CN116064904A - 与小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A紧密连锁的分子标记及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种与小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A紧密连锁的分子标记及应用。本发明提供的分子标记为KASP标记KASP97，标记KASP97与小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A紧密连锁，两者共定位于小麦2A染色体上。本发明通过检测分析表明，分子标记KASP97能准确跟踪所述小麦茎基腐病抗性QTL，预测小麦的茎基腐病抗性，进而方便进行分子设计育种。本发明还提供分子标记KASP97在小麦育种中的应用。利用本发明提供的方法能够加强小麦茎基腐病抗性预测的准确性，以便快速筛选出具有高抗小麦茎基腐病的QTL的小麦品种或品系用于育种，可以大大加快小麦高产品种的选育进程。

Description

与小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A紧密连锁的分子标记及应用
技术领域
本发明涉及分子标记和植物遗传育种技术领域，具体地说，涉及一种与小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A紧密连锁的分子标记及应用。
背景技术
小麦(Triticum aestivum L.)是世界上最为重要的主粮作物之一，小麦为人类提供了膳食纤维和多种营养物质，世界约40％人口以小麦作为重要的热量来源。小麦的安全生产对中国粮食安全具有重要意义。小麦茎基腐病(Fusarium crown rot,FCR)是一种多种病原菌侵染引起的、一种世界性真菌病害，该病发生严重时极大降低谷物的产量和品质。抗病品种的选育和大规模应用是控制该病害最经济和有效的途径，抗源的使用和茎腐病抗性鉴定技术是保证抗病品种选育的关键。
目前抗茎基腐病的QTL分布在小麦的21条染色体中的14条上，但只有2D、3B和5D上的QTL可以在不同的遗传背景中被一致地检测到；Wallwork等(2004)使用了来自“Kukri/Janz”杂交的由单倍体加倍获得的双倍体(DH)群体，利用室外环境检测成株期的抗性，检测到矮化基因Rht1附近的4B QTL，该基因座的抗性等位基因来自“Kukri”品种，解释了高达48％的表型变异率(Wallwork,H.,M.Butt,et al.Resistance to crown rot in wheatidentified through an improved method for screening adultplants.Australas.Plant Pathol.2004,33:1-7.)；Bovill(2006)等利用95份来自“W21MMT70/Mendos”杂交的由单倍体加倍获得的双倍体(DH)群体利用温室环境在幼苗期进行鉴定，检测到分别来自“W21MMT70”、“Mendos”抗性基因的两个位于5D和2B的QTL，解释了28％和20％的表型变异率(Bovill,W.D.,W.Ma,et al.Identification of novel QTL forresistance to crown rot in the doubled haploid wheat population‘W21MMT70’9‘Mendos’.Plant Breed.2006,125,538-543.)；Ma等(2010)分析了“CSCR6”与澳大利亚品种“Lang”之间的杂交获得的群体，通过苗期温室接种鉴定QTL之一的抗性等位基因源自“CSCR6”，称为Qcrs.cpi-3B的QTL位于3B染色体的长臂上，根据区间作图分析可解释多达48.8％的表型变异，为迄今为止具有最大效应的QTL位点，另一个具有来自“Lang”品种的抗性等位基因的QTL位于4B染色体上，这个QTL解释多达22.8％的表型变异，可在不同遗传背景中检测到(Ma,J.,H.B.Li,et al.Identification and validation of a major QTLconferring crown rot resistance in hexaploid wheat.Theor.Appl.Genet.2010,120,1119-1128.)；Zheng等(2014)针对RIL群体的“EGAWylie/'Sumai 3”的研究发现了四个QTL赋予茎基腐病抗性，影响最大的一个位于染色体臂5DS上，该QTL解释了高达31％的表型变异，LOD值为9.6，另一个QTL位于2DL上，该QTL解释了高达20％的表型变异，LOD值为4.5。当通过协方差分析考虑植物高度的影响时，未检测到其他两个基因座(均位于4B染色体上)的显着影响(Zheng Z,Kilian A,Yan G,et al.QTL conferring Fusarium crown rotresistance in the elite bread wheat variety EGA Wylie.PLoS One.2014,9:e96011.)。
