CN110373489B

CN110373489B - 与小麦籽粒蛋白含量相关的kasp标记及其应用

Info

Publication number: CN110373489B
Application number: CN201910619126.XA
Authority: CN
Inventors: 姜朋; 马鸿翔; 张旭; 吴磊; 何漪
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-07-10
Filing date: 2019-07-10
Publication date: 2021-01-08
Anticipated expiration: 2039-07-10
Also published as: CN110373489A

Abstract

本发明公开了与小麦籽粒蛋白含量相关的KASP标记及其应用，利用本发明提供的两组KASP标记专用引物可用于帮助鉴定待测小麦的基因型，筛选低蛋白含量的材料，具有快速、简便、特异性高和准确性好的特点，可在较短时间内完成大批量材料中籽粒蛋白含量筛选和表型预测工作。

Description

与小麦籽粒蛋白含量相关的KASP标记及其应用

技术领域

本申请涉及小麦育种领域，特别是一种与小麦籽粒蛋白含量相关的KASP标记及其应用。

背景技术

蛋白质是小麦籽粒的重要组分,不仅影响小麦的营养品质,同时也是小麦加工品质的基础。蛋白质含量为典型的数量性状,其遗传受多基因控制,且易受环境影响。采用传统育种手段进行蛋白质含量选择存在工作量大(籽粒收获后测定)、选择效率低(环境影响)等问题，而分子标记辅助选择育种可在DNA水平针对目标性状进行选择，不仅结果稳定，而且可以在苗期进行选择，降低表型评价的成本，提高小麦育种效率。

目前关于蛋白质含量分子标记和QTL定位的已有诸多报道，分布于多条染色体。Echeverry-Solarte等(Echeverry-Solarte,M.,Kumar,A.,Kianian,S.,Simsek,S.,Alamri,M.S.,&Mantovani,E.E.,et al.(2015).New qtl alleles for quality-relatedtraits in spring wheat revealed by ril population derived from supernumerary？×？non-supernumerary spikelet genotypes.Theoretical and Applied Genetics,128(5),893-912.)以163份重组自交系为材料，结合一张包含939个DArT标记的遗传图谱，在1A、1B等11条染色体上检测到9个稳定的QTL，最高可解释16.9％的表型变异。Bordes等(Bordes J,Ravel C,Le Gouis J,Lapierre A,Charmet G,Balfourier F.Use of aglobal wheat core collection for association analysis of flour and doughquality traits.Journal of Cereal Science,2011,54:137-147)利用803个分子标记(DArT，SSR及SNP)对372份来自世界各地的小麦材料进行基因组扫描，通过关联分析在15条染色体上关联到14个籽粒蛋白质含量相关的分子标记。不同研究者可能采用不同的作图群体与分析方法，获得的结果具有一定的局限性，特别是受环境影响较高的性状，因此从某一地域的品种材料中发掘优势等位变异，进而开发分子标记，对当地育种选择更具有实际意义。

蛋白质含量(<11.5％)是弱筋小麦的重要评价指标。长江中下游麦区是我国弱筋小麦生产的优势产业带，在多年的育种实践中积累了一批以宁麦9号为代表的优质弱筋品种及品系，其中含有大量优势等位变异，但缺乏相关分子标记。

单核苷酸多态性(SNP)标记迅速具有遗传稳定、数量多、分布广且易于检测等特点，适合于数量庞大的检测分析，目前市场中已存在多种适用于不同动植物的SNP芯片，在遗传研究中发挥着越来越重要的作用。通过遗传分析找到重要性状的标记位点后，需要将其转化为易用的分子标记。

Kompetitive Allele Specific PCR(KASP)标记技术通过荧光探针，可以将SNP标记的不同等位变异区分，并且KASP技术通量高、快速、稳定，是一种较为理想的分子标记。KASP技术是目前常见的一种鉴定SNP位点的技术。关联分析是以连锁不平衡为基础，鉴定某一群体内目标性状与遗传标记或候选基因关系的分析方法。近年来,该技术已在小麦产量、品质、抗病性等遗传学研究上广泛采用。目前适用于高通量筛选的籽粒蛋白KASP标记的方法尚未见报道。

发明内容

针对目前长江中下游麦区缺乏与小麦籽粒蛋白含量相关分子标记的现状，本申请一种与小麦籽粒蛋白含量相关的KASP标记及其试剂盒与应用，为长江中下游麦区小麦品质育种提供帮助，本发明是通过如下技术方案实现的。

首先，本发明提供了与小麦籽粒蛋白含量相关的KASP标记引物组，该引物组由以下两组引物组成：1)核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1-SEQ IDN.3所示的引物AlleleFAM1、AlleleHEX2和Common1；2)核苷酸序列依次如SEQ ID NO.4-SEQ IDN.3所示的引物AlleleFAM2、AlleleHEX2和Common2。

