CN110484651B - 一种小麦产量相关基因TaNRT2-6D中的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小麦产量相关基因TaNRT2‑6D中的分子标记及其应用，包括鉴定小麦产量性状的方法：检测待测小麦的单倍型，Hap‑6D‑1和Hap‑6D‑2单倍型小麦的产量高于或候选高于Hap‑6D‑3单倍型小麦，Hap‑6D‑1单倍型小麦的产量与Hap‑6D‑2单倍型小麦的产量差异不显著；各单倍型依据小麦基因组DNA中对应于序列表中SEQ ID No.1的第1918和2002位的核苷酸区分。实验证明，小麦这三种单倍型与产量相关，在培养高产小麦品种或研究中具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，尤其涉及一种小麦产量相关基因TaNRT2-6D中的分子标记及其应用。
背景技术
我国是小麦生产和消费的第一大国，小麦生产与保障国家粮食安全密切相关。提高小麦产量是育种学家的目标之一。如今育种学家以常规育种方法已取得很大成就，但常规育种依赖表型筛选，耗时耗力，具有一定局限性。随着分子生物技术的不断发展，功能分子标记的开发为提高小麦育种效率奠定基础，分子标记辅助育种为小麦育种改良提供了一条高效便捷的途径。
NRT2s属于高亲和硝酸盐转运蛋白，研究发现NRT2s对作物的根系发育和产量具有调节作用。TaNRT2-6D编码蛋白是小麦中的NRTs家族成员之一，该基因的分子标记开发，将对小麦优异产量株系的选择具有重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何鉴定或者辅助鉴定小麦的产量性状。
本发明提供dCAPS-1918和/或dCAPS-2002在鉴定或者辅助鉴定小麦产量性状中的应用，其中，所述dCAPS-1918为小麦基因组的一个SNP位点，所述dCAPS-1918位于小麦基因组中SEQ ID No.1的第1918位核苷酸，其为T或C；所述dCAPS-2002为小麦基因组的一个SNP位点，所述dCAPS-2002位于小麦基因组中SEQ ID No.1的第2002位核苷酸，其为C或T。
本发明还要求保护检测小麦基因组中dCAPS-1918的多态性或基因型的物质和/或检测小麦基因组中dCAPS-2002的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定小麦产量性状产品中的应用；所述dCAPS-1918为小麦基因组的一个SNP位点，所述dCAPS-1918位于小麦基因组中SEQ ID No.1的第1918位核苷酸，其为T或C；所述dCAPS-2002为小麦基因组的一个SNP位点，所述dCAPS-2002位于小麦基因组中SEQ ID No.1的第2002位核苷酸，其为C或T。
进一步，所述检测小麦基因组中dCAPS-1918的多态性或基因型的物质为扩增包括dCAPS-1918在内的小麦基因组DNA片段的引物对；所述检测小麦基因组中dCAPS-2002的多态性或基因型的物质为扩增包括dCAPS-2002在内的小麦基因组DNA片段的引物对。
本发明提供一种鉴定或辅助鉴定小麦产量性状的方法，为I或II：
I、包括步骤P1)和P2)：
P1)检测待测小麦的单倍型，所述单倍型为Hap-6D-1、Hap-6D-2和Hap-6D-3，所述单倍型为Hap-6D-1的小麦中所述dCAPS-1918的基因型为T和所述dCAPS-2002的基因型为C；所述单倍型为Hap-6D-2的小麦中所述dCAPS-1918的基因型为T和所述dCAPS-2002的基因型为T；所述单倍型为Hap-6D-3的小麦中所述dCAPS-1918的基因型为C和所述dCAPS-2002的基因型为C；
P2)根据待测小麦的单倍型确定待测小麦的产量性状：Hap-6D-1和Hap-6D-2单倍型小麦的产量高于或候选高于Hap-6D-3单倍型小麦，Hap-6D-1单倍型小麦的产量与Hap-6D-2单倍型小麦的产量差异不显著；
II、包括步骤Q1)和Q2)：
Q1)检测待测小麦的中所述的dCAPS-1918的基因型；
Q2)根据待测小麦的dCAPS-1918的基因型确定待测小麦的产量性状：所述dCAPS-1918为T时的小麦的产量高于或候选高于所述dCAPS-1918为C的小麦的产量。
进一步，所述步骤P1)中检测待测小麦的单倍型具体包括：利用引物对TaNRT2-6D-Primer对所述待测小麦的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR产物；对所述PCR产物进行测序获得所述待测小麦基因组DNA中对应于序列表中SEQ ID No.1的第1918和2002位的核苷酸确定所述待测小麦的单倍型；
所述PCR产物对应于序列表中SEQ ID No.1的第1918和2002位的核苷酸分别为T和C的待测小麦为Hap-6D-1单倍型小麦；所述PCR产物对应于序列表中SEQ ID No.1的第1918和2002位的核苷酸分别为T和T的待测小麦为Hap-6D-2单倍型小麦；所述PCR产物对应于序列表中SEQ ID No.1的第1918和2002位的核苷酸分别为C和C的待测小麦为Hap-6D-3单倍型小麦；