西藏半野生小麦(T.aestivum ssp.tibetanum)、云南铁壳麦(T.aestivumssp.yunnanense)、新疆稻麦(T.petropavlovskyi Udacz et.Migusch)和四川白麦子是中国西部特有地方小麦种质资源(Ward,R.W.,Yang,Z.L.,Kim,H.S.,et al.Comparativeanalyses of RFLP diversity in landraces of Triticum aestivum and collectionsof T.tauschii from China and Southwest Asia.Theor.Appl.Genet.1998,96:312-318.)。这四个种质资源是由原始六倍体小麦在长期的中国特有的生态环境中通过自然和人工选择在不同的生态环境中进化而来的；具有丰富的农艺性状和遗传多样性，是丰富小麦遗传变异的潜在基因资源(Dong,Y.,Zheng,D.,Qiao,D.,Zeng,X.,En,Z.,Chen,X.1981.Expedition and investigation of Yunnan wheat(Triticum aestivumssp.yunnanense King).Zuo Wu Xue Bao 3:145-152.)。因此，对209份中国西部特有地方小麦进行全基因组关联分析，进一步定位小麦茎基腐病抗性位点，挖掘高抗茎基腐病的基因，寻找紧密连锁的分子标记，同时为小麦高抗茎基腐病材料的创制及高产育种提供新基因资源，进一步利用分子标记辅助选择，将增强茎基腐病抗病性预测的准确性，提高育种效率，加速实现培育抗病高产的小麦。
分子标记辅助选择，不依赖于表现型选择，即不受环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素的影响，而是直接对基因型进行选择，因而能大大提高育种效率。竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR)，可在广泛的基因组DNA样品中，对SNP和特定位点上的Indel进行精准的双等位基因检测。这种检测方法具有操作简便、特异性好、高通量、快速、检测成本低、结果准确等优势，并且实现了真正的闭管操作而受到普遍的关注。因此，筛选出与小麦茎基腐病抗性QTL紧密连锁的，且适用于荧光定量PCR平台KASP技术的分子标记，不仅能对小麦茎基腐病抗性基因进行选择，有效的提高小麦的抗病性，保障小麦正常生长结实，同时提高了选择通量、速度和准确性，解决了大规模推广应用的技术瓶颈，对规模化改良小麦育种群体质量和产量具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种与小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A紧密连锁的分子标记及应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种与小麦茎基腐病抗性QTLQfcr.sicau.2A紧密连锁的分子标记KASP97，所述分子标记KASP97含有小麦如SEQ ID NO:1所示序列第36bp处的多态性为A或G的核苷酸序列。
分子标记KASP97第36bp处的碱基为A时，小麦含有QTL Qfcr.sicau.2A，对应小麦茎基腐病抗性强；分子标记KASP97第36bp处的碱基为G时，小麦不含QTL Qfcr.sicau.2A，对应小麦茎基腐病抗性弱。
本发明中，所述小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A位于小麦2A染色体上70.43-74.06Mb之间的3.62Mb区段内。该区间包含19个高置信度基因。
第二方面，本发明提供一套基于KASP技术开发的用于扩增所述分子标记的特异性引物组，所述引物组包括序列如SEQ ID NO:2-4所示的引物。
进一步地，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物的5’端分别连有不同的荧光探针。
优选地，SEQ ID NO:2所示引物的5’端连有的荧光探针的核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示，SEQ ID NO:3所示引物的5’端连有的荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，且SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示荧光探针的5’端分别连有不同的荧光基团，如FAM、HEX等。
第三方面，本发明提供含有所述引物组的检测试剂或试剂盒。
第四方面，本发明提供所述分子标记KASP97、所述引物组或含有所述引物组的检测试剂或试剂盒的以下任一应用：
(1)用于鉴定小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A；
(2)用于筛选或鉴定高抗茎基腐病的小麦品种；
(3)用于小麦分子标记辅助育种；
(4)用于小麦种质资源改良。
第五方面，本发明提供一种鉴定小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A的方法，以待测小麦的基因组DNA为模板，利用所述引物组进行荧光定量PCR扩增，根据PCR扩增结果对待测小麦进行基因分型。
