CN110042171A - 鉴定小麦产量性状的方法与相关分子标记 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了鉴定小麦产量性状的方法与相关分子标记。本发明公开的鉴定小麦产量性状的方法包括：检测待测小麦的单倍型，Hap‑6B‑1单倍型小麦的产量高于或候选高于Hap‑6B‑2单倍型小麦，Hap‑6B‑3单倍型小麦的产量与Hap‑6B‑1和Hap‑6B‑2单倍型小麦的产量差异不显著；各单倍型依据小麦基因组DNA中对应于序列表中序列1的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和1458位的核苷酸区分。实验证明，小麦这三种单倍型与产量相关，在培养高产小麦品种或研究中具有重要意义。

Description

鉴定小麦产量性状的方法与相关分子标记
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，鉴定小麦产量性状的方法与相关分子标记。
背景技术
小麦是我国的三大主要粮食作物之一，在国家保障粮食安全中有至关重要的作用。随着分子生物学的发展，分子标记辅助育种为小麦目标性状的选择提供了方便快捷的方法，利用分子标记发掘与利用优异基因资源为提高育种效率提供基础，为作物遗传改良和种质创新提供一条高效的途径。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何鉴定小麦的产量相关性状。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了鉴定或辅助鉴定小麦产量性状的方法，所述方法包括I或II：
I、下述P1)和P2)：
P1)检测待测小麦的单倍型，所述单倍型为Hap-6B-1、Hap-6B-2和Hap-6B-3，基因组DNA中对应于序列表中序列1的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和1458位的核苷酸分别为C、C、T、C、G、C、C、T、A、G和C的待测小麦为Hap-6B-1单倍型小麦，基因组DNA中对应于序列表中序列1的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和1458位的核苷酸分别为T、C、T、T、A、T、T、T、G、C和G的待测小麦为Hap-6B-2单倍型小麦，基因组DNA中对应于序列表中序列1的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和1458位的核苷酸分别为C、T、C、C、G、C、T、G、G、G和C的待测小麦为Hap-6B-3单倍型小麦；
P2)根据待测小麦的单倍型确定待测小麦的产量性状：Hap-6B-1单倍型小麦的产量高于或候选高于Hap-6B-2单倍型小麦，Hap-6B-3单倍型小麦的产量与Hap-6B-1和Hap-6B-2单倍型小麦的产量差异均不显著或候选不显著；
II、下述Q1)和Q2)：
Q1)检测待测小麦的产量分子标记(即下文的标记2)，所述产量分子标记为小麦基因组中对应于序列表中序列1的第1227位的核苷酸，所述产量分子标记为A或G；
Q2)所述产量分子标记为A的小麦的产量高于或候选高于所述产量分子标记为G的小麦。
所述待测小麦可为纯合型小麦，即小麦的基因组DNA中对应于序列表中序列1的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和1458位的核苷酸均只有一种，或，小麦的基因组DNA中对应于序列表中序列1的第1227位的核苷酸均只有一种。
所述检测待测小麦的单倍型通过检测所述待测小麦基因组DNA中对应于序列表中序列1的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和1458位的核苷酸实现。
所述检测待测小麦的产量分子标记通过检测所述待测小麦基因组DNA中对应于序列表中序列1的第1227位的核苷酸实现。
所述检测待测小麦的单倍型可包括：利用引物对TaNRT2L12-6B-Primer对所述待测小麦的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR产物；对所述PCR产物进行测序获得所述待测小麦基因组DNA中对应于序列表中序列1的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和1458位的核苷酸确定所述待测小麦的单倍型；
所述引物对TaNRT2L12-6B-Primer的两条单链DNA的识别序列分别位于序列表中序列1的第237位的上游和第1458位的下游。
所述引物对TaNRT2L12-6B-Primer可由名称分别为TaNRT2L12-6B-Primer-F和TaNRT2L12-6B-Primer-R的单链DNA组成；
所述TaNRT2L12-6B-Primer-F为如下a1)或a2)：
a1)序列表中序列6所示的单链DNA；
a2)将序列表中序列6所示的单链DNA经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的单链DNA；
所述TaNRT2L12-6B-Primer-R为如下b1)或b2)：
b1)序列表中序列7所示的单链DNA；
b2)将序列表中序列7所示的单链DNA经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的单链DNA。
所述一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加可为不超过5个核苷酸(如1个、2个、3个、4个或5个)的取代和/或缺失和/或添加。
利用所述引物对TaNRT2L12-6B-Primer进行PCR扩增的体系(20μL)可为：ddH2O11.0μL、5×PCR buffer 4.0μL、序列6所示的单链DNA(5μmol/L)和序列7所示的单链DNA(5μmol/L)各1μL、dNTPs(2.5mmol/L)1.6μL、transfastpfu酶(5U)0.4μL、模板DNA(20ng/μL)1μL。所述5×PCR buffer和所述transfastpfu酶(5U)均为北京全式金生物技术有限公司产品。