所述引物对TaNRT2-6D-Primer由名称分别为TaNRT2-6D-Primer-F和TaNRT2-6D-Primer-R的单链DNA组成：
所述TaNRT2-6D-Primer-F为序列表中SEQ ID No.6所示的单链DNA；
所述TaNRT2-6D-Primer-R为序列表中SEQ ID No.7所示的单链DNA。
其中，所述检测待测小麦的单倍型包括如下步骤：
A1)以所述待测小麦的基因组DNA为模板，分别用引物对TaNRT2-Primer-KpnI和TaNRT2-Primer-BssHII进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物A和PCR扩增产物B，其中，所述TaNRT2-Primer-KpnI由名称分别为TaNRT2-Primer-KpnI-F和TaNRT2-Primer-KpnI-R的单链DNA组成，所述TaNRT2-Primer-KpnI-F为序列表中SEQ ID No.2所示的单链DNA；所述TaNRT2-Primer-KpnI-R为序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA；
所述TaNRT2-Primer-BssHII由名称分别为TaNRT2-Primer-BssHII-F和TaNRT2-Primer-BssHII-R的单链DNA组成，所述TaNRT2-Primer-BssHII-F为序列表中SEQ ID No.4所示的单链DNA；所述TaNRT2-Primer-BssHII-R为序列表中SEQ ID No.5所示的单链DNA；
A2)用KpnI酶切所述PCR扩增产物A，得到酶切产物K；用BssHII酶切所述PCR扩增产物B，得到酶切产物B；检测所述酶切产物K和所述酶切产物B的大小，确定所述待测小麦的单倍型：
若所述酶切产物K含有大小为216bp的DNA片段且不含有大小分别为193bp和23bp的DNA片段，且所述酶切产物B含有大小分别为260bp和24bp的DNA片段且不含有大小为284bp的DNA片段，则所述待测小麦为Hap-6D-1单倍型小麦；
若所述酶切产物K含有大小为216bp的DNA片段且不含有大小分别为193bp和23bp的DNA片段，且所述酶切产物B含有大小为284bp的DNA片段且不含有大小分别为260bp和24bp的DNA片段，则所述待测小麦为Hap-6D-2单倍型小麦；
若所述酶切产物K含有大小为193bp和23bp的DNA片段且不含有大小为216bp的DNA片段，且所述酶切产物B含有大小分别为260bp和24bp的DNA片段且不含有大小为284bp的DNA片段，则所述待测小麦为Hap-6D-3单倍型小麦。
其中，所述步骤Q1)中检测待测小麦的所述的dCAPS-1918的基因型包括如下步骤：
B1)以所述待测小麦的基因组DNA为模板，用所述TaNRT2-Primer-KpnI进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A；
B2)用KpnI酶切所述PCR扩增产物A，得到酶切产物K；检测所述酶切产物K的大小，确定所述待测小麦的所述的dCAPS-1918的基因型：
所述酶切产物K含有大小为216bp的DNA片段且不含有大小分别为193bp和23bp的DNA片段，则所述待测小麦的所述的dCAPS-1918的基因型为T；
所述酶切产物K含有大小分别为193bp和23bp的DNA片段且不含有大小为216bp的DNA片段，则所述待测小麦的所述的dCAPS-1918的基因型为C。
本发明还提供为下述M1)或M2)或M3)的产品：
M1)引物对TaNRT2-6D-Primer；
M2)TaNRT2-Primer-KpnI和所述的TaNRT2-Primer-BssHII组成的引物组合物；
M3)包括TaNRT2-Primer-KpnI的成套试剂。
本发明还要求保护下述任一应用：
X1)、上述任一所述的方法或所述的产品在小麦育种中的应用；
X2)、上述任一所述的方法或所述的产品在鉴定或辅助鉴定小麦产量性状中的应用；
X3)所述SNP位点dCAPS-1918和/或dCAPS-2002在小麦育种或选育产量高的小麦中的应用；
X4)检测小麦基因组中dCAPS-1918的多态性或基因型的物质和/或检测小麦基因组中dCAPS-2002的多态性或基因型的物质在小麦育种或选育产量高的小麦中的应用；
X5)检测小麦基因组中dCAPS-1918的多态性或基因型的物质和/或检测小麦基因组中dCAPS-2002的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定小麦产量相关性状的产品中的应用；
X6)检测小麦基因组中dCAPS-1918的多态性或基因型的物质和/或检测小麦基因组中dCAPS-2002的多态性或基因型的物质在制备小麦育种的产品中的应用；
X7)检测小麦基因组中dCAPS-1918的多态性或基因型的物质和/或检测小麦基因组中dCAPS-2002的多态性或基因型的物质在制备选育产量高的小麦的产品中的应用。
本发明还提供一种小麦育种方法，为V或VI：
V、按照上述所述检测待测小麦的单倍型的方法检测小麦的单倍型，选择Hap-6D-1单倍型的小麦和/或Hap-6D-2单倍型的小麦作为亲本进行育种；所述单倍型为Hap-6D-1的小麦中所述dCAPS-1918的基因型为T和所述dCAPS-2002的基因型为C；所述单倍型为Hap-6D-2的小麦中所述dCAPS-1918的基因型为T和所述dCAPS-2002的基因型为T；
