CN112921110A

CN112921110A - 一种与小麦加工品质相关的kasp标记引物及应用

Info

Publication number: CN112921110A
Application number: CN202110292426.9A
Authority: CN
Inventors: 祁鹏飞; 王琰; 陈庆; 石晓丽; 郭祯儒; 吴汪; 李庆成; 王际睿; 江千涛; 成国跃; 蒲至恩; 魏育明; 郑有良
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2021-03-18
Filing date: 2021-03-18
Publication date: 2021-06-08

Abstract

本发明公开了一种与小麦加工品质相关的KASP标记引物及应用，所述的KASP标记引物包括正向引物F1、正向引物F2和反向引物R；该分子标记能有效的对Q和Q^c1SNP变异位点进行基因分型，可以更加高效的在实验室条件下对待测材料进行筛选和鉴定。与Q相比，Q^c1可使小麦籽粒蛋白含量提高，面包体积增大。本发明的KASP标记可用于替代或辅助目前实验室使用的PCR扩增、测序鉴定Q^c1SNP等位基因的方法，从而提高材料选育的效率，降低实验成本，为小麦加工品质的改良提供分子辅助选择手段。

Description

一种与小麦加工品质相关的KASP标记引物及应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种与小麦加工品质相关的KASP标记引物及应用，具体为一种检测小麦加工品质相关的Q等位基因Q^c1 SNP变异位点的KASP标记引物及应用。

背景技术

小麦(Triticum aestivum L.)是世界上分布最广、种植面积最大、栽培时间最长且营养丰富的粮食作物之一。小麦籽粒含有丰富的植物蛋白，是人类最主要的蛋白质来源之一。我国作为最大的小麦生产国和消费国，小麦的生产在保证国家粮食安全和人民生活水平具有重要作用。小麦的穗与其产量、品质密切相关。小麦穗的研究对有效提高小麦产量和品质具有重要价值。

小麦的穗密度受多个遗传位点控制，其中Q(WAP2)是编码一个AP2家族的转录因子。研究表明，Q参与调控许多重要农艺性状，如：脱粒性、株高、穗型等。申请人利用EMS(甲基磺酸乙酯)化学诱变处理普通小麦蜀麦482获得了一份穗密度增大，矮杆的小麦突变体材料，并利用遗传定位方法结合分子克隆技术证明突变体材料的5AL染色体的Q基因第十外显子中存在一个SNP等位变异，新的Q等位基因被命名为Q^c1。突变体中Q^c1基因表达使小麦的穗密度增加，株高显著降低，最终提高了小麦籽粒的蛋白质含量和面团品质。因此，Q等位基因Q^c1在小麦品质育种中具有重要的潜在价值。

目前，对Q^c1基因的筛选、鉴定主要通过：设计克隆Q基因的特异性引物，提取基因组DNA，进行PCR扩增，送生物公司测序，分析结果，鉴定基因型。该方法实验周期较长，而且大量的材料鉴定需要高昂的经费投入。因此，申请人开发了一种可以快速、准确且价格合理的分子标记进行检测。

分子标记辅助选择育种是指利用与目标性状候选基因连锁的分子标记，通过分子生物学技术检测候选基因，达到对目的性状选择的目的。其操作简单，不受环境及环境互作的影响，能够快速高效的选育出目标材料。SNP(单核苷酸的多态性)是指在基因组上单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。KASP(竞争性等位基因特异性PCR)是由LGC Genomics公司开发的SNP基因分型技术。该技术是基于正向引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型。该项技术只要合成一对添加有特异通用荧光探针的正向PCR引物以及一个反向通用引物，就可以对SNP位点进行分型。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测小麦加工品质相关的Q等位基因Q^c1 SNP变异位点的方法。通过检测小麦加工品质相关的Q等位基因的SNP变异位点基因型，进而实现快速鉴定待测材料，能提高待测小麦材料选育效率，降低实验成本，也可用于与PCR测序联合使用达到辅助鉴定待测小麦Q等位变异位点的目的，可提高鉴定结果的准确性。

为了达到上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：

一种与小麦加工品质相关的KASP标记引物，所述的KASP标记引物包括正向引物F1、正向引物F2和反向引物R。

具体的：

所述的正向引物F1为：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTTGCTTTACGCTGCAGCATC，(下划线表示FAM KASP荧光集团)；

