CN117604149A - 一种鉴定小麦抗条锈病性状的引物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴定小麦抗条锈病性状的引物及其应用。本发明所要解决的技术问题是如何鉴定或辅助鉴定小麦抗条锈病性状。本发明具体地公开了用于鉴定或辅助鉴定小麦抗条锈病性状的分子标记，其为下述任一种：A1)分子标记YrAN1589‑CAPS2，其核苷酸序列为SEQ ID No.1；A2)分子标记YrAN1589‑CAPS5，其核苷酸序列为SEQ ID No.2。本发明还公开了检测所述分子标记的引物和检测方法。利用本发明的分子标记及其检测引物可以快速、准确地筛选具有抗条锈病性状的小麦，可应用于鉴定、辅助鉴定具有抗条锈病性状的小麦，在小麦抗条锈病育种中发挥重要作用。

Description

一种鉴定小麦抗条锈病性状的引物及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定小麦抗条锈病性状的引物及其应用。
背景技术
小麦(Triticum aestivum L.)是世界性的主要粮作物之一，目前全球小麦种植面积超过220万公顷，其中我国小麦种植面积在世界排名第三，产量是世界第一，产量和品质的稳定是国家粮食安全的重要战略性保障。由于小麦生育期长，遇到环境的威胁多，特别是真菌性病害对其产量和品质会造成很大影响，其中条锈病因其防治难度大、影响面积广、生产危害严重，于2020年被农业农村部评为首批“一类农作物病虫害”。小麦条锈病是由条形柄锈菌专化型(Puccinia striiformis f.sp.tritici，PST)引起的重要真菌病害，条形柄锈菌是一种属于有着顽强生存能力的活体寄生真菌，其发病范围广、防控成本高。我国是世界上最大的条锈病流行区，近5年呈高发态势，平均每年危害面积约500万公顷。实践证明，利用品种自身抗病特性是针对病害最为有效、环保、经济的方法，而通过聚合育种的方法来整合优异抗病基因用于改善品种弱点则需要我们能够挖掘更多的抗病新基因。
目前已经命名的小麦抗条锈病基因分布于86个位点(Yr1-Yr86)，除Yr18、Yr29、Yr30和Yr52等少数抗病基因是微效基因(成株抗病基因)外，其余已命名的抗条锈病基因大多为具有生理专化性的主效抗病基因。主效抗病基因的高抗表现以及易于田间选择的特性深受育种家的喜爱，然而由于其针对特定致病小种产生抗性，因此在流行小种常变的情况下存在抗性丧失的风险。为了避免抗源单一化而造成抗性大面积丧失，需要持续发掘利用新的抗病基因及其连锁标记。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何鉴定或辅助鉴定小麦抗条锈病性状。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于鉴定或辅助鉴定小麦抗条锈病性状的分子标记，所述分子标记可为下述任一种：
A1)分子标记YrAN1589-CAPS2，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
A2)分子标记YrAN1589-CAPS5，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了用于检测所述分子标记的PCR引物，所述PCR引物可为下述任一种：
B1)用于检测所述分子标记YrAN1589-CAPS2的引物对1，所述引物对1由上游引物F1和下游引物R1组成，所述上游引物F1为核苷酸序列是SEQ ID No.3的单链DNA，所述下游引物R1为核苷酸序列是SEQ ID No.4的单链DNA；
B2)用于检测所述分子标记YrAN1589-CAPS5的引物对2，所述引物对2由上游引物F2和下游引物R2组成，所述上游引物F2为核苷酸序列是SEQ ID No.5的单链DNA，所述下游引物R2为核苷酸序列是SEQ ID No.6的单链DNA。
本发明还提供了用于鉴定或辅助鉴定小麦抗条锈病性状的试剂盒，所述试剂盒可包括所述PCR引物。
进一步地，所述试剂盒还包括限制性内切酶AciI。
上述试剂盒中，各个引物对可独立包装，各条引物可独立包装。
上述试剂盒中，所述试剂盒还可包括用于PCR反应和/或酶切反应的其它试剂。
所述限制性内切酶AciI均可与所述引物对1和所述引物对2成套使用。
所述试剂盒的各种试剂组分可以存在于分开的容器中，或者可以全部或部分预组合成试剂混合物。
本发明还提供了所述分子标记、所述PCR引物或所述试剂盒的下述任一种应用：
C1)在鉴定或辅助鉴定小麦抗条锈病性状中的应用；
C2)在筛选或辅助筛选抗条锈病小麦中的应用。
本发明还提供了所述PCR引物在制备试剂盒中的应用，所述试剂盒的用途为如下任一种：
G1)鉴定或辅助鉴定小麦抗条锈病性状；
G2)筛选或辅助筛选抗条锈病小麦。
本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定小麦抗条锈病性状的方法，所述方法可包括以下步骤：
D1)以待鉴定小麦基因组DNA为模板，利用所述PCR引物进行PCR扩增，得到PCR产物；
D2)用AciI酶切所述PCR产物；
D3)根据酶切结果来鉴定或辅助鉴定小麦抗条锈病性状。
上述方法中，所述D3)可为：
当利用所述引物对1进行PCR扩增时，若待鉴定小麦的PCR产物能被AciI酶切为324bp，187bp和137bp的三个片段，则待鉴定小麦具有或候选具有抗条锈病性状；若待鉴定小麦的PCR产物不能被AciI酶切，则待鉴定小麦具有或候选具有感条锈病性状；
当利用所述引物对2进行PCR扩增时，若待鉴定小麦的