CN117512177B - 一种与小麦茎基腐病抗性相关的kasp标记引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与小麦茎基腐病抗性相关的KASP标记引物及其应用，属于分子遗传育种领域，该KASP标记引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1‑2所示的第一反向引物和第二反向引物，以及核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的正向引物。本发明提供的KASP标记引物可灵敏、高效、低成本的预测小麦抗茎基腐病性能，为小麦抗茎基腐病种质资源筛选提供了简单、快捷、经济、有效的分子工具，利于筛选培育高抗茎基腐病的小麦品种，辅助小麦功能分子育种，进一步缩短育种进程。

Description

一种与小麦茎基腐病抗性相关的KASP标记引物及其应用

技术领域

本发明涉及分子遗传育种领域，特别是涉及一种与小麦茎基腐病抗性相关的KASP标记引物及其应用。

背景技术

由镰刀菌引起的小麦茎基腐病(Fusarium crown rot,FCR)不断威胁着全球小麦的生产，可能造成10-35％的产量损失。当田间作物收获后，病原菌可以依靠作物秸秆为生，并以孢子体的形式存活数年。因此当田间的小麦FCR发生时，治理就成了一个难题。

筛选抗病基因是一种经济、有效、安全的防治小麦FCR的方法。目前还未发现对FCR表现免疫的小麦材料，但是发现了高抗FCR的材料。目前筛选得到的高抗材料少，且单一抗原可能不足以防治FCR的发展。因此筛选高抗FCR的小麦品种才能保证产量所需的基本群体。为此，本发明以期通过开发与小麦茎基腐病抗性紧密连锁的KASP标记，筛选FCR抗性强的小麦品种，为小麦高产栽培及抗病品种的选育提供参考。

发明内容

本发明的目的是提供一种与小麦茎基腐病抗性相关的KASP标记引物及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该KASP标记引物可灵敏、高效、低成本的预测小麦抗茎基腐病性能，利于筛选培育高抗茎基腐病的小麦品种，辅助小麦功能分子育种，进一步缩短育种进程。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种与小麦茎基腐病抗性相关的KASP标记引物，所述KASP标记引物包括第一反向引物、第二反向引物和正向引物；所述第一反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，所述第二反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明还提供一种鉴定小麦茎基腐病抗性的检测试剂或检测试剂盒，包含上述的KASP标记引物。

本发明还提供一种上述的KASP标记引物在制备筛选或鉴定高抗茎基腐病小麦品种的产品中的应用。

进一步地，所述产品包括试剂或试剂盒。

本发明还提供一种筛选或鉴定高抗茎基腐病小麦品种的方法，以待测小麦的基因组DNA为模板，利用上述的KASP标记引物或上述的检测试剂或检测试剂盒对模板进行荧光定量PCR扩增，根据PCR扩增结果对待测小麦进行基因分型。

进一步地，基因分型为CC的小麦品种的茎基腐病抗性高于基因分型为TT的小麦品种。

本发明还提供一种上述的KASP标记引物或上述的检测试剂或检测试剂盒在改良小麦茎基腐病抗性中的应用。

本发明还提供一种上述的KASP标记引物或上述的检测试剂或检测试剂盒在小麦分子标记辅助育种中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明利用223份六倍体小麦种质资源进行全基因组关联分析，首次在六倍体小麦3D染色体长臂上发现了38个与茎基腐病紧密关联的单核苷酸多态性(SNP)，位于Qfcr.cau.3D-3抗病位点。进一步针对这些SNP位点开发了可用于大规模材料筛选的KASP分子标记引物，在两个RIL群体中验证了所开发的分子标记引物与抗病性的紧密关联程度。本发明为小麦抗茎基腐病种质资源筛选提供了简单、快捷、经济、有效的分子工具，利于筛选培育高抗茎基腐病的小麦品种，辅助小麦功能分子育种，进一步缩短育种进程。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为223份六倍体小麦病情指数分布图；

图2为SNP位点与FCR关联分析的曼哈顿图；

图3为Doumai/Shi 4185和Linmai 2/Zhongmai 892群体验证结果；左图为基因分型图；右图为病情指数柱状图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明利用90K单核苷酸多态性(SNP)序列对223份六倍体小麦进行全基因组关联分析(GWAS)。使用1×10⁷浓度的假禾谷镰刀菌NL5的孢子悬浮液，采用注射法接种一叶一心阶段的小麦茎秆，待接菌约两周后，根据表1对小麦茎基部侵染程度统计病害等级。利用R程序中的GAPIT语言包将表型数据与过滤后的90K SNP基因型数据分析，发现了54个与FCR抗病位点显著相关的SNP位点。根据LD把54个SNP分为10个QTL，其中3DL染色体Qfcr.cau.3D-3在5.57Mb区域内聚集了38个与茎基腐病紧密关联的单核苷酸多态性(SNP)。并用两个RIL群体(豆麦/石4185，临麦2/中麦892)验证该QTL位点与FCR抗性的关联。

具体研究如下：

实施例1

1小麦茎基腐病的表型分析

菌株NL5在PDA培养基上活化后，切割成菌饼，在CMC培养基中，以25℃、180r/min震荡培养4天。4天后用纱布将菌液过滤出菌饼，以5000rpm/min离心5min，收集菌液并调整到1×10⁷个孢子浓度。在白天25℃/16h，晚上20℃/8h的温室中，将萌发后的小麦种子种到5×10的穴盘中，每个穴种植2粒，待小麦幼苗长到一叶一心期(约7天)，将调整好浓度的孢子悬浮液加入0.5v/v体积的吐温20，并用1mL注射器注射到小麦幼苗茎秆的内部，待顶端液体冒出后停止注射。之后干旱处理，等到苗子严重失水进行浇水。同时接种抗病对照04中36和感病对照新麦26，待感病对照达到6级(移栽后22天)时，根据表1对小麦茎基部进行病级调查并计算病情指数。