VI、按所述检测小麦的dCAPS-1918基因型的方法检测小麦的dCAPS-1918的基因型，选择所述dCAPS-1918为T的小麦作为亲本进行育种。
所述小麦育种的目的可为选育高产量小麦。
本发明中，所述小麦产量性状可体现在小麦每穗小穗数上。
本发明中，所述小麦可为32份小麦以及表2中的任一小麦材料或其后代，所述32份小麦材料为PANDAS、安85中124-1、偃展1号、霸王鞭、北京10号、北京14号、沧州小麦、长武131、长6878、大荔1号、单R8093、丰抗13、冀麦41、冀麦6号、晋2148-7、京核8922、临抗5108、白齐麦、昌乐5号、红和尚、北京8686、04-044、04-030、春229th-25、紫杆白芒先、京品10号、春049th-5-1、春459th-50-1、内乡188、京411、中国春和白糙麦。
本发明通过对小麦自然变异群体中TaNRT2-6D基因的遗传变异分析，发现有2个SNP，分别位于SEQ ID No.1的第1918和2002位，这2个SNP存在三种单倍型：单倍型Hap-6D-1(2个SNP分别为T和C)、单倍型Hap-6D-2(2个SNP分别为T和T)和单倍型Hap-6D-3(2个SNP分别为C和C)。通过关联分析证明及自然群体验证，这三种单倍型的纯合类型中，Hap-6D-1的小麦产量显著高于Hap-6D-3，Hap-6D-2的小麦产量与Hap-6D-1和Hap-6D-3无显著差异。SEQID No.1的第1918位核苷酸也与小麦产量相关，SEQ ID No.1的第1918位核苷酸为T的小麦产量高于该位点为C的小麦。通过实验证明：采用检测本发明的小麦单倍型和基因组中对应于序列表中SEQ ID No.1的第1918位的核苷酸，可快速准确的找到产量优异的小麦。本发明为小麦分子标记辅助选择育种提供了一个新的方法，在培养高产小麦品种或研究中具有重要意义。
附图说明
图1为TaNRT2-6D基因SEQ ID No.1中SNP示意图及本发明中两个标记的部分检测结果。a为TaNRT2-6D基因SEQ ID No.1结构示意图；b为TaNRT2-6DSEQ ID No.1中SNP及其位点示意图；c为根据第1918bp位点设计的dCAPS-1918分子标记部分检测结果，Hap-6D-1和Hap-6D-2泳道的电泳条带大小为216bp，Hap-6D-3泳道的电泳条带大小分别为193bp和23bp，由于电泳时间较长，23bp的小片段条较为模糊；d为根据第2002bp位点设计的dCAPS-2002分子标记部分检测结果，Hap-6D-2泳道的电泳条带大小为284bp，Hap-6D-1和Hap-6D-3泳道的电泳条带大小分别为260bp和24bp，由于电泳时间较长，24bp的小片段条较为模糊。
图2为小麦自然变异群体自然群体1中TaNRT2-6D基因三种单倍型每穗小穗数性状统计结果。其中，E1表示在顺义种植的雨养热处理的小麦，E2表示在顺义种植的雨养处理的小麦，E3表示在顺义种植的热处理的小麦，E4表示在顺义种植的正常灌溉的小麦。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
实施例1、产量相关基因TaNRT2-6D基因多态位点及单倍型的获得
一、TaNRT2-6D基因多态位点及单倍型的获得
1、TaNRT2-6D基因多态位点的获得
(1)根据小麦TaNRT2-6D基因组DNA序列特点设计其基因组的特异引物，引物序列如下：
TaNRT2-6D-Primer-F(正向引物)：5′-GTAAGAAACCTGAAGCTCAAA-3′(序列表中SEQID No.6)；
TaNRT2-6D-Primer-R(反向引物)：5′-ACGAAACCGTACAATTCATT-3′(序列表中SEQID No.7)。
TaNRT2-6D-Primer-F和TaNRT2-6D-Primer-R的识别序列分别位于TaNRT2-6D基因的上游和下游。
(2)分别以32份小麦材料(均来自于国家种质资源库)的基因组DNA为模板，采用步骤(1)的引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，然后对得到的PCR扩增产物进行测序和序列比对。
所用PCR扩增体系(20μL)均为：ddH2O 11.0μL、5×PCR buffer 4.0μL、正向引物(5μmol/L)和反向引物(5μmol/L)各1μL、dNTPs(2.5mmol/L)1.6μL、transfastpfu酶(5U)0.4μL、模板DNA(20ng/μL)1μL。5×PCR buffer和transfastpfu酶(5U)均为北京全式金生物技术有限公司产品。
PCR扩增条件为：95℃2min；95℃1min,65℃30s,72℃40s,35次循环；72℃10min，4℃保存。
通过序列分析发现：在TaNRT2-6D序列中有2个SNP位点(图1中a和b)，分别为TaNRT2-6D基因的第1918位(存在T和C多态性)和第2002位(存在C和T多态性)。SEQ ID No.1中Y代表为C/T。
2、TaNRT2-6D基因单倍型的获得