优选地，所述荧光定量PCR扩增的反应体系：2×KASP Mastermix 5μL，KASP AssayMix 0.14μL，模板DNA 50ng，DNase/RNase-free去离子水加至总量为10μL；其中，所述KASPAssay Mix中含有SEQ ID NO:2-4所示的引物，三条引物的体积比为2:2:5，各引物浓度为100μM。
优选地，荧光定量PCR程序：95℃活化10min；95℃变性20s，65℃退火延伸60s，循环10次，每次退火延伸温度降低1℃；94℃变性20s，57℃退火延伸60s，循环36次；37℃60s，采集荧光信号。
前述的方法，含有小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A的小麦品种出现与SEQID NO:2所示引物连接的荧光探针相同的荧光信号，而不含有小麦茎基腐病抗性QTLQfcr.sicau.2A的小麦品种出现与SEQ ID NO:3所示引物连接的荧光探针明显不同的荧光信号。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明首次公开了地方小麦中定位的小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A，位于小麦2A染色体上，显著提高了小麦茎基腐病抗病性。该QTL在小麦产量(提高小麦茎基腐病抗病性)育种中具有较高的利用价值。本发明进一步公开了基于荧光定量PCR平台精确检测小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A的分子标记KASP97，位于小麦2A染色体上73.62Mb位置，且为共显性标记，检测准确高效、扩增方便稳定。
本发明提供的分子标记KASP97与小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A显著相关，呈现共分离标记特征，用于分子标记辅助选择的准确性高，提高适应不同环境的小麦特定茎基腐病抗病品种的选择鉴定效率，且成功率高。
利用本发明提供的方法能够加强小麦茎基腐病抗性预测的准确性，以便快速筛选出具有高抗小麦茎基腐病的QTL的小麦品种或品系用于育种，可以大大加快小麦高产品种的选育进程。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A在2A染色体上的物理位置及分子标记KASP97与茎基腐病抗性关联分析曼哈顿图。
图2为本发明较佳实施例中利用荧光定量PCR引物对地方小麦茎基腐病极端抗病材料(隆子折达、察雅折达、临沧铁壳麦、玉田稻麦)和极端感病材料(加察碎穗小麦、新疆稻麦、顶芒铁壳麦、中国春)三叶期的叶片DNA做基因型分型的结果。
图3为本发明较佳实施例中利用玉田稻麦和中国春构建的F6验证群体利用荧光定量PCR引物进行基因型分型的结果。
具体实施方式
本发明旨在提供一种与小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A紧密连锁的分子标记KASP97，并提供所述分子标记在小麦育种中的应用。
本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供与小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A紧密连锁的分子标记，其为分子标记KASP97，核苷酸序列SEQ ID NO:1所示(5’-AGTTGTATCCCATAGTTGTATACCAAAATGGCATCNTGCATGTATACATGTTTGTATAGCACTGATCTACA-3’；其中，N为A或G)，即所述序列第36位碱基的多态性为A/G，该多态性与小麦茎基腐病抗性相关。
本发明分子标记KASP97与小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A紧密相连共定位于小麦2A染色体上70.43-74.06Mb之间的3.62Mb区段内，所述分子标记KASP97位于小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A置信区间内。
进一步地，本发明提供的所述小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A能显著增加小麦茎基腐病抗性，LOD值最高5.49，解释14.48％的表型变异。
更具体地，本发明提供的分子标记KASP97的单碱基差异位点为A，对应小麦茎基腐病抗性强；分子标记KASP97的单碱基差异位点为G，对应小麦茎基腐病抗性弱。
第二方面，本发明提供用于荧光定量PCR扩增所述分子标记KASP97的特异性引物组。
本领域技术人员可以基于KASP检测平台技术设计用于扩增分子标记KASP97的引物，优选地，所述特异性引物对包括序列如SEQ ID NO:2-4所示的引物。其中，SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:3所示的引物的5’端分别连有不同的荧光探针。
KASP97-1：5’-AGTTGTATACCAAAATGGCATCA-3’(SEQ ID NO:2)
KASP97-2：5’-AGTTGTATACCAAAATGGCATCG-3’(SEQ ID NO:3)
KASP97-3：5’-GGGTCAATCACGGGCATGTA-3’(SEQ ID NO:4)