所述的正向引物F2为：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTTGCTTTACGCTGCAGCATT，(下划线表示HEX KASP荧光集团)；

所述的反向引物R为：GCGGCGGTAGAAAATCCTG。

在本发明的另一方面，提供了检测具有优良加工品质小麦材料的方法，通过检测小麦加工品质相关的Q等位基因Q^c1的基因型，包括以下步骤：

4)提取待测小麦样品的DNA；

5)取模板DNA，利用正向引物F1、正向引物F2以及反向引物R进行PCR扩增；

6)采用Bio-Rad CFX96^TM PCR扩增仪扩增PCR产物；

4)用生物学软件对PCR扩增产物进行基因分型。

进一步的，PCR反应程序为：95℃预变性15min；第一步扩增反应：95℃变性20s，68℃梯度退火并延伸60s，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低1℃；第二步扩增反应，94℃变性20s，57℃退火并延伸60s，32个循环；15℃保存。

进一步的，根据荧光信号值判断基因型，等位基因Q^c1的SNP基因型为TT。具体判断方法为：FAM荧光型号携带基因型CC，HEX荧光信号携带基因型TT，携带两种荧光信号携带基因型CT。

在本发明的另一方面，提供一种与小麦加工品质相关的Q等位基因Q^c1的SNP位点，所述SNP位点位于小麦中5AL染色体的Q基因第十外显子，该位点基因型为TT。

在本发明的另一方面，提供了一种检测小麦加工品质相关的Q等位基因Q^c1的试剂盒，该试剂盒包含上述KASP标记引物。

在本发明的另一方面，提供了所述KASP标记引物在检测小麦加工品质相关的Q等位基因Q^c1中的应用，通过检测小麦中SNP等位位点基因型是TT、CC或TC，具体表现为：

(a)鉴定或辅助鉴定待测小麦加工品质相关的Q等位基因Q^c1SNP变异位点；

(b)基于鉴定或辅助鉴定待测小麦加工品质相关的Q等位基因Q^c1 SNP变异位点创制优良小麦加工品质材料；

(c)小麦品质育种的应用。

本发明的有益效果为：

本发明基于待测小麦加工品质相关的Q等位基因Q^c1 SNP变异位点开发了KASP标记专用引物。通过实验验证，本发明的KASP标记引物可用于鉴定待测小麦加工品质相关的Q等位基因Q^c1 SNP变异位点为CC、TT还是CT，根据待测小麦的SNP变异位点基因型筛选加工品质优良的小麦材料。KASP标记在鉴定目标小麦材料过程中起到提高材料选育的效率，降低实验成本的效果，为小麦加工品质的改良提供有效的分子辅助选择手段。

附图说明

图1为本发明小麦加工品质相关的Q等位基因Q^c1 SNP变异位点的基因组图；ATG表示起始密码子，TGA表示终止密码子，黑色矩形表示外显子，灰色矩形表示内含子；

图2为本发明蜀麦482和突变体的面包体积测定；

图3为本发明待测小麦加工品质相关的Q等位基因Q^c1 SNP变异位点的KASP标记检测结果；

图4为本发明PCR测序鉴定待测小麦加工品质相关的Q等位基因Q^c1 SNP变异位点的波峰图；(1)突变型，(2)蜀麦482，(3)杂合型，红色箭头表示SNP变异位点。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

实验材料种植在四川农业大学温江实验田。

提取突变体、蜀麦482和分离群体F_2-3单株的基因组DNA，将10个随机选择的F₂单株的基因组DNA进行混合，构建DNA混池。将实验材料送至康普森生物技术公司进行90K SNP芯片分型，并利用Genome Studio v1.0软件进行多态性分析。

根据初定位结果，结合已公布的中国春和乌拉尔图小麦的基因组数据对候选基因组所在染色体的物理区间进行评估，获得候选区域在已公布的小麦基因组中对应的scaffold序列；利用微卫星热点鉴定软件SSRIT对获得的scaffold序列进行SSR热点区域的预测，设计特异性引物，用亲本和近等基因系对引物的多态性进行筛选，获得与表型紧密连锁的SSR分子标记用于候选基因的遗传定位。