利用所述引物对TaNRT2L12-6B-Primer进行PCR扩增的条件可为：95℃2min；95℃1min,60℃30s,72℃30s,35次循环；72℃10min，4℃保存。
所述检测待测小麦的单倍型可包括A1)和A2)：
A1)以所述待测小麦的基因组DNA为模板，分别用引物对TaNRT2L12-Primer-BglⅠ和TaNRT2L12-Primer-SalⅠ进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物A和PCR扩增产物B；
A2)用BglⅠ酶切所述PCR扩增产物A，得到酶切产物B；用SalⅠ酶切所述PCR扩增产物B，得到酶切产物S；检测所述酶切产物B和所述酶切产物S的大小，确定所述待测小麦的单倍型：
若所述酶切产物B含有大小分别为216bp和21bp的DNA片段且不含有大小为237bp的DNA片段，且所述酶切产物S含有大小为228bp的DNA片段且不含有大小分别为206bp和22bp的DNA片段，则所述待测小麦为Hap-6B-1单倍型小麦；
若所述酶切产物B含有大小为237bpp的DNA片段且不含有大小分别为216bp和21bp的DNA片段，且所述酶切产物S含有大小分别为206bp和22bp的DNA片段且不含有大小为228bp的DNA片段，则所述待测小麦为Hap-6B-2单倍型小麦；
若所述酶切产物B含有大小为216bp和21bp的DNA片段且不含有大小为237bp的DNA片段，且所述酶切产物S含有大小分别为206bp和22bp的条带DNA片段且不含有大小为228bp的DNA片段，则所述待测小麦为Hap-6B-3单倍型小麦；
所述TaNRT2L12-Primer-BglⅠ由名称分别为TaNRT2L12-Primer-BglⅠ-F和TaNRT2L12-Primer-BglⅠ-R的单链DNA组成；
所述TaNRT2L12-Primer-BglⅠ-F为如下c1)或c2)：
c1)序列表中序列2所示的单链DNA；
c2)将序列表中序列2所示的单链DNA经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的单链DNA；
所述TaNRT2L12-Primer-BglⅠ-R为如下d1)或d2)：
d1)序列表中序列3所示的单链DNA；
d2)将序列表中序列3所示的单链DNA经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的单链DNA；
所述TaNRT2L12-Primer-SalⅠ由名称分别为TaNRT2L12-Primer-SalⅠ-F和TaNRT2L12-Primer-SalⅠ-R的单链DNA组成；
所述TaNRT2L12-Primer-SalⅠ-F为如下e1)或e2)：
e1)序列表中序列4所示的单链DNA；
e2)将序列表中序列4所示的单链DNA经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的单链DNA；
所述TaNRT2L12-Primer-SalⅠ-R为如下f1)或f2)：
f1)序列表中序列5所示的单链DNA；
f2)将序列表中序列5所示的单链DNA经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的单链DNA。
所述待测小麦可满足以下条件：表1中单倍型Hap-6B-1的11个SNP位点(即序列1的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和1458位)的核苷酸存在连锁现象，即单倍型Hap-6B-1小麦的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和1458位为分别为C、C、T、C、G、C、C、T、A、G和C；单倍型Hap-6B-2的这11个SNP位点的核苷酸存在连锁现象，即单倍型Hap-6B-2小麦的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和1458位为分别为T、C、T、T、A、T、T、T、G、C和G；单倍型Hap-6B-3的这11个SNP位点的核苷酸也存在连锁现象，即单倍型Hap-6B-3小麦的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和1458位为分别为C、T、C、C、G、C、T、G、G、G和C。
所述检测待测小麦的产量分子标记的方法可包括B1)和B2)：
B1)以所述待测小麦的基因组DNA为模板，用所述TaNRT2L12-Primer-SalⅠ进行PCR扩增，得到PCR扩增产物B；
B2)用SalⅠ酶切所述PCR扩增产物B，得到酶切产物S；检测所述酶切产物S的大小，确定所述待测小麦的产量分子标记：
所述酶切产物S含有大小为228bp的DNA片段且不含有大小分别为206bp和22bp的DNA片段，则所述待测小麦的产量分子标记为A；
所述酶切产物S含有大小分别为206bp和22bp的DNA片段且不含有大小为228bp的DNA片段，则所述待测小麦的产量分子标记为G。
利用所述TaNRT2L12-Primer-BglⅠ和所述TaNRT2L12-Primer-SalⅠ进行PCR扩增的体系均可为：ddH2O 5.0μL、所述5×PCR buffer 2.0μL、序列2或4所示的单链DNA(5μmol/L)和序列3或5所示的单链DNA(5μmol/L)各0.5μL、dNTP(2.5mmol/L)0.8μL、所述transfastpfu酶(5U)0.2μL、模板DNA(20ng/μL)1μL。
利用所述TaNRT2L12-Primer-BglⅠ和所述TaNRT2L12-Primer-SalⅠ进行PCR扩增的条件均可为：95℃2min；95℃1min,60℃30s,72℃10s,35次循环；72℃10min，4℃保存。
本发明还提供了下述III或IV的方法：
