄올을 사용하여 추출한 후 HPLC로 분석하였으며, 0.1 mg/㎖ 시니그린(sinigrin)을 표준시료로 사용하여 정량에 사용하였다. TBDH 집단의 계통 간 시니그린 평균차이를 검정하기 위해서 ANOVA test를 수행하였으며, 사후 검정으로는 Duncan' test를 이용하였고, 통계의 유의 수준은 P<0.05로 하였다. 분석 결과, 하기 표 1에서와 같이 TBDH 집단의 시니그린 함량은 0.0±0.0~5.3±0.0 μmol/g dry wt.으로 분포함을 알 수 있었다.

실시예 2. 시니그린 함량이 높은 계통 및 낮은 계통에서 시니그린 함량 관련 QTL 맵핑

TBDH 집단을 이용하여 작성된 유전자 지도[TBDH 집단 130 계통 (Iniguez-Luy et al. 2009 Theor Appl Genet 117: 977-985)을 이용, JoinMap 프로그램을 사용하여 총 344개 마커가 맵핑되었고, 유전자지도 총길이는 831.5cM, linkage group 9개]를 기반으로, Window QTL cartographer 프로그램을 이용하여 시니그린 함량 관련 QTL을 조사하였다. 그 결과, 시니그린 함량 관련 QTL은 염색체 5번의 23.40~48.73cM, 49.49~49.76cM, 50.23~56.84cM 및 염색체 9번의 0.01~19.26cM에 mapping되는 것을 알 수 있다(도 1).

실시예 3. 유전적 변이 발굴을 위한 시니그린 고함량 및 저함량 계통의 리시퀀싱(resequencing)

고함량 계통으로 TBDH 191 (시니그린 함량 3.09 μmol/g dry wt.) 및 TBDH 45 (시니그린 함량 3.01 μmol/g dry wt.)와 시니그린의 함량이 0.0으로 검출되는 저함량 계통 TBDH 11, TBDH 126, TBDH 310 및 TBDH 320 4계통을 각각 resequencing 하여 참조서열(reference sequence)인 TO1000 genome (GenBank RefSeq Accession number: GCF_000695525.1)의 26.8X ~ 29.6X genome coverage 수준의 염기서열을 생산하였다.

유전적 변이 발굴을 위한 시니그린 고함량 및 저함량 계통의 resequencing 결과

계통명	raw reads (bp)	Ref Seq Aligned (bp)	Depth	Total No. of reads	Ref Seq Aligned read No.
TBDH 191	14,706,326,692	12,218,990,377	27.40	97,392,892	87,953,945
TBDH 45	14,925,379,976	12,663,397,026	28.40	98,843,576	91,951,411
TBDH 11	14,858,197,962	13,128,358,805	29.44	98,398,662	94,870,581
TBDH 126	14,892,329,096	12,866,960,151	28.85	98,624,696	93,237,785
TBDH 310	15,541,781,606	13,191,777,272	29.58	102,925,706	96,249,452
TBDH 320	14,965,891,464	11,964,686,614	26.83	99,111,864	86,343,870

실시예 4. 시니그린 함량 관련 SNP(single nucleotide polymorphism) 발굴 및 검증

상기 실시예 3을 통해 생산된 염기서열에 대해 차세대염기서열분석법을 이용하여 SNP 분석을 수행하였다. 먼저, 시니그린 저함량 계통과 고함량 계통끼리 공통이며, 저함량과 고함량 계통간에 다른 ((TBDH 191=TBDH 45)≠(TBDH 11=TBDH 126=TBDH 310= TBDH 320)) SNP는 51,064개가 검출되었고, 이 중에서 글루코시놀레이트(glucosinolate) 생합성 및 생분해 유전자 385개의 유전자에서 발굴된 SNP는 51개 였으며, 이를 대상으로 검증을 거쳐 양배추의 9번 염색체 (GenBank assession No. CM002792.1)의 1,411,856bp 위치의 SNP (AOP1 유전자: NCBI assession No. 106316191)를 발굴하였다. 상기 SNP 위치의 유전형을 HRM 기법으로 검출할 수 있도록 HRM 프라이머 세트를 개발하였다(표 3). 이 프라이머 세트를 SIN1 마커로 명명하였다.

시니그린 함량 관련 AOP1 유전자의 SNP 마커를 위한 HRM용 프라이머 세트

명칭	염기서열 (5'→3')	서열번호
SIN1_F	CTCTTTTTCTTTGGGGAACTCTAA	2
SIN1_R	TCAACCAAAATGTTATACATAGACAAA	3

상기 선발된 SIN1 마커를 검증하기 위해 브로콜리, 양배추, 적양배추, TBDH 집단을 포함하는 143개체의 유전자원 시료에서 유전형 분석과 시니그린 함량 분석을 수행하였다.