其次，本发明提供了一种用于鉴定或辅助鉴定待测小麦籽粒蛋白含量的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1所述的KASP标记引物组，还包含KASPMix等本领域常规的完成PCR扩增所需要的必要试剂

第三，本发明一种鉴定或辅助鉴定小麦籽粒蛋白含量方法，包括如下步骤：

1)以所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用KASP标记引物组进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，以及

2)根据荧光信号扫描结果判断位于4A染色体612113696处的wsnp_Ex_c24474_33721784位点基因型为T或C中的哪一种，判断位于5B染色体20832543处的wsnp_BE499835B_Ta_2_5位点基因型T或G中的哪一种；当待测小麦wsnp_Ex_c24474_33721784位点和wsnp_BE499835B_Ta_2_5位点的基因型均T时，则认为其籽粒蛋白含量低于对应两个位点其他基因型的小麦；其中所述KASP标记引物组由以下引物组成：1)核苷酸序列依次如SEQID NO.1-SEQ IDN.3所示的引物AlleleFAM1、AlleleHEX2和Common1；2)核苷酸序列依次如SEQ ID NO.4-SEQ IDN.3所示的引物AlleleFAM2、AlleleHEX2和Common2。

本发明以长江中下游麦区101份小麦品种为材料，利用高通量基因芯片获取基因型数据，通过关联分析检测到2个与蛋白质含量相关的位点，并将其转化为KASP标记，经验证此标记可区分高低蛋白含量小麦材料，为此长江中下游麦区小麦品质育种提供帮助。

附图说明

图1为KASP标记扩增检测检测结果，其中A为wsnp_Ex_c24474_33721784，B为wsnp_BE499835B_Ta_2_5；C、T、G分别代表三种脱氧核糖核苷酸。

图2为基因分型检测结果，其中A为wsnp_Ex_c24474_33721784，B为wsnp_BE499835B_Ta_2_5；C、T、G分别代表三种脱氧核糖核苷酸。。

具体实施方式

以下实施例中所涉及的小麦品种均为审定品种，由江苏省农业科学院保存。

实施例1筛选SNP位点

本实施例以长江中下游麦区101个小麦品种为材料(表1)，2015-2016、2016-2017连续两个生长季将所有材料种植于江苏省农科院院内试验基地及六合试验基地，3行小区田间种植。2016和2017年分别收获种子晾干，按照GB/T 24899-2010方法测定籽粒蛋白含量。

表1小麦品种

采用CTAB法从表1试验材料植株幼嫩叶片中分离DNA，利用Illumina 9 k基因芯片对试验材料进行基因组扫描，利用Excel 2016对基因型数据进行初步处理(具体步骤参见：Cavanagh等,2013，Genome-wide comparative diversity uncovers multiple targetsof selection for improvement in hexaploid wheat landraces and cultivars)。最终获得3754个缺失率<10％、最小基因频率>5％且具有基因组参考位置的SNP位点。

然后采用基于压缩混合线性模型的R语言程序包GAPIT进行表型-基因型关联分析(参见文献：Z.Z,E.E,L.CQ,T.RJ,T.HK,G.MA,B.PJ,Y.J,A.DK,O.JM,B.ES,Mixed linearmodel approach adapted for genome-wide association studies,Nature Genetics,42(2010)355.)，并估算各标记效应，P<0.01时认为该标记与目标性状相关联，统计在多个环境中关联到的标记位点。

最终获得两个相对稳定的蛋白质含量相关位点wsnp_Ex_c24474_33721784与wsnp_BE499835B_Ta_2_5，通过与中国春小麦参考基因组V1.1版本比对，分别位于4A染色体612113696与5B染色体20832543位置处，其等位变异分别为T/C和T/G。就弱筋小麦育种来说，两个标记的T碱基为优势等位变异，对籽粒蛋白质含量具有负向调控作用，即位于4A染色体612113696处的wsnp_Ex_c24474_33721784位点基因型为T的小麦籽粒蛋白含量低于基因型为C的小麦；位于5B染色体20832543处的wsnp_BE499835B_Ta_2_5位点基因型为T的小麦籽粒蛋白含量低于基因型为G的小麦。

为了能够进一步验证并利用实施例1获得的位点位点wsnp_Ex_c24474_33721784与wsnp_BE499835B_Ta_2_5，进一步开发KASP标记。分别根据两个位点的序列，利用PolyMarker设计引物序列，并利用primer 6.0对引物序列进行评估，最终在材料中进行验证。每个标记均包含两条前引物(AlleleFAM、AlleleHEX)与一条后引物(Common)，具体序列如下：

wsnp_Ex_c24474_33721784：

AlleleFAM1(SEQ ID NO.1)：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCCTGTATGCGCCGGAAT；

AlleleHEX1(SEQ ID NO.2)：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCCTGTATGCGCCGGAAC；

Common1(SEQ ID NO.3)：AACGCTGGGCTGAAAGAAC。

wsnp_BE499835B_Ta_2_5：

AlleleFAM2(SEQ ID NO.4)：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACCTTGTCATCCATGCCTTT；

AlleleHEX2(SEQ ID NO.5)：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACCTTGTCATCCATGCCTTG；

Common2(SEQ ID NO.6)：CTGGAAACCACTGGTCCCAA。

并进行PCR扩增反应，反应体系及扩增程序如下：

PCR体系(5μL)：包括2.5μL样品DNA(30ng μL^-1),KASP Mix 2.5μL(LGC Genomics,Hoddeston,UK)和0.07μL KASP Assay Mix；

其中，KASP Assay Mix配制方法如下：每100μL KASP Assay Mix包含浓度为100μM的AlleleFAM 12μL、浓度为100μM的AlleleHEX 12μL、浓度为100μM的后引物30μL、加入ddH₂O补足至100μL。

PCR程序：94℃热激活15min；94℃变性20s,61～55℃退火和延伸60s,10个循环(touch-down,每循环降低0.6℃)；94℃变性20s,55℃退火和延伸60s,26个循环。

利用多功能酶标仪(PHERAstar，MGLABTECH,Germany)检测PCR扩增产物，并使用KlusterCaller software(LGC Genomics,Beverly,USA)进行基因分型(分型方法参见文献：Wu J,Liu S,Wang Q,Zeng Q,Mu J,Huang S,Yu S,Han D,Kang Z(2018)Rapididentification of an adult plant stripe rust resistance gene in hexaploidwheat by high-throughput SNP array genotyping of pooled extremes.Theoreticaland Applied Genetics 131:43-58)。

从101份品种中随机选取46份按如上方法进行KASP标记扩增检测，检测结果如图1所示，图1中，A为wsnp_Ex_c24474_33721784，B为wsnp_BE499835B_Ta_2_5，检测结果显示分型结果良好，并且与芯片检测数据完全一致，说明KASP标记开发成功，可进一步应用于育种材料检测。

实施例2 SNP位点验证及应用

从2018国家区域试验(表1)中随机选取48份品种材料，利用实施例1获得的KASP引物组对进行基因分型(检测结果见图2及表2所示)，并结合表型鉴定数据进行统计分析(t检验)，统计软件采用SPSS 19.0，结果如表3所示。检测方法采用的是国标GB/T 24899-2010，由国家质量监督检验检疫总局及国家标准化管理委员会颁布。

表2

表3

^*表示0.05显著水平。

由表2、3可知，当单独使用1个标记时，携带优势等位变异的材料的籽粒蛋白含量低于携带非优势等位变异的材料，但未达到显著水平，当同时使用两个标记时，差异可达到显著水平。即，wsnp_Ex_c24474_33721784位点可能的基因型为T或C，wsnp_BE499835B_Ta_2_5位点可能的基因型为T或G，当待测小麦wsnp_Ex_c24474_33721784位点和wsnp_BE499835B_Ta_2_5位点同时为T基因型时，其籽粒蛋白含量低于对应位点其他基因型的小麦。

以上实施例说明利用本发明提供的KASP标记引物对可以帮助选择低蛋白含量的材料。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 与小麦籽粒蛋白含量相关的KASP标记及其应用

<141> 2019-07-10

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaaggtgacc aagttcatgc tccctgtatg cgccggaat 39

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaggtcgga gtcaacggat tccctgtatg cgccggaac 39

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aacgctgggc tgaaagaac 19

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaaggtgacc aagttcatgc taccttgtca tccatgcctt t 41

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaaggtcgga gtcaacggat taccttgtca tccatgcctt g 41

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctggaaacca ctggtcccaa 20

Claims

1.一种用于鉴定或辅助鉴定待测小麦籽粒蛋白含量的方法，其特征在于，具体步骤如下：

1）以所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用KASP标记引物组进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，以及

2）根据荧光信号扫描结果判断位于4A染色体612113696处的wsnp_Ex_c24474_33721784位点基因型为T或C中的哪一种，判断位于5B染色体20832543处的wsnp_BE499835B_Ta_2_5位点基因型为T或G中哪一种；如果待测小麦wsnp_Ex_c24474_33721784位点和wsnp_BE499835B_Ta_2_5位点的基因型均为 T时，则认为其籽粒蛋白含量低于对应位点其他基因型的小麦；

所述KASP标记引物组包括核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1-SEQ IDN.6所示的引物AlleleFAM1、AlleleHEX2、Common1、AlleleFAM2、AlleleHEX2和Common2。