III、检测小麦单倍型的方法，所述单倍型为Hap-6B-1、Hap-6B-2和Hap-6B-3，基因组DNA中对应于序列表中序列1的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和1458位的核苷酸分别为C、C、T、C、G、C、C、T、A、G和C的待测小麦为Hap-6B-1单倍型小麦，基因组DNA中对应于序列表中序列1的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和1458位的核苷酸分别为T、C、T、T、A、T、T、T、G、C和G的待测小麦为Hap-6B-2单倍型小麦，基因组DNA中对应于序列表中序列1的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和1458位的核苷酸分别为C、T、C、C、G、C、T、G、G、G和C的待测小麦为Hap-6B-3单倍型小麦，所述方法按照所述检测小麦的单倍型的方法完成；
IV、检测小麦的产量分子标记的方法，按照所述检测小麦的产量分子标记的方法完成。
本发明还提供了下述M1)或M2)或M3)的产品：
M1)引物对，由序列表中序列6和7所示的两条单链DNA组成；
M2)成套试剂，包括所述TaNRT2L12-Primer-BglⅠ和所述TaNRT2L12-Primer-SalⅠ；
M3)成套试剂，包括中所述TaNRT2L12-Primer-SalⅠ。
M2)所述成套试剂可用于鉴定或辅助鉴定小麦产量性状或检测小麦的单倍型。
M2)所述成套试剂还可包括限制性内切酶BglⅠ和/或SalⅠ。
M2)所述成套试剂可由所述TaNRT2L12-Primer-BglⅠ和所述TaNRT2L12-Primer-SalⅠ组成，还可由所述TaNRT2L12-Primer-BglⅠ和所述TaNRT2L12-Primer-SalⅠ与限制性内切酶BglⅠ和/或SalⅠ组成。
M3)所述成套试剂可用于鉴定或辅助鉴定小麦产量性状或检测小麦基因组DNA中对应于序列表中序列1的第1227位的核苷酸。
M3)所述成套试剂还可包括限制性内切酶SalⅠ。
M3)所述成套试剂可由所述TaNRT2L12-Primer-SalⅠ组成，还可由所述TaNRT2L12-Primer-SalⅠ与限制性内切酶SalⅠ组成。
本发明还提供了小麦产量分子标记，所述小麦产量分子标记为标记1或标记2：
所述标记1为小麦基因组DNA中对应于序列表中序列的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和1458位的核苷酸；
所述标记2为小麦基因组DNA中对应于序列表中序列的第1227位的核苷酸。
本发明还提供了下述任一应用：
X1)所述鉴定或辅助鉴定小麦产量性状的方法或所述检测小麦单倍型的方法或所述检测小麦的产量分子标记的方法在小麦育种中的应用；
X2)所述检测小麦单倍型的方法或所述检测小麦的产量分子标记的方法在鉴定或辅助鉴定小麦产量性状中的应用；
X3)所述产品在小麦育种中的应用；
X4)所述产品在鉴定或辅助鉴定小麦产量性状中的应用；
X5)所述产品在制备鉴定或辅助鉴定小麦产量性状产品中的应用；
X6)所述小麦产量分子标记在小麦育种中的应用；
X7)所述小麦产量分子标记在鉴定或辅助鉴定小麦产量性状中的应用；
X8)检测待测小麦基因组DNA中对应于序列表中序列1的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和/或1458位的核苷酸的物质在鉴定或辅助鉴定小麦产量相关性状中的应用；
X8)检测待测小麦基因组DNA中对应于序列表中序列1的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和/或1458位的核苷酸的物质在制备鉴定或辅助鉴定小麦产量相关性状的产品中的应用；
X10)检测待测小麦基因组DNA中对应于序列表中序列1的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和/或1458位的核苷酸的物质在小麦育种中的应用；
X11)检测待测小麦基因组DNA中对应于序列表中序列1的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和/或1458位的核苷酸的物质在制备小麦育种的产品中的应用；
X12)检测待测小麦基因组DNA中对应于序列表中序列1的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和/或1458位的核苷酸的物质在选育产量高的小麦中的应用；
X13)检测待测小麦基因组DNA中对应于序列表中序列1的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和/或1458位的核苷酸的物质在制备选育产量高的小麦的产品中的应用。
本发明还提供了小麦育种方法，所述方法包括V或VI：
V、按照所述检测待测小麦的单倍型的方法检测小麦的单倍型，选择Hap-6B-1单倍型的小麦作为亲本进行育种；所述Hap-6B-1单倍型的小麦为小麦基因组DNA中对应于序列表中序列1的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和1458位的核苷酸分别为C、C、T、C、G、C、C、T、A、G和C的小麦；
VI、按照所述检测待测小麦的产量分子标记的方法检测小麦的产量分子标记，选择所述产量分子标记为A的小麦作为亲本进行育种。
所述小麦育种的目的可为选育高产量小麦。
本发明中，所述小麦产量性状可体现在小麦千粒重上。
本发明中，所述小麦可为32份小麦以及表2中的任一小麦材料或其后代，所述32份小麦材料为PANDAS、安85中124-1、偃展1号、霸王鞭、北京10号、北京14号、沧州小麦、长武131、长6878、大荔1号、单R8093、丰抗13、冀麦41、冀麦6号、晋2148-7、京核8922、临抗5108、白齐麦、昌乐5号、红和尚、北京8686、04-044、04-030、春22 9th-25、紫杆白芒先、京品10号、春04 9th-5-1、春45 9th-50-1、内乡188、京411、中国春和白糙麦。