通过序列分析发现：TaNRT2-6D基因的2个SNP位点在小麦自然变异群体中存在三种单倍型，分别将其命名为单倍型Hap-6D-1、单倍型Hap-6D-2和单倍型Hap-6D-3；每个单倍型在SEQ ID No.1的第1918位和第2002位的核苷酸分别如表1所示。
表1、每个单倍型在各SNP位点处的核苷酸
| 位置 | 1918 | 2002 |
| Hap-6D-1 | T | C |
| Hap-6D-2 | T | T |
| Hap-6D-3 | C | C |
在这32份小麦材料中还发现，表1中单倍型Hap-6D-1的2个SNP位点的核苷酸存在连锁现象，单倍型Hap-6D-2的2个SNP位点的核苷酸存在连锁现象，单倍型Hap-6D-3的2个SNP位点的核苷酸也存在连锁现象。
这32份小麦材料的名称具体如下：PANDAS、安85中124-1、偃展1号、霸王鞭、北京10号、北京14号、沧州小麦、长武131、长6878、大荔1号、单R8093、丰抗13、冀麦41、冀麦6号、晋2148-7、京核8922、临抗5108、白齐麦、昌乐5号、红和尚、北京8686、04-044、04-030、春229th-25、紫杆白芒先、京品10号、春049th-5-1、春459th-50-1、内乡188、京411、中国春、白糙麦(上述材料均来自国家种质资源库)。
二、分子标记的获得及其在单倍型鉴定中的应用
1、分子标记的获得
将序列表中SEQ ID No.1所示的TaNRT2-6D基因的第1918位和第2002位所示的SNP位点，分别记为dCAPS-1918标记和dCAPS-2002标记，并设计能检测各标记的引物，检测dCAPS-1918标记的引物(引物对TaNRT2-Primer-KpnI)如下：
TaNRT2-Primer-KpnI-F(正向引物)：5′-CTGATGCCACCGAAGAGGGGTAC-3′(SEQ IDNo.2)；
TaNRT2-Primer-KpnI-R(反向引物)：5′-ACGAAACCGTACAATTCATT-3′(SEQ IDNo.3)。
检测dCAPS-2002标记的引物(引物对TaNRT2-Primer-BssHII)如下：
TaNRT2-Primer-BssHII-F(正向引物)：5′-GTGCAGGGCTGACGCAACTTCTT-3′(SEQ IDNo.4)；
TaNRT2-Primer-BssHII-R(反向引物)：5′-AAGGATGACGTTGCGCCTGGCGC-3′(SEQ IDNo.5)。
2、小麦单倍型的鉴定
(1)在待测小麦为TaNRT2-6D基因是纯合基因型的小麦时，利用步骤1的分子标记与引物鉴定待测小麦单倍型的步骤如下：
以待测小麦基因组DNA为模板，分别采用步骤1的检测dCAPS-1918标记和dCAPS-2002标记的引物进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物A和PCR扩增产物B。PCR扩增产物A的核苷酸序列为SEQ ID No.1的第1895-2110位，PCR扩增产物B的核苷酸序列为SEQ ID No.1的第1742-2025位。
PCR扩增的体系(10μL)均为：ddH2O 5.0μL、5×PCR buffer 2.0μL、正向引物(5μmol/L)和反向引物(5μmol/L)各0.5μL、dNTP(2.5mmol/L)0.8μL、transfastpfu酶(5U)0.2μL、模板DNA(20ng/μL)1μL。
PCR扩增条件为：95℃2min；95℃1min,60℃30s,72℃10s,35次循环；72℃10min，4℃保存。
(2)用限制性内切酶KpnI酶切步骤(1)获得的PCR扩增产物A，得到酶切产物K，部分酶切产物K的电泳检测结果如图1中c。若酶切产物K为216bp，则表明该待测小麦基因组DNA中对应于序列表中SEQ ID No.1的第1918位核苷酸为T，即T纯合，该待测小麦的单倍型为Hap-6D-1和Hap-6D-2；若酶切产物K为193bp和23bp，则表明该待测小麦基因组DNA中对应于序列表中SEQ ID No.1的第1918位核苷酸为C，即C纯合，该待测小麦的单倍型为Hap-6D-3；
(3)用限制性内切酶BssHII酶切步骤(1)获得的PCR扩增产物B，得到酶切产物B，部分酶切产物B的电泳检测结果如图1中d。若酶切产物S为284bp，则表明该待测小麦基因组DNA中对应于序列表中SEQ ID No.1的第2002位核苷酸为T，即T纯合，该待测小麦的单倍型为Hap-6D-2；若酶切产物B为260bp和24bp，则表明该待测小麦基因组DNA中对应于序列表中SEQ ID No.1的第1227位核苷酸为C，即C纯合，该待测小麦的单倍型为Hap-6D-1或单倍型Hap-6D-3。
因此可以按照如下方法对待测小麦进行基因分型，判断待测小麦的单倍型为Hap-6D-1、Hap-6D-2还是Hap-6D-3：
1)提取待测小麦的基因组DNA；
2)以步骤1)的基因组DNA为模板，分别用引物TaNRT2-Primer-KpnI和TaNRT2-Primer-BssHII进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物A和PCR扩增产物B；
3)用KpnI酶切PCR扩增产物A，得到酶切产物K；用BssHII酶切PCR扩增产物B，得到酶切产物B；