并且，引物KASP97-1和KASP97-2的5’端分别连有不同的荧光探针；
所述荧光探针的序列如下：
F探针：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(SEQ ID NO:5)，本发明的实施例中该探针结合FAM荧光基团。
H探针：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(SEQ ID NO:6)本发明的实施例中该探针结合HEX荧光基团。
本发明还提供分子标记KASP97或上述特异性引物的如下任一应用：
(1)在鉴定小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A中的应用；
(2)在筛选或鉴定小麦茎基腐病抗性的小麦品种中的应用；
(3)在小麦分子标记辅助育种中的应用；
(4)在小麦种质资源改良中的应用。
第三方面，本发明提供一种鉴定小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A的方法，以待测小麦的基因组DNA为模板，采用上述的特异性引物组进行荧光定量PCR扩增，根据PCR扩增结果对待测小麦进行基因分型。
优选地，所述荧光定量PCR扩增的反应体系：2×KASP Mastermix 5μL，KASP AssayMix 0.14μL，模板DNA 50ng，DNase/RNase-free去离子水加至总量为10μL；其中，KASPAssay Mix中含有引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2-4所示，三条引物的体积比为2:2:5，各引物浓度为100μM。
本发明的实施例中，荧光定量PCR程序：95℃活化10min；95℃变性20s，65℃退火延伸60s，循环10次，每次退火延伸温度降低1℃；94℃变性20s，57℃退火延伸60s，循环36次；37℃60s，采集荧光信号。
本发明提供的鉴定小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A的方法的判断标准为：含有小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A的小麦品种均出现与SEQ ID NO:3所示引物标记的荧光探针相同的荧光信号，而不含有小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A的小麦品种均出现与SEQ ID NO:3所示引物标记的荧光探针明显不同的荧光信号。
本发明中，小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A及分子标记KASP97是通过以下方法获得的：
(1)以209份地方小麦品种为作为遗传定位群体。
(2)用CTAB法提取所述的遗传群体的各株系的DNA，利用小麦55K SNP芯片对所有材料的合格DNA样品进行了基因分型，获得所述群体的基因型资料。
(3)小麦苗期温室浸泡接种法鉴定209份小麦地方品种的茎基腐病病情等级，并计算病情指数(Disease index,DI)。
(4)结合209份地方小麦品种分子标记数据和表型数据，利用TASSEL v5.0关联分析软件，在混合线性模型下进行全基因组关联分析，将小麦茎基腐病抗性QTLQfcr.sicau.2A定位于2A染色体上70.43-74.06Mb之间的3.62Mb区段内。
(5)将目标区段内与茎基腐抗性最紧密相关联的SNP位点转换为荧光定量PCR引物，用于后续筛选。利用PolyMarker网站设计荧光定量PCR引物9对(表1)。荧光定量PCR引物设计标准：扩增引物长度18～25bp，扩增产物长度45-60bp，退火温度57-62℃，GC含量在40％～60％之间。合成的引物序列为：
正向引物1：F探针+扩增引物序列
正向引物2：H探针+扩增引物序列
反向引物：扩增引物序列
F探针：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(可结合FAM荧光基团)
H探针：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(可结合HEX荧光基团)
表1 9对KASP引物序列及扩增片段长度
Figure BDA0003870315490000061
Figure BDA0003870315490000071
(6)竞争性等位基因特异性PCR(KASP)分析
a)多态性分子标记的筛选：选取上述设计的9对引物，以特有地方小麦茎基腐病极端抗病材料(隆子折达、察雅折达、临沧铁壳麦、玉田稻麦)和极端感病材料(加察碎穗小麦、新疆稻麦、顶芒铁壳麦、中国春)的DNA为模板，进行PCR扩增，共获得1对效果良好的分子标记引物，SEQ ID NO:2-4所示引物，能够扩增出SEQ ID NO:1，扩增。命名为KASP97-1/2/3(核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2-4所示)。扩增产物为具有多态性的分子标记KASP97，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