本发明通过对小麦自然变异群体中TaNRT2L12-6B基因的遗传变异分析，发现有11个SNP，分别位于序列1的第237位、第492位、第576位、第615位、第642位、第678位、第730位、第951位、第1227位、第1345位和第1458位，这11个SNP存在三种单倍型：单倍型Hap-6B-1(11个SNP分别为C、C、T、C、G、C、C、T、A、G、C)、单倍型Hap-6B-2(11个SNP分别为T、C、T、T、A、T、T、T、G、C、G)和单倍型Hap-6B-3(11个SNP分别为C、T、C、C、G、C、T、G、G、G、C)。通过关联分析证明及自然群体验证，这三种单倍型的纯合类型中，Hap-6B-2的小麦产量显著低于Hap-6B-1，Hap-6B-3的小麦产量与Hap-6B-1和Hap-6B-2无显著差异。序列1的第1227位核苷酸也与小麦产量相关，序列1的第1227位核苷酸为A的小麦产量高于该位点为G的小麦。通过实验证明：采用检测本发明的小麦单倍型和基因组中对应于序列表中序列1的第1227位的核苷酸，可快速准确的找到产量优异的小麦。本发明为小麦分子标记辅助选择育种提供了一个新的方法，在培养高产小麦品种或研究中具有重要意义。
附图说明
图1为TaNRT2L12-6B基因组序列中SNP示意图及本发明中两个标记的部分检测结果。a为TaNRT2L12-6B基因结构示意图；b为TaNRT2L12-6B编码区序列中SNP及其位点示意图；c为根据第237bp位点设计的dCAPS-237分子标记部分检测结果，Hap-6B-2泳道的电泳条带大小为237bp，Hap-6B-1和Hap-6B-3泳道的电泳条带大小分别为216bp和21bp，由于电泳时间较长，21bp的小片段条较为模糊；d为根据第1227bp位点设计的dCAPS-1227分子标记部分检测结果，Hap-6B-1泳道的电泳条带大小为228bp，Hap-6B-2和Hap-6B-3泳道的电泳条带大小分别为206bp和22bp，由于电泳时间较长，22bp的小片段条较为模糊。
图2为小麦自然变异群体自然群体1中TaNRT2L12-6B基因三种单倍型千粒重性状统计结果。2010、2011、2015、2016、2017为播种年份。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
实施例1、产量相关基因TaNRT2L12-6B基因多态位点及单倍型的获得
一、TaNRT2L12-6B基因多态位点及单倍型的获得
1、TaNRT2L12-6B基因多态位点的获得
(1)根据小麦TaNRT2L12-6B基因组DNA序列特点设计其基因组的特异引物，引物序列如下：
TaNRT2L12-6B-Primer-F(正向引物)：5′-CGAGCCTCAACAAAAAAGGATAT-3′(序列表中序列6)；
TaNRT2L12-6B-Primer-R(反向引物)：5′-CCCAGATATTATTGACTAAGGCA-3′(序列表中序列7)。
TaNRT2L12-6B-Primer-F和TaNRT2L12-6B-Primer-R的识别序列分别位于TaNRT2L12-6B基因的上游和下游。
(2)分别以32份小麦材料(均来自于国家种质资源库)的基因组DNA为模板，采用步骤(1)的引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，然后对得到的PCR扩增产物进行测序和序列比对。
所用PCR扩增体系(20μL)均为：ddH2O 11.0μL、5×PCR buffer 4.0μL、正向引物(5μmol/L)和反向引物(5μmol/L)各1μL、dNTPs(2.5mmol/L)1.6μL、transfastpfu酶(5U)0.4μL、模板DNA(20ng/μL)1μL。5×PCR buffer和transfastpfu酶(5U)均为北京全式金生物技术有限公司产品。
PCR扩增条件为：95℃2min；95℃1min,60℃30s,72℃30s,35次循环；72℃10min，4℃保存。
通过序列分析发现：在TaNRT2L12-6B编码区(序列为序列1)有11个SNP位点(图1中a和b)，分别为TaNRT2L12-6B基因的第237位(存在C和T多态性)、第492位(存在C和T多态性)、第576位(存在T和C多态性)、第615位(存在C和T多态性)、第642位(存在G和A多态性)、第678位(存在C和T多态性)、第730位(存在C和T多态性)、第951位(存在T和G多态性)、第1227位(存在A和G多态性)、第1345(存在G和C多态性)位和第1458位(存在C和G多态性)。序列1中Y为C/T，R为A/G，K为G/T，S为C/G。
2、TaNRT2L12-6B基因单倍型的获得
通过序列分析发现：TaNRT2L12-6B基因的11个SNP位点在小麦自然变异群体中存在三种单倍型，分别将其命名为单倍型Hap-6B-1、单倍型Hap-6B-2和单倍型Hap-6B-3；每个单倍型在序列1的第237位、第492位、第576位、第615位、第642位、第678位、第730位、第951位、第1227位、第1345位和第1458位的核苷酸分别如表1所示。
表1、每个单倍型在各SNP位点处的核苷酸
位置 237 492 576 615 642 678 730 951 1227 1345 1458
Hap-6B-1 C C T C G C C T A G C
Hap-6B-2 T C T T A T T T G C G
Hap-6B-3 C T C C G C T G G G C
在这32份小麦材料中还发现，表1中单倍型Hap-6B-1的11个SNP位点的核苷酸存在连锁现象，单倍型Hap-6B-2的11个SNP位点的核苷酸存在连锁现象，单倍型Hap-6B-3的11个SNP位点的核苷酸也存在连锁现象。
这32份小麦材料的名称具体如下：PANDAS、安85中124-1、偃展1号、霸王鞭、北京10号、北京14号、沧州小麦、长武131、长6878、大荔1号、单R8093、丰抗13、冀麦41、冀麦6号、晋2148-7、京核8922、临抗5108、白齐麦、昌乐5号、红和尚、北京8686、04-044、04-030、春229th-25、紫杆白芒先、京品10号、春04 9th-5-1、春45 9th-50-1、内乡188、京411、中国春、白糙麦。
二、分子标记的获得及其在单倍型鉴定中的应用
1、分子标记的获得