检测酶切产物K和酶切产物B的大小(可通过电泳和测序进行)，若酶切产物K仅含有大小为216bp的条带，且酶切产物B仅含有大小为260bp和24bp的条带，则待测小麦的单倍型为Hap-6D-1；
若酶切产物K仅含有大小为216bp的条带，且酶切产物B仅含有大小为284bp的条带，则待测小麦的单倍型为Hap-6D-2；
若酶切产物K仅含有大小为193bp和23bp的条带，且酶切产物B仅含有大小为260bp和24bp的条带，则待测小麦的单倍型为Hap-6D-3。
实施例2、小麦单倍型与产量的关联分析
一、自然群体1的基因分型及其与产量的关联分析
采用实施例1中的dCAPS-1918标记和dCAPS-2002标记对自然群体1(表2)进行基因分型，并对单倍型与每穗小穗数性状进行关联分析。具体步骤如下：
1、单倍型的检测
以323份六倍体小麦组成的自然群体1中各小麦作为待测小麦按照实施例1中的方法进行分型，判断每个小麦个体的单倍型为单倍型Hap-6D-1、单倍型Hap-6D-2还是单倍型Hap-6D-3。自然群体1中各个小麦品种均来自于国家种质资源库。单倍型检测结果如表2所示，且各小麦的PCR扩增产物A的核苷酸序列均为SEQ ID No.1的第1895-2110位，PCR扩增产物B的核苷酸序列均为SEQ ID No.1的第1742-2025位。然后利用实施例1的TaNRT2-6D-Primer-F和TaNRT2-6D-Primer-R组成的引物对分别对各小麦的基因组DNA进行扩增，扩增体系和条件均同实施例1，结果显示，各小麦的PCR产物序列均为序列表中SEQ ID No.1，且各小麦的表1中的2个SNP位点的核苷酸均符合表1，说明可以利用本发明的dCAPS-1918标记和dCAPS-2002标记检测单倍型Hap-6D-1、单倍型Hap-6D-2和单倍型Hap-6D-3小麦。
表2、自然群体1各个小麦单倍型统计结果
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2、单倍型与产量的关联分析
在中国农业科学院作物科学研究所顺义实验基地分别在四种条件下种植小麦自然群体1，小麦收获后调查各个小麦的每穗小穗数，计算每个环境条件下的平均每穗小穗数。用Tassel2.1软件利用GLM模型对两种标记、三种单倍型和每穗小穗数性状进行关联分析。
自然群体1形成的两种标记(dCAPS-1918和dCAPS-2002，即序列表中SEQ ID No.1的第1918位和第2002位的核苷酸)与产量相关性状(每穗小穗数)关联分析结果如表3，dCAPS-1918与小麦每穗小穗数相关，基因组中对应于序列表中SEQ ID No.1的第1918位为T的小麦的每穗小穗数显著高于该位点为C的小麦，表明该标记可以用于选育具有优异产量性状(每穗小穗数)的小麦品种。
自然群体1形成的三种单倍型小麦产量相关性状(每穗小穗数)统计结果如表4，单倍型Hap-6D-1和Hap-6D-2小麦的每穗小穗数性状均高于单倍型Hap-6D-3，单倍型Hap-6D-1和Hap-6D-2小麦的每穗小穗数性状无显著性差异(图2)。说明本发明的三种单倍型和小麦每穗小穗数相关，可以用于选育具有优异产量性状(每穗小穗数高)的小麦品种。
表3、小麦自然群体1中TaNRT2-6D标记与每穗小穗数关联分析结果
注：n.s.，表示序列1的第1918位或第2002位的两种核苷酸与产量性状之间相关不显著。雨养热处理是指仅靠雨水灌溉且高温处理(中午最高温度40-55度)，热处理是指高温处理(中午最高温度40-55度)，雨养处理是指仅靠雨水灌溉。
表4、小麦自然群体1中TaNRT2-6D三种单倍型每穗小穗数的统计结果
| Hap-6D-1 | Hap-6D-2 | Hap-6D-3 | |
| 雨养热处理 | 19.7±0.1a | 19.7±0.2a | 18.9±0.3b |
| 雨养处理 | 19.4±0.1a | 19.5±0.2a | 18.4±0.2b |
| 热处理 | 20.0±0.1a | 20.0±0.2a | 19.1±0.2b |
| 正常灌溉 | 20.1±0.1a | 20.2±0.2a | 19.2±0.2b |
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 一种小麦产量相关基因TaNRT2-6D中的分子标记及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2110
<212> DNA
<213> Triticum aestivum
<400> 1
gtaagaaacc tgaagctcaa actgttcatg gaaaatggga gactgacacc gcaggtaact 60
tgcaacgttc agaaaccctg tcactgtctg tccagttcag acactcgatt ttgaacacgc 120
atcttgtggg acccacgtgc tgagctgtgc atattctgat ctgatccttg gcccatccca 180
cgggccgagg gcgaggagat gcgcgcggcg acgaggttat tcgtcatcat cattctctct 240
cgactccgtt gtacaaccgc tgtttaaacc tttactaatc ccaagttgca gccatgattc 300