b)特有地方小麦群体的KASP分析：用上述步骤获得的具有多态性的分子标记KASP97的PCR引物，扩增地方小麦群体的DNA，进行基因型鉴定，获得分子标记数据。茎基腐病极端抗病材料(隆子折达、察雅折达、临沧铁壳麦、玉田稻麦)的类型记为A，扩增片段大小长71bp，单碱基差异位点为A。极端感病材料(加察碎穗小麦、新疆稻麦、顶芒铁壳麦、中国春)的类型记为B，扩增片段长71bp，单碱基差异位点为G。特有地方小麦群体株系基因型与极端抗病材料(隆子折达、察雅折达、临沧铁壳麦、玉田稻麦)一致的记为A，与极端感病材料(加察碎穗小麦、新疆稻麦、顶芒铁壳麦、中国春)一致的记为B。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A及分子标记KASP97的获得
本发明的小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A及分子标记KASP97采用以下方法获得：
(1)以209份地方小麦品种为作为遗传定位群体。
(2)用CTAB法提取所述的遗传群体的各株系的DNA，利用小麦55K SNP芯片对所有材料的合格DNA样品进行了基因分型，获得所述群体的基因型资料。
(3)小麦苗期温室浸泡接种法鉴定209份小麦地方品种的茎基腐病病情等级，并计算病情指数(Disease index,DI)。
(4)结合209份地方小麦品种分子标记数据和表型数据，利用TASSEL v5.0关联分析软件，在混合线性模型下进行全基因组关联分析，将小麦茎基腐病抗性QTLQfcr.sicau.2A定位于2A染色体上70.43-74.06Mb之间的3.62Mb区段内。
(5)将目标区段内SNP位点转换为荧光定量PCR引物，用于后续筛选。利用PolyMarker网站设计荧光定量PCR引物9对(表1)。荧光定量PCR引物设计标准：扩增引物长度18～25bp，扩增产物长度45-60bp，退火温度57-62℃，GC含量在40％～60％之间。合成引物序列为：
正向引物1：F探针+扩增引物序列
正向引物2：H探针+扩增引物序列
反向引物：扩增引物序列
F探针：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(可结合FAM荧光基团)
H探针：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(可结合HEX荧光基团)
(6)竞争性等位基因特异性PCR(KASP)分析
a)多态性分子标记的筛选：选取上述设计的9对引物，以特有地方小麦茎基腐病极端抗病材料(隆子折达、察雅折达、临沧铁壳麦、玉田稻麦)和极端感病材料(加察碎穗小麦、新疆稻麦、顶芒铁壳麦、中国春)的DNA为模板，进行PCR扩增，共获得1对效果良好的分子标记引物，SEQ ID NO:2-4所示引物，能够扩增出SEQ ID NO:1，扩增。命名为KASP97-1/2/3(核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2-4所示)。扩增产物为具有多态性的分子标记KASP97，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
b)特有地方小麦群体的KASP分析：用上述步骤获得的具有多态性的分子标记KASP97的PCR引物，扩增地方小麦群体的DNA，进行基因型鉴定，获得分子标记数据。茎基腐病极端抗病材料(隆子折达、察雅折达、临沧铁壳麦、玉田稻麦)的类型记为A，扩增片段大小长71bp，单碱基差异位点为A。极端感病材料(加察碎穗小麦、新疆稻麦、顶芒铁壳麦、中国春)的类型记为B，扩增片段长71bp，单碱基差异位点为G。特有地方小麦群体株系基因型与极端抗病材料(隆子折达、察雅折达、临沧铁壳麦、玉田稻麦)一致的记为A，与极端感病材料(加察碎穗小麦、新疆稻麦、顶芒铁壳麦、中国春)一致的记为B。
c)利用软件TASSEL v5.0的混合线性模型计算方法，并结合地方小麦群体茎基腐病抗性表型数据，发现分子标记KASP97与小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A位点紧密连锁，结果如图1所示。由图1可知，小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A定位在2A染色体上70.43-74.06Mb之间的3.62Mb区段内，而分子标记KASP97与QTL紧密连锁。
实施例2与小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A紧密连锁的分子标记KASP97的应用
1、DNA提取
试验材料选取隆子折达、察雅折达、临沧铁壳麦、玉田稻麦、加察碎穗小麦、新疆稻麦、顶芒铁壳麦和中国春其中隆子折达、察雅折达、临沧铁壳麦和玉田稻麦为小麦茎基腐病抗病品种，加察碎穗小麦、新疆稻麦、顶芒铁壳麦和中国春为小麦茎基腐病感病品种。采用CTAB法提取小麦样品三叶期的叶片DNA。
2、检测小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A的引物的筛选
2.1引物设计
将SNP标记KASP97转换设计荧光定量PCR引物，用于后续筛选。利用PolyMarker网站设计荧光定量PCR引物9对(表1)。荧光定量PCR引物设计标准：扩增引物长度18～25bp，扩增产物长度45-60bp，退火温度57-62℃，GC含量在40％～60％之间。合成引物序列为：