将序列表中序列1所示的TaNRT2L12-6B基因的第237位和第1227位所示的SNP位点，分别记为dCAPS-237标记和dCAPS-1227标记，并设计能检测各标记的引物，检测dCAPS-237标记的引物如下：
TaNRT2L12-Primer-BglⅠ-F(正向引物)：5′-GCCATAGCAGCATCCACCAAC-3′(序列2)；
TaNRT2L12-Primer-BglⅠ-R(反向引物)：5′-ACCAGACACAGAGGCCACACC-3′(序列3)。
检测dCAPS-1227标记的引物如下：
TaNRT2L12-Primer-SalⅠ-F(正向引物)：5′-TCTGCCTTTGTCTTGGTCGTGC-3′(序列4)；
TaNRT2L12-Primer-SalⅠ-R(反向引物)：5′-CTTTGCTGGTGGTGTATGTCGA-3′(序列5)。
2、小麦单倍型的鉴定
(1)在待测小麦为TaNRT2L12-6B基因是纯合基因型的小麦时，利用步骤1的分子标记与引物鉴定待测小麦单倍型的步骤如下：
以待测小麦基因组DNA为模板，分别采用步骤1的检测dCAPS-237标记和dCAPS-1227标记的引物进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物A和PCR扩增产物B。PCR扩增产物A的核苷酸序列为序列1的第22-258位，PCR扩增产物B的核苷酸序列为序列1的第1022-1249位。
PCR扩增的体系(10μL)均为：ddH2O 5.0μL、5×PCR buffer 2.0μL、正向引物(5μmol/L)和反向引物(5μmol/L)各0.5μL、dNTP(2.5mmol/L)0.8μL、transfastpfu酶(5U)0.2μL、模板DNA(20ng/μL)1μL。
PCR扩增条件为：95℃2min；95℃1min,60℃30s,72℃10s,35次循环；72℃10min，4℃保存。
(2)用限制性内切酶BglⅠ酶切步骤(1)获得的PCR扩增产物A，得到酶切产物B，部分酶切产物B的电泳检测结果如图1中c。若酶切产物B为237bp，则表明该待测小麦基因组DNA中对应于序列表中序列1的第237位核苷酸为T，即T纯合，该待测小麦的单倍型为Hap-6B-2；若酶切产物B为216bp和21bp，则表明该待测小麦基因组DNA中对应于序列表中序列1的第237位核苷酸为C，即C纯合，该待测小麦的单倍型为Hap-6B-1或单倍型Hap-6B-3；
(3)用限制性内切酶SalⅠ酶切步骤(1)获得的PCR扩增产物B，得到酶切产物S，部分酶切产物S的电泳检测结果如图1中d。若酶切产物S为228bp，则表明该待测小麦基因组DNA中对应于序列表中序列1的第1227位核苷酸为A，即A纯合，该待测小麦的单倍型为Hap-6B-1；若酶切产物S为206bp和22bp，则表明该待测小麦基因组DNA中对应于序列表中序列1的第1227位核苷酸为G，即G纯合，该待测小麦的单倍型为Hap-6B-2或单倍型Hap-6B-3。
因此可以按照如下方法对待测小麦进行基因分型，判断待测小麦的单倍型为Hap-6B-1、Hap-6B-2还是Hap-6B-3：
1)提取待测小麦的基因组DNA；
2)以步骤1)的基因组DNA为模板，分别用引物TaNRT2L12-Primer-BglⅠ和TaNRT2L12-Primer-SalⅠ进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物A和PCR扩增产物B；
3)用BglⅠ酶切PCR扩增产物A，得到酶切产物B；用SalⅠ酶切PCR扩增产物B，得到酶切产物S；
检测酶切产物B和酶切产物S的大小(可通过电泳和测序进行)，若酶切产物B仅含有大小为216bp和21bp的条带，且酶切产物S仅含有大小为228bp的条带，则待测小麦的单倍型为Hap-6B-1；
若酶切产物B仅含有大小为237bp的条带，且酶切产物S仅含有大小为206bp和22bp的条带，则待测小麦的单倍型为Hap-6B-2；
若酶切产物B仅含有大小为216bp和21bp的条带，且酶切产物S仅含有大小为206bp和22bp的条带，则待测小麦的单倍型为Hap-6B-3。
实施例2、小麦单倍型与产量的关联分析
一、自然群体1的基因分型及其与产量的关联分析
采用实施例1中的dCAPS-237标记和dCAPS-1227标记对自然群体1(表2)进行基因分型，并对单倍型与千粒重性状进行关联分析。具体步骤如下：
1、单倍型的检测
以282份六倍体小麦组成的自然群体1中各小麦作为待测小麦按照实施例1中的方法进行分型，判断每个小麦个体的单倍型为单倍型Hap-6B-1、单倍型Hap-6B-2还是单倍型Hap-6B-3。自然群体1中各个小麦品种均来自于国家种质资源库。单倍型检测结果如表2所示，且各小麦的PCR扩增产物A的核苷酸序列均为序列1的第22-258位，PCR扩增产物B的核苷酸序列均为序列1的第1022-1249位。然后利用实施例1的TaNRT2L12-6B-Primer-F和TaNRT2L12-6B-Primer-R组成的引物对分别对各小麦的基因组DNA进行扩增，扩增体系和条件均同实施例1，结果显示，各小麦的PCR产物序列均为序列表中序列1，且各小麦的表1中的11个SNP位点的核苷酸均符合表1，说明可以利用本发明的dCAPS-237标记和dCAPS-1227标记检测单倍型Hap-6B-1、单倍型Hap-6B-2和单倍型Hap-6B-3小麦。
表2、自然群体1各个小麦单倍型统计结果
2、单倍型与株型和产量的关联分析
在2010-2011和2015-2017的五年里，在中国农业科学院作物科学研究所实验基地顺义种植小麦自然群体1，小麦收获后调查各个小麦的千粒重，计算每个年份的平均千粒重。用Tassel2.1软件利用GLM模型对两种标记、三种单倍型和千粒重性状进行关联分析。
自然群体1形成的两种标记(dCAPS-237和dCAPS-1227，即序列表中序列1的第237位和第1227位的核苷酸)与产量相关性状(千粒重)关联分析结果如表3，dCAPS-1227与小麦千粒重相关，基因组中对应于序列表中序列1的第1227位为A的小麦(即该位点为A纯合的小麦)的千粒重显著高于该位点为G的小麦(即该位点为G纯合的小麦)，表明该标记可以用于选育具有优异产量性状(千粒重)的小麦品种。