cgtcagatgc aataatgcat tcttctgtcc gtctgcctgt ctatcttacc cttcagctga 360
tcaagagagg tgcatgttga tcccaatgtc aactcctacg ttgtataaat acccgataga 420
tggggtttca aagcaccaaa ccacagccat tagcacctcc tagttgccac tgcagctaat 480
caagcaagct agcaacaagc ctccaaggag caagcagaga ggaagcctag ctcaagcaag 540
gtcgaaatgg aggtggaggc cggcgcccat ggcgacacgg cggcgagcaa gttcacgctg 600
cccgtggact ccgagcacaa ggccaagtcc ttcaggctct tctccttcgc caacccccac 660
atgcgcacct tccacctctc ctggatctcc ttcttcacct gcttcgtctc cacctttgcc 720
gcggcgccgc tcgtgcccat catccgtgac aacctcaacc tcgccaaggc cgacataggg 780
aatgccggtg tggcatctgt gtctgggtcc atcttctcca ggcttgccat gggtgccatc 840
tgcgaccttt tagggccgcg gtatggctgc gccttcctcg tcatgctctc agcacccact 900
gtgttttgca tggctgtcat cgacgatgcg tcaggctaca tcgccgtacg cttcctcatt 960
ggcttctccc ttgccacctt cgtgtcgtgc cagtactgga tgagcaccat gttcaacagt 1020
aaaatcatcg gcactgtgaa tggccttgcc gccggctggg gcaacatggg cggtggtgcc 1080
acacaactca tcatgccact tgttttccat gccatccaaa agtgtggtgc cacgcccttc 1140
gtcgcatggc gtattgccta cttcgtgccg ggaatgatgc acatcgtgat ggggttgctt 1200
gtgctcacaa tgggccaaga tctccctgac ggcaaccttg cgagcctcca gaagaaggga 1260
gacatggcca aggacaagtt ctcgaaggtc ctttggggtg ccgtcaccaa ctatcgcaca 1320
tggatattcg tcctcctcta tggctactgc atgggtgtcg agctcaccac cgacaacgtc 1380
attgccgagt actactatga ccacttccac ctagaccttc gcgccgccgg taccatcgcc 1440
gcctgcttcg gcatggccaa catcgtcgcg cgtcctatgg gcggctacct ctctgacctt 1500
ggtgcccgct acttcggcat gcgtgctcgg ctctggaaca tctggatcct ccagaccgct 1560
ggtggcgctt tctgcatctg gctcggtcgt gcatcggccc ttcctgcctc agtcacggcc 1620
atggtcctct tttccatttg tgcacaagcc gcctgtggtg ctgtctttgg cgtcgcaccc 1680
ttcgtttcca ggcgttccct tggcatcatc tctgggctga ccggcgctgg tggcaacgtt 1740
ggtgcagggc tgacgcaact tcttttcttc acttcgtcgc aatactccac cgggaggggt 1800
ctcgagtaca tgggcatcat gatcatgcca tgcacattac ccgtcgctct ggtgcacttc 1860
ccacaatggg gctccatgtt cttcccggcc agcgctgatg ccaccgaaga ggagtacyac 1920
gcttctgagt ggtcggagga ggagaagggc aagggtctcc atattgcagg ccaaaagttc 1980
gcagagaact cccgctcaga gygcggcagg cgcaacgtca tccttgccac atccgccacg 2040
ccacccaaca acacacccca gcacgtataa ggcccttgtt ttttgtcacc aatgaattgt 2100
acggtttcgt 2110
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgatgccac cgaagagggg tac 23