正向引物1：F探针+扩增引物序列
正向引物2：H探针+扩增引物序列
反向引物：扩增引物序列
F探针：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(可结合FAM荧光基团)
H探针：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(可结合HEX荧光基团)
2.2荧光定量PCR平台测试引物及其亲本间的差异性
(1)提取地方小麦茎基腐病极端抗病材料(隆子折达、察雅折达、临沧铁壳麦、玉田稻麦)和极端感病材料(加察碎穗小麦、新疆稻麦、顶芒铁壳麦、中国春)三叶期的叶片DNA。
(2)以待测小麦的基因组DNA为模板，基于KASP检测平台技术设计引物，进行荧光定量PCR扩增；
其中，步骤2的引物序列如下(SEQ ID NO:2-4)：
KASP97-1：5’-AGTTGTATACCAAAATGGCATCA-3’；
KASP97-2：5’-AGTTGTATACCAAAATGGCATCG-3’；
KASP97-3：5’-GGGTCAATCACGGGCATGTA-3’；
并且，引物KASP97-1和KASP97-2的5’端分别连有不同的荧光探针；
所述荧光探针的序列如下(SEQ ID NO:5-6)：
F探针：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(可结合FAM荧光基团)
H探针：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(可结合HEX荧光基团)
(3)荧光定量PCR扩增反应体系：2×KASP Mastermix 5μL，KASP Assay Mix0.14μL，模板DNA 50ng、Dnase/RNase-free去离子水加至总量为10μL；其中，KASP Assay Mix中含有引物KASP97-1、KASP97-2和KASP97-3，体积比为2:2:5。即，在KASP Assay Mix中，将浓度为100μM的引物KASP97-1、KASP97-2和KASP97-3按2:2:5的体积比混合。
(4)荧光定量PCR程序：95℃活化10min；95℃变性20s，65℃退火延伸60s，循环10次，每次退火延伸温度降低1℃；94℃变性20s，57℃退火延伸60s，循环36次；37℃60s，采集荧光信号。
(5)分析PCR产物的具体方法如下：含有小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A的小麦样本均出现与茎基腐病极端抗病材料(隆子折达、察雅折达、临沧铁壳麦、玉田稻麦)的类型记为A，而不含有小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A的小麦样本均出现与小麦茎基腐病极端抗病材料(隆子折达、察雅折达、临沧铁壳麦、玉田稻麦)明显不同的荧光信号，如极端感病材料(加察碎穗小麦、新疆稻麦、顶芒铁壳麦、中国春)，记为B型。隆子折达、察雅折达、临沧铁壳麦、玉田稻麦、加察碎穗小麦39、新疆稻麦8、顶芒铁壳麦和中国春用KASP引物做基因型分型的结果见图2。
3、群体检测过程中引物序列KASP97-1/2/3的适用性
(1)以玉田稻麦为母本，中国春为父本杂交得到F1，F1不断自交获得F6作为验证群体。提取群体中各株系三叶期的叶片DNA。
(2)以步骤(1)所得的DNA作为模板，利用本发明所提供的引物进行荧光定量PCR扩增，荧光染料为SsoFast EvaGreen。
(3)荧光定量PCR扩增反应体系：2×KASP Mastermix 5μL，KASP Assay Mix0.14μL，模板DNA 50ng、Dnase/RNase-free去离子水加至总量为10μL；其中，KASP Assay Mix中含有引物KASP97-1、KASP97-2和KASP97-3，体积比为2:2:5。即，在KASP Assay Mix中，将浓度为100μM的引物KASP97-1、KASP97-2和KASP97-3按2:2:5体积比混合后，再吸取混合液0.14μL。
(4)荧光定量PCR程序：95℃活化10min；95℃变性20s，65℃退火延伸60s，循环10次，每次退火延伸温度降低1℃；94℃变性20s，57℃退火延伸60s，循环36次；37℃60s，采集荧光信号。
(5)分析PCR产物的具体方法如下：含有小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A的小麦样本均出现与茎基腐病极端抗病材料玉田稻麦的类型记为A，而不含有小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A的小麦样本均出现与小麦茎基腐病极端抗病材料玉田稻麦明显不同的荧光信号，如极端感病材料中国春，记为B型，结果如图3所示。随机抽检125株株系，58株能扩增出与玉田稻麦相同类型的片段，为小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A的植株，预测株系植株茎基腐病抗性强。61株能扩增出与三月黄相同的B型片段，为不含有小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A的植株，预测这些植株在预测株系植株茎基腐病抗性较差。另有6株表现为杂合子。