PCR 반응은 총 반응혼합물 양을 10 ㎕로 하였고, 0.4 μM 프라이머, 250 μM dNTP, 0.1 unit Taq 중합효소와 주형 DNA 10 ng 및 0.5x LCgreen을 혼합하였다. 증폭을 위한 조건으로 사이클을 시작하기 전 시료를 94℃에서 5분간 전변성(pre-denaturation)하였고, 94℃에서 45초, 각 프라이머의 적정 결합(annealing) 온도에서 45초, 72℃에서 45초간 합성을 1 사이클로 하여 총 40 사이클을 수행하였고, 40 사이클 증폭 후에는 완전한 DNA 확장(extension)을 위해 72℃에서 7분간 최종신장(final elongation)을 수행하였다. 증폭 단편의 다형성은 LightScanner(Idaho Technology Inc. 미국)를 이용하여 분석하였다.

분석 결과, 시니그린의 함량이 낮은 개체에서는 주로 유전형이 GG로 분석되었으며, 시니그린 함량이 0인 개체 74계통에서 82.4%(61개체)의 선발효율을 보였다(도 2 및 도 3). 또한 0.42 μmol/g dry wt.을 초과하는 개체에서는 GG의 유전형이 나타나지 않아, 유용 소재인 시니그린 고함량 소재를 제거할 가능성이 없음을 알 수 있었다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Single nucleotide polymorphism marker for discriminating cabbage having low content of sinigrin and uses thereof <130> PN21245 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1047 <212> DNA <213> Brassica oleracea <400> 1 atggattcag actctcttct tcctctttct gaatctctcc agctcccagt catagatttc 60 tccgaccaga acttaacacc aggaacctca aagtgggata aagtgaaggc tgatgtccgt 120 aaagcgttag aagactacgg ctgtttccaa gcatacgttg acaaagtgtc aaacattgag 180 cttgacaagt ctgtttatga agccatggaa aagcttttcg atttgccggt tcagaccaaa 240 cagagaaacg tgtcttccaa accctttcat gggtatctaa gtcacaatct ttaccagagt 300 ttagggattg aagatgctaa tgttgcagag aaagtcaacg acttcattca actgctatgg 360 cctgatcatg gaaacaagag tattagtgag atgatgcaca agttctcgac gcaactagtg 420 gaactggatg tgatggtgag aagaatgata atggagagct ttggactaga gaagtacctt 480 gaggaacatt tgaattctac aaactatctc tttcgaatga tgaagtacac agcacctcct 540 gatgacgatg tagaagaggc aaagctaggt ttacgttctc atacggacaa gaacataatc 600 accatacttc atcagtatga agttgatggt ttggaaatta tgaccaaaga tggacaatgg 660 atcaaagtga aaccatctca acattctttc atcattatgg ttggagattc tctatgtgca 720 cttttgaatg gtagattgta ttctccatac caccgagtct tgatggtggc aaagaagaca 780 aggtattcga ctgcaatgtt ctctgttcca aaatcaggag ccatcataga ttcacctgaa 840 gaggttgttg acgaagaaca tcctcgtatg ttcaaaccct ttgaatatat ggatttcctt 900 gacttctttc actcggaagc aggtcgcaga gttgaatcta ctctccatgc tttttgtgct 960 ctctgaaaca tttcaacttt tattcacagc aatgaatgta atgacttcac atttttatgg 1020 tataggtctt gctactttcc cttttca 1047 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ctctttttct ttggggaact ctaa 24 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tcaaccaaaa tgttatacat agacaaa 27

Claims

서열번호 1의 양배추 AOP1 (2-oxoglutarate-dependent dioxygenase) 유전자의 염기서열 중 693번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 시니그린(sinigrin) 저함량 양배추를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물.
제1항에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오티드는 8 내지 100개의 연속된 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는, 시니그린 저함량 양배추를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물.
서열번호 1의 양배추 AOP1 (2-oxoglutarate-dependent dioxygenase) 유전자의 염기서열 중 693번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한, 시니그린(sinigrin) 저함량 양배추 판별을 위한 HRM(high resolution melting)용 프라이머 세트.
제3항에 있어서, 상기 HRM용 프라이머 세트는 서열번호 2 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는, 시니그린 저함량 양배추 판별을 위한 HRM용 프라이머 세트.
제3항 또는 제4항에 따른 HRM용 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 시니그린(sinigrin) 저함량 양배추 판별용 키트.
제5항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는, 시니그린 저함량 양배추 판별용 키트.
양배추 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제3항 또는 제4항의 HRM용 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 HRM(high resolution melting) 분석을 통해 유전자형을 분석하는 단계를 포함하는, 시니그린(sinigrin) 저함량 양배추를 조기에 판별하기 위한 방법.
서열번호 1의 양배추 AOP1 (2-oxoglutarate-dependent dioxygenase) 유전자의 염기서열 중 693번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 시니그린(sinigrin) 저함량 양배추 판별용 프로브 조성물.
서열번호 1의 양배추 AOP1 (2-oxoglutarate-dependent dioxygenase) 유전자의 염기서열 중 693번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 시니그린(sinigrin) 저함량 양배추 판별용 마이크로어레이.