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acgaaaccgt acaattcatt 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgcagggct gacgcaactt ctt 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaggatgacg ttgcgcctgg cgc 23
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtaagaaacc tgaagctcaa a 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acgaaaccgt acaattcatt 20
Claims (10)
1.检测小麦基因组中dCAPS-1918的多态性或基因型的物质和/或检测小麦基因组中dCAPS-2002的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定小麦产量性状产品中的应用；所述dCAPS-1918为小麦基因组的一个SNP位点，所述dCAPS-1918位于小麦基因组中SEQ IDNo.1的第1918位核苷酸，其为T或C；所述dCAPS-2002为小麦基因组的一个SNP位点，所述dCAPS-2002位于小麦基因组中SEQ ID No.1的第2002位核苷酸，其为C或T；
所述dCAPS-1918为T时的小麦的产量高于或候选高于所述dCAPS-1918为C的小麦的产量；或者，所述dCAPS-1918的基因型为C并且所述dCAPS-2002的基因型为C的小麦的产量低于或候选低于所述dCAPS-1918的基因型为T同时所述dCAPS-2002的基因型为C的小麦和所述dCAPS-1918的基因型为T并且所述dCAPS-2002的基因型为T的小麦；
所述小麦产量性状为小麦每穗小穗数。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测小麦基因组中dCAPS-1918的多态性或基因型的物质为扩增包括dCAPS-1918在内的小麦基因组DNA片段的引物对；所述检测小麦基因组中dCAPS-2002的多态性或基因型的物质为扩增包括dCAPS-2002在内的小麦基因组DNA片段的引物对。
3.鉴定或辅助鉴定小麦产量性状的方法，为I或II：
I、包括步骤P1)和P2)：
P1)检测待测小麦的单倍型，所述单倍型为Hap-6D-1、Hap-6D-2和Hap-6D-3，所述单倍型为Hap-6D-1的小麦中权利要求1中所述dCAPS-1918的基因型为T和权利要求1中所述dCAPS-2002的基因型为C；所述单倍型为Hap-6D-2的小麦中权利要求1中所述dCAPS-1918的基因型为T和权利要求1中所述dCAPS-2002的基因型为T；所述单倍型为Hap-6D-3的小麦中权利要求1中所述dCAPS-1918的基因型为C和权利要求1中所述dCAPS-2002的基因型为C；
P2)根据待测小麦的单倍型确定待测小麦的产量性状：Hap-6D-1和Hap-6D-2单倍型小麦的产量高于或候选高于Hap-6D-3单倍型小麦，Hap-6D-1单倍型小麦的产量与Hap-6D-2单倍型小麦的产量差异不显著；
II、包括步骤Q1)和Q2)：
Q1)检测待测小麦的中权利要求1中所述的dCAPS-1918的基因型；
Q2)根据待测小麦的dCAPS-1918的基因型确定待测小麦的产量性状：所述dCAPS-1918为T时的小麦的产量高于或候选高于所述dCAPS-1918为C的小麦的产量；
所述小麦产量性状为小麦每穗小穗数。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤P1)中检测待测小麦的单倍型具体包括：利用引物对TaNRT2-6D-Primer对所述待测小麦的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR产物；对所述PCR产物进行测序获得所述待测小麦基因组DNA中对应于序列表中SEQ IDNo.1的第1918和2002位的核苷酸确定所述待测小麦的单倍型；
所述PCR产物对应于序列表中SEQ ID No.1的第1918和2002位的核苷酸分别为T和C的待测小麦为Hap-6D-1单倍型小麦；所述PCR产物对应于序列表中SEQ ID No.1的第1918和2002位的核苷酸分别为T和T的待测小麦为Hap-6D-2单倍型小麦；所述PCR产物对应于序列表中SEQ ID No.1的第1918和2002位的核苷酸分别为C和C的待测小麦为Hap-6D-3单倍型小麦；
所述引物对TaNRT2-6D-Primer由名称分别为TaNRT2-6D-Primer-F和TaNRT2-6D-Primer-R的单链DNA组成：
所述TaNRT2-6D-Primer-F为序列表中SEQ ID No.6所示的单链DNA；
所述TaNRT2-6D-Primer-R为序列表中SEQ ID No.7所示的单链DNA。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法I中检测待测小麦的单倍型包括如下步骤：