自然群体1形成的三种单倍型小麦产量相关性状(千粒重)统计结果如表4，单倍型Hap-6B-1小麦的千粒重性状显著高于单倍型Hap-6B-2，单倍型Hap-6B-3小麦的千粒重性状与单倍型Hap-6B-1小麦以及单倍型Hap-6B-2均无显著差异(图2)。说明本发明的单倍型和小麦千粒重相关，可以用于选育具有优异产量性状(千粒重)的小麦品种。
表3、小麦自然群体1中TaNRT2L12-6B标记与相关性状关联分析结果
注：n.s.，表示序列1的第237位或第1227位的两种核苷酸与产量之间相关不显著。
表4、小麦自然群体1中TaNRT2L12-6B三种单倍型千粒重(g)的统计结果
序列表
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 鉴定小麦产量性状的方法与相关分子标记
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1521
<212> DNA
<213> 小麦(Triticum aestivum L.)
<400> 1
atggagatcg gttcgccggg cgccatagca gcatccacca acttctctct gccggtggac 60
tctgagcaca aggccaagtc catcaaaatc ttctccttcg gcaacccaca catgcgtgcc 120
ttccaccttg gatggatgtc cttcttcacc tgcgttgtat ccaccttcgc cgccgcaccg 180
ctcatcccca tcatccgcga caacctcaat ctcaccaagg ctgacatagg caacgcyggt 240
gttgcctctg tgtctggtgc tatcttctca aggctggcca tgggtgccat ctgcgacctt 300
cttggaccgc gctatggcgg tgctttcctc atcatgcttt ctgcaccagc ggtgttctgc 360
atgtccgtca tcgacagtcc cgctggatac atcatcgtac gcttcctcat cggcgtatca 420
cttgccacct ttgtgtcgtg ccagtactgg atcagcacca tgttcaatag caagatcatc 480
gggactgtcg gyggcttaac ggcggggtgg ggagacatgg gtggaggtgc cacacagctc 540
atcatgcctt tcgtcttcga tgccatcaag gcatgyggtg cgacacgttt caccgcgtgg 600
cgcatcgcct acttygtgcc aggaatgatg ttggtggtga trggcttgct cgtgctcacc 660
ttaggacagg accttccyga tggcaacctg aggaacctcc aaaaaaatgg tgacatgaac 720
aaggacaagy tctccaaggt tctccgtgga gccgtcacca actatcgaac ctggatcttt 780
gtcttcatct atggctactg catgggcgtc gagctcacct caaacaatgt gattgccggg 840
tactactatg atagtttcta cctcgacctt cgaaaagcag gtatcattgc cgcctgcttt 900
ggcttggcca atatctttgc acgccccatg ggcgggtacc tctccgacct kggtgctcgc 960
tacttcggca tgcgtgcccg actctggaac atttggatcc tccagactgc tggtggagtc 1020
ttctgccttt gtcttggtcg tgcatccacc cttcccacct ccatagcatg catggtcttg 1080
tactccatct gtgtcgaggc tgcatgcggg gctgtctatg gtgtcatccc cttcgtctcc 1140
cgccgctccc ttgggctcgt ctccggcatg accggtgcag gcggtaatgt gggtggcggt 1200
ctcacacaac tcctcttctt cacttcrtcg caatacacca ccagcaaagg gctccaatac 1260
atgggaatca tgatcatggc atgcacgctc cccgtcattc tcgtgcactt tccgcagtgg 1320
ggctccatgc tcgtccctcc cagcsccgac gccactgagg aggagtacta cgccgccgag 1380
tggacggagg aggagaaggg caagggcctc cacatggctg gcctcaagtt cgccgagaac 1440
agcatatccg agcgtggsag acgcaatgcc atcctcgcgg tacctgctac cccacccaac 1500
agcacgccac aacacgtgta a 1521
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
gccatagcag catccaccaa c 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
accagacaca gaggccacac c 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
tctgcctttg tcttggtcgt gc 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
ctttgctggt ggtgtatgtc ga 22
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