(6)小麦苗期温室鉴定该73个F2植株的茎基腐病抗病等级，结果见表2，小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A的分子标记KASP97预测验证群体小麦茎基腐病抗性的结果。与玉田稻麦类型相同的植株平均茎基腐病病情指数为42.13，显著低于与三月黄类型相同的植株平均茎基腐病抗病分级为51.24。实际结果与预期结果一致，说明本发明的小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A确实具有显著提高小麦茎基腐病抗性的作用，且分子标记KASP97可以用于跟踪鉴定小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A。
表2
Figure BDA0003870315490000111
Figure BDA0003870315490000121
Figure BDA0003870315490000131
Figure BDA0003870315490000141
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.与小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A紧密连锁的分子标记KASP97，其特征在于，所述分子标记KASP97含有小麦如SEQ ID NO:1所示序列第36bp处的多态性为A或G的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，分子标记KASP97第36bp处的碱基为A时，小麦含有QTL Qfcr.sicau.2A，对应小麦茎基腐病抗性强；分子标记KASP97第36bp处的碱基为G时，小麦不含QTL Qfcr.sicau.2A，对应小麦茎基腐病抗性弱；
其中，所述小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A位于小麦2A染色体上70.43-74.06Mb之间的3.62Mb区段内。
3.基于KASP技术开发的用于扩增权利要求1或2所述分子标记的特异性引物组，其特征在于，所述引物组包括序列如SEQ ID NO:2-4所示的引物。
4.根据权利要求3所述的引物组，其特征在于，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物的5’端分别连有不同的荧光探针。
5.根据权利要求4所述的引物组，其特征在于，SEQ ID NO:2所示引物的5’端连有的荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，SEQ ID NO:3所示引物的5’端连有的荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，且SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示荧光探针的5’端分别连有不同的荧光基团。
6.含有权利要求3-5任一项所述引物组的检测试剂或试剂盒。
7.权利要求1或2所述分子标记、权利要求3-5任一项所述引物组或权利要求5所述检测试剂或试剂盒的以下任一应用：
(1)用于鉴定小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A；
(2)用于筛选或鉴定高抗茎基腐病的小麦品种；
(3)用于小麦分子标记辅助育种；
(4)用于小麦种质资源改良。
8.一种鉴定小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A的方法，其特征在于，以待测小麦的基因组DNA为模板，利用权利要求3-5任一项所述引物组进行荧光定量PCR扩增，根据PCR扩增结果对待测小麦进行基因分型；
其中，所述小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A位于小麦2A染色体上70.43-74.06Mb之间的3.62Mb区段内。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增的反应体系：2×KASP Mastermix 5μL，KASP Assay Mix 0.14μL，模板DNA 50ng，DNase/RNase-free去离子水加至总量为10μL；其中，所述KASP Assay Mix中含有SEQ ID NO:2-4所示的引物，三条引物的体积比为2:2:5，各引物浓度为100μM；
荧光定量PCR程序：95℃活化10min；95℃变性20s，65℃退火延伸60s，循环10次，每次退火延伸温度降低1℃；94℃变性20s，57℃退火延伸60s，循环36次；37℃60s，采集荧光信号。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，含有小麦茎基腐病抗性QTLQfcr.sicau.2A的小麦品种出现与SEQ ID NO:2所示引物连接的荧光探针相同的荧光信号，而不含有小麦茎基腐病抗性QTL Qfcr.sicau.2A的小麦品种出现与SEQ ID NO:3所示引物连接的荧光探针明显不同的荧光信号。
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