A1)以所述待测小麦的基因组DNA为模板，分别用引物对TaNRT2-Primer-KpnI和TaNRT2-Primer-BssHII进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物A和PCR扩增产物B，
其中，所述TaNRT2-Primer-KpnI由名称分别为TaNRT2-Primer-KpnI-F和TaNRT2-Primer-KpnI-R的单链DNA组成，所述TaNRT2-Primer-KpnI-F为序列表中SEQ ID No.2所示的单链DNA；所述TaNRT2-Primer-KpnI-R为序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA；
所述TaNRT2-Primer-BssHII由名称分别为TaNRT2-Primer-BssHII-F和TaNRT2-Primer-BssHII-R的单链DNA组成，所述TaNRT2-Primer-BssHII-F为序列表中SEQ ID No.4所示的单链DNA；所述TaNRT2-Primer-BssHII-R为序列表中SEQ IDNo.5所示的单链DNA；
A2)用KpnI酶切所述PCR扩增产物A，得到酶切产物K；用BssHII酶切所述PCR扩增产物B，得到酶切产物B；检测所述酶切产物K和所述酶切产物B的大小，确定所述待测小麦的单倍型：
若所述酶切产物K含有大小为216bp的DNA片段且不含有大小分别为193bp和23bp的DNA片段，且所述酶切产物B含有大小分别为260bp和24bp的DNA片段且不含有大小为284bp的DNA片段，则所述待测小麦为Hap-6D-1单倍型小麦；
若所述酶切产物K含有大小为216bp的DNA片段且不含有大小分别为193bp和23bp的DNA片段，且所述酶切产物B含有大小为284bp的DNA片段且不含有大小分别为260bp和24bp的DNA片段，则所述待测小麦为Hap-6D-2单倍型小麦；
若所述酶切产物K含有大小为193bp和23bp的DNA片段且不含有大小为216bp的DNA片段，且所述酶切产物B含有大小分别为260bp和24bp的DNA片段且不含有大小为284bp的DNA片段，则所述待测小麦为Hap-6D-3单倍型小麦。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤Q1)中检测待测小麦的中权利要求1所述的dCAPS-1918的基因型包括如下步骤：
B1)以所述待测小麦的基因组DNA为模板，用权利要求5中所述TaNRT2-Primer-KpnI进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A；
B2)用KpnI酶切所述PCR扩增产物A，得到酶切产物K；检测所述酶切产物K的大小，确定所述待测小麦的所述的dCAPS-1918的基因型：
所述酶切产物K含有大小为216bp的DNA片段且不含有大小分别为193bp和23bp的DNA片段，则所述待测小麦的所述的dCAPS-1918的基因型为T；
所述酶切产物K含有大小分别为193bp和23bp的DNA片段且不含有大小为216bp的DNA片段，则所述待测小麦的所述的dCAPS-1918的基因型为C。
7.权利要求3-6中任一所述的方法在小麦育种中的应用，所述小麦育种为培育小麦每穗小穗数高的小麦。
8.权利要求3-6所述的方法在鉴定或辅助鉴定小麦产量性状中的应用，所述小麦产量性状为小麦每穗小穗数。
9.检测小麦基因组中dCAPS-1918的多态性或基因型的物质和/或检测小麦基因组中dCAPS-2002的多态性或基因型的物质在如下任一中的应用，其中，所述dCAPS-1918为小麦基因组的一个SNP位点，所述dCAPS-1918位于小麦基因组中SEQ IDNo.1的第1918位核苷酸，其为T或C；所述dCAPS-2002为小麦基因组的一个SNP位点，所述dCAPS-2002位于小麦基因组中SEQ ID No.1的第2002位核苷酸，其为C或T；
所述dCAPS-1918为T时的小麦的产量高于或候选高于所述dCAPS-1918为C的小麦的产量；或者，所述dCAPS-1918的基因型为C并且所述dCAPS-2002的基因型为C的小麦的产量低于或候选低于所述dCAPS-1918的基因型为T同时所述dCAPS-2002的基因型为C的小麦和所述dCAPS-1918的基因型为T并且所述dCAPS-2002的基因型为T的小麦；
所述小麦产量性状为小麦每穗小穗数；
1)培育或者选育小麦每穗小穗数高的小麦中的应用；
2)在制备培育或者选育小麦每穗小穗数高的小麦的产品中的应用。
10.一种小麦育种方法，为V或VI：
V、按照权利要求3-5中任一所述检测待测小麦的单倍型的方法检测小麦的单倍型，选择Hap-6D-1单倍型的小麦和/或Hap-6D-2单倍型的小麦作为亲本进行育种；所述单倍型为Hap-6D-1的小麦中权利要求1中所述dCAPS-1918的基因型为T和权利要求1中所述dCAPS-2002的基因型为C；所述单倍型为Hap-6D-2的小麦中权利要求1中所述dCAPS-1918的基因型为T和权利要求1中所述dCAPS-2002的基因型为T；
VI、按照权利要求6中所述的方法检测小麦的dCAPS-1918，选择所述dCAPS-1918为T的小麦作为亲本进行育种。
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