cgagcctcaa caaaaaagga tat 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
cccagatatt attgactaag gca 23

Claims (10)

1.鉴定或辅助鉴定小麦产量性状的方法，包括I或II：
I、下述P1)和P2)：
P1)检测待测小麦的单倍型，所述单倍型为Hap-6B-1、Hap-6B-2和Hap-6B-3，基因组DNA中对应于序列表中序列1的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和1458位的核苷酸分别为C、C、T、C、G、C、C、T、A、G和C的待测小麦为Hap-6B-1单倍型小麦，基因组DNA中对应于序列表中序列1的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和1458位的核苷酸分别为T、C、T、T、A、T、T、T、G、C和G的待测小麦为Hap-6B-2单倍型小麦，基因组DNA中对应于序列表中序列1的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和1458位的核苷酸分别为C、T、C、C、G、C、T、G、G、G和C的待测小麦为Hap-6B-3单倍型小麦；
P2)根据待测小麦的单倍型确定待测小麦的产量性状：Hap-6B-1单倍型小麦的产量高于或候选高于Hap-6B-2单倍型小麦，Hap-6B-3单倍型小麦的产量与Hap-6B-1和Hap-6B-2单倍型小麦的产量差异均不显著或候选不显著；
II、下述Q1)和Q2)：
Q1)检测待测小麦的产量分子标记，所述产量分子标记为小麦基因组中对应于序列表中序列1的第1227位的核苷酸，所述产量分子标记为A或G；
Q2)所述产量分子标记为A的小麦的产量高于或候选高于所述产量分子标记为G的小麦。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述检测待测小麦的单倍型包括：利用引物对TaNRT2L12-6B-Primer对所述待测小麦的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR产物；对所述PCR产物进行测序获得所述待测小麦基因组DNA中对应于序列表中序列1的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和1458位的核苷酸确定所述待测小麦的单倍型；
所述引物对TaNRT2L12-6B-Primer的两条单链DNA的识别序列分别位于序列表中序列1的第237位的上游和第1458位的下游。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述引物对TaNRT2L12-6B-Primer由名称分别为TaNRT2L12-6B-Primer-F和TaNRT2L12-6B-Primer-R的单链DNA组成；
所述TaNRT2L12-6B-Primer-F为如下a1)或a2)：
a1)序列表中序列6所示的单链DNA；
a2)将序列表中序列6所示的单链DNA经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的单链DNA；
所述TaNRT2L12-6B-Primer-R为如下b1)或b2)：
b1)序列表中序列7所示的单链DNA；
b2)将序列表中序列7所示的单链DNA经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的单链DNA。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述检测待测小麦的单倍型包括A1)和A2)：
A1)以所述待测小麦的基因组DNA为模板，分别用引物对TaNRT2L12-Primer-BglⅠ和TaNRT2L12-Primer-SalⅠ进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物A和PCR扩增产物B；
A2)用BglⅠ酶切所述PCR扩增产物A，得到酶切产物B；用SalⅠ酶切所述PCR扩增产物B，得到酶切产物S；检测所述酶切产物B和所述酶切产物S的大小，确定所述待测小麦的单倍型：
若所述酶切产物B含有大小分别为216bp和21bp的DNA片段且不含有大小为237bp的DNA片段，且所述酶切产物S含有大小为228bp的DNA片段且不含有大小分别为206bp和22bp的DNA片段，则所述待测小麦为Hap-6B-1单倍型小麦；
若所述酶切产物B含有大小为237bpp的DNA片段且不含有大小分别为216bp和21bp的DNA片段，且所述酶切产物S含有大小分别为206bp和22bp的DNA片段且不含有大小为228bp的DNA片段，则所述待测小麦为Hap-6B-2单倍型小麦；
若所述酶切产物B含有大小为216bp和21bp的DNA片段且不含有大小为237bp的DNA片段，且所述酶切产物S含有大小分别为206bp和22bp的条带DNA片段且不含有大小为228bp的DNA片段，则所述待测小麦为Hap-6B-3单倍型小麦；
所述TaNRT2L12-Primer-BglⅠ由名称分别为TaNRT2L12-Primer-BglⅠ-F和TaNRT2L12-Primer-BglⅠ-R的单链DNA组成；
所述TaNRT2L12-Primer-BglⅠ-F为如下c1)或c2)：
c1)序列表中序列2所示的单链DNA；
c2)将序列表中序列2所示的单链DNA经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的单链DNA；
所述TaNRT2L12-Primer-BglⅠ-R为如下d1)或d2)：
d1)序列表中序列3所示的单链DNA；
d2)将序列表中序列3所示的单链DNA经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的单链DNA；
所述TaNRT2L12-Primer-SalⅠ由名称分别为TaNRT2L12-Primer-SalⅠ-F和TaNRT2L12-Primer-SalⅠ-R的单链DNA组成；