根据NCBI中公布的Q基因序列设计引物，并进行克隆测序，定位出待测小麦中5AL染色体的Q基因第十外显子中存在一个SNP等位位点(图1)。

对蜀麦482和突变体的加工品质进行测定(结果详见论文https://doi.org/10.1534/g3.117.300562)：与Q(蜀麦482)相比，Q^c1(突变体)显著提高小麦籽粒蛋白含量(表1)，明显增大面包体积(图2)，对提高小麦加工品质有着显著正向作用。

表1 Q(蜀麦482)与Q^c1(突变体)品质参数

实施例2检测方法的建立

由于Q等位基因Q^c1 SNP变异位点与小麦加工品质密切相关。本发明针对SNP位点开发的KASP标记专用引物由2条上游引物即引物F1和引物F2和1条下游引物即引物R组成。KASP标记专用引物序列如下：

正向引物F1为：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTTGCTTTACGCTGCAGCATC，(下划线表示FAM KASP荧光集团)；

正向引物F2为：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTTGCTTTACGCTGCAGCATT，(下划线表示HEX KASP荧光集团)；

反向引物R为：GCGGCGGTAGAAAATCCTG。

采用Bio-Rad CFX96^TMPCR扩增仪扩增产物基因型；

PCR反应程序为：95℃预变性15min；第一步扩增反应：95℃变性20s，68℃梯度退火并延伸60s，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低1℃；第二步扩增反应，94℃变性20s，57℃退火并延伸60s，32个循环；15℃保存。

利用生物学软件对PCR扩增产物进行基因分型。

实施例3

随机选取突变体和蜀麦482的杂交后代F₂，在垫有5ml蒸馏水润湿过的滤纸培养皿中进行麦苗发芽，并提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用上述建立的KASP标记检测方法进行SNP变异位点的检测。结果如图3所示，为两个标记的基因分型鉴定结果。

为了验证结果的可靠性，采用Q基因的特异性引物进行PCR扩增，PCR原液送至生物公司进行测序，在DNAMAN软件中分析序列结果(图4)。KSAP检测结果与PCR测序结果一致。说明本发明中KASP标记确实适用于检测待测小麦加工品质相关的Q等位基因Q^c1SNP变异位点。

结果表明，上述KASP标记可以快速、准确地对待测材料小麦加工品质性状进行鉴定，为小麦加工品质的改良提供分子辅助选择手段。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种与小麦加工品质相关的KASP标记引物及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaaggtgacc aagttcatgc tgttgcttta cgctgcagca tc 42

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaggtcgga gtcaacggat tgttgcttta cgctgcagca tt 42

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcggcggtag aaaatcctg 19

Claims

1.一种与小麦加工品质相关的KASP标记引物，其特征在于，所述的KASP标记引物包括正向引物F1、正向引物F2和反向引物R，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～3所示。

2.一种检测小麦加工品质的方法，其特征在于，检测小麦加工品质相关的Q等位基因Q^c1的SNP基因型，包括以下步骤：

1)提取待测小麦样品的DNA；

2)取模板DNA，利用权利要求1正向引物F1、正向引物F2以及反向引物R进行PCR扩增；

3)采用Bio-Rad CFX96^TM PCR扩增仪扩增PCR产物；

4)用生物学软件对PCR扩增产物进行基因分型。

3.根据权利要求2所述的一种检测小麦加工品质的方法，其特征在于，PCR反应程序为：95℃预变性15min；第一步扩增反应：95℃变性20s，68℃梯度退火并延伸60s，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低1℃；第二步扩增反应，94℃变性20s，57℃退火并延伸60s，32个循环；15℃保存。

4.根据权利要求2所述的一种检测小麦加工品质的方法，其特征在于，根据荧光信号值判断基因型，等位基因Q^c1的SNP基因型为TT。

5.一种与小麦加工品质相关的Q等位基因Q^c1的SNP位点，其特征在于，所述SNP位点位于小麦中5AL染色体的Q基因第十外显子，该位点基因型为TT。

6.一种检测小麦加工品质相关的Q等位基因Q^c1的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括包含权利要求所述KASP标记引物。

7.权利要求1所述KASP标记引物在检测小麦加工品质相关的Q等位基因Q^c1中的应用。