对223份(栽培品种153份，高代系36份，国外材料25份，农家种9份，由中国农业大学农学院小麦研究中心李保云教授提供)六倍体小麦的病级进行调查，感病对照表型达到6级全部感病死亡，相反抗病对照植株正常生长。利用IBP SPSS22.0进行了统计分析，结果发现：群体病情指数呈现连续性分布，符合正态分布，属于典型的数量性状(图1)。病指变化范围为31.67-84.35，平均值为58.90，广义遗传力为0.98，该群体包含了足够的遗传变异水平(表2)。

表1小麦茎基腐病抗性分级标准及评价标准

表2 223份六倍体小麦病情指数统计分析

2SNP标记筛选

223份小麦材料用CTAB法提取DNA后，利用小麦90k SNP阵列进行基因分型。SNP数据按照缺失率＞10％、等位基因频率＜5％过滤后，19496个SNP被用于GWAS(表3)。这些SNP分布在小麦21条染色体上。B基因组包含最多的SNP(10008)，其次是A基因组(7527)和D基因组(1961)。SNP在各条染色体上的数目各不相同，在1B上包含最多的SNP(1959)，在4D上的SNP最少(56)。

表3 21条染色体上SNP分布情况

3FCR关联分析

用R4.0.2程序中的GAPIT语言包将表型数据与过滤后的90k SNP数据联合分析，发现54个SNP位点与FCR抗性显著相关：2BL(3)、3AL(2)、3BL(2)、3DS(1)、3DL(39)、4AL(1)、5DL(4)、7AS(1)和7BS(1)，其中3D染色体聚集的关联SNP最多(图2)。根据D基因组的LD约为7Mb，这54个SNP被划分为10个QTL，其中Qfcr.cau.3D-3包含最多的SNP(38)(表4)。

表4全基因组关联分析鉴定到抗FCR的QTL

4 Qfcr.cau.3D-3位点的验证

根据位于Qfcr.cau.3D-3的Kukri_c19514_1602设计了KASP分子标记KASP3D61373引物(表5)。

表5 KASP3D61373标记引物序列

注：R1包含了FAM荧光接头序列，R2包含了HEX荧光接头序列(下划线)；3’末尾加粗的碱基G和A为分型位点。

根据表5设计的引物，依据R1、R2引物的3’末尾的基因型，选择两个RIL群体(豆麦/石4185，临麦2/中麦892，由中国农业科学院作物科学研究所夏先春研究员提供)小麦材料用于标记鉴定。

KASP反应体系配制：

1、引物(R1、R2和F)加水稀释到100μm/μL的浓度；

2、100μL引物体系：12μLR1+12μLR2+30μL F+46μL水；

3、mix 4μL+引物体系0.1μL+DNA 2μL(DNA浓度约为50ng/μL)+1.9μL水；

4、10μL矿物油封顶；

(备注：Mix使用“北京嘉程生物科技有限公司”，版本号“E01/2020”)。

扩增程序：

95℃10min；95℃20s，61-55℃40s，每个循环退火温度降低0.6℃，共10个循环；95℃20s，55℃40s，共36个循环；12℃保存。

反应完成后，使用Bio-Rad仪器中的FAM、HEX两种荧光信号扫描，进行荧光信号读取。

结果显示，用KASP分子标记引物KASP3D61373对Doumai/Shi4185所构建的113个系进行基因分型，发现53个系和豆麦(Doumai)荧光信号一致，为CC基因型(KASP标记的分析结果定义为：FAM，代表GG标记，GG标记和植株的DNA双螺旋匹配结合，标记是GG，所以植物的基因型是CC)。52个系和石4185(Shi4185)一致，基因型为TT(KASP标记的分析结果定义为：HEX，代表AA标记，AA标记和植株的DNA双螺旋匹配结合，标记是AA，所以植物的基因型是TT)，8个系是杂合单倍型同时具有抗病亲本和感病亲本的基因型(为AG标记，所以植物基因型为CT；杂合系不用来做表型鉴定)。

同理，Linmai2/Zhongmai892的118个系，53个系为GG标记，基因型为CC；61个系为AA标记，基因型为TT；4个杂合系，基因型为CT。

对Doumai/Shi4185和Linmai2/Zhongmai892两组RIL群体的后代进行表型鉴定，发现基因型为CC的小麦病情指数显著低于基因型为TT的小麦，Qfcr.cau.3D-3能降低21.55％的FCR严重度(图3)。实验结果证实基因型为CC的小麦种质FCR抗病性显著高于基因型为TT的小麦种质。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种与小麦茎基腐病抗性相关的KASP标记引物，其特征在于，所述KASP标记引物包括第一反向引物、第二反向引物和正向引物；所述第一反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，所述第二反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

2.一种鉴定小麦茎基腐病抗性的检测试剂或检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的KASP标记引物。

3.一种如权利要求1所述的KASP标记引物在制备筛选或鉴定高抗茎基腐病小麦品种的产品中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂或试剂盒。

5.一种筛选或鉴定高抗茎基腐病小麦品种的方法，其特征在于，以待测小麦的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的KASP标记引物或权利要求2所述的检测试剂或检测试剂盒对模板进行荧光定量PCR扩增，根据PCR扩增结果对待测小麦进行基因分型。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，基因分型为CC的小麦品种的茎基腐病抗性高于基因分型为TT的小麦品种。

7.一种如权利要求1所述的KASP标记引物或权利要求2所述的检测试剂或检测试剂盒在小麦分子标记辅助育种中的应用。