所述TaNRT2L12-Primer-SalⅠ-F为如下e1)或e2)：
e1)序列表中序列4所示的单链DNA；
e2)将序列表中序列4所示的单链DNA经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的单链DNA；
所述TaNRT2L12-Primer-SalⅠ-R为如下f1)或f2)：
f1)序列表中序列5所示的单链DNA；
f2)将序列表中序列5所示的单链DNA经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的单链DNA。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述检测待测小麦的产量分子标记的方法包括B1)和B2)：
B1)以所述待测小麦的基因组DNA为模板，用权利要求4中所述TaNRT2L12-Primer-SalⅠ进行PCR扩增，得到PCR扩增产物B；
B2)用SalⅠ酶切所述PCR扩增产物B，得到酶切产物S；检测所述酶切产物S的大小，确定所述待测小麦的产量分子标记：
所述酶切产物S含有大小为228bp的DNA片段且不含有大小分别为206bp和22bp的DNA片段，则所述待测小麦的产量分子标记为A；
所述酶切产物S含有大小分别为206bp和22bp的DNA片段且不含有大小为228bp的DNA片段，则所述待测小麦的产量分子标记为G。
6.下述III或IV的方法：
III、检测小麦单倍型的方法，所述单倍型为Hap-6B-1、Hap-6B-2和Hap-6B-3，基因组DNA中对应于序列表中序列1的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和1458位的核苷酸分别为C、C、T、C、G、C、C、T、A、G和C的待测小麦为Hap-6B-1单倍型小麦，基因组DNA中对应于序列表中序列1的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和1458位的核苷酸分别为T、C、T、T、A、T、T、T、G、C和G的待测小麦为Hap-6B-2单倍型小麦，基因组DNA中对应于序列表中序列1的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和1458位的核苷酸分别为C、T、C、C、G、C、T、G、G、G和C的待测小麦为Hap-6B-3单倍型小麦，所述方法按照权利要求1-4中任一所述检测小麦的单倍型的方法完成；
IV、检测小麦的产量分子标记的方法，按照权利要求1-5中任一所述检测小麦的产量分子标记的方法完成。
7.下述M1)或M2)或M3)的产品：
M1)引物对，由序列表中序列6和7所示的两条单链DNA组成；
M2)成套试剂，包括权利要求4中所述TaNRT2L12-Primer-BglⅠ和所述TaNRT2L12-Primer-SalⅠ；
M3)成套试剂，包括权利要求4中所述TaNRT2L12-Primer-SalⅠ。
8.小麦产量分子标记，为标记1或标记2：
所述标记1为小麦基因组DNA中对应于序列表中序列的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和1458位的核苷酸；
所述标记2为小麦基因组DNA中对应于序列表中序列的第1227位的核苷酸。
9.下述任一应用：
X1)权利要求1-6中任一所述的方法在小麦育种中的应用；
X2)权利要求6所述的方法在鉴定或辅助鉴定小麦产量性状中的应用；
X3)权利要求7所述产品在小麦育种中的应用；
X4)权利要求7所述产品在鉴定或辅助鉴定小麦产量性状中的应用；
X5)权利要求7所述产品在制备鉴定或辅助鉴定小麦产量性状产品中的应用；
X6)权利要求8所述小麦产量分子标记在小麦育种中的应用；
X7)权利要求8所述小麦产量分子标记在鉴定或辅助鉴定小麦产量性状中的应用；
X8)检测待测小麦基因组DNA中对应于序列表中序列1的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和/或1458位的核苷酸的物质在鉴定或辅助鉴定小麦产量相关性状中的应用；
X8)检测待测小麦基因组DNA中对应于序列表中序列1的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和/或1458位的核苷酸的物质在制备鉴定或辅助鉴定小麦产量相关性状的产品中的应用；
X10)检测待测小麦基因组DNA中对应于序列表中序列1的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和/或1458位的核苷酸的物质在小麦育种中的应用；
X11)检测待测小麦基因组DNA中对应于序列表中序列1的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和/或1458位的核苷酸的物质在制备小麦育种的产品中的应用；
X12)检测待测小麦基因组DNA中对应于序列表中序列1的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和/或1458位的核苷酸的物质在选育产量高的小麦中的应用；
X13)检测待测小麦基因组DNA中对应于序列表中序列1的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和/或1458位的核苷酸的物质在制备选育产量高的小麦的产品中的应用。
10.小麦育种方法，包括V或VI：
V、按照权利要求1-4中任一所述检测待测小麦的单倍型的方法检测小麦的单倍型，选择Hap-6B-1单倍型的小麦作为亲本进行育种；所述Hap-6B-1单倍型的小麦为小麦基因组DNA中对应于序列表中序列1的第237、492、576、615、642、678、730、951、1227、1345和1458位的核苷酸分别为C、C、T、C、G、C、C、T、A、G和C的小麦；
VI、按照权利要求1-5中任一所述检测待测小麦的产量分子标记的方法检测小麦的产量分子标记，选择所述产量分子标记为A的小麦作为亲本进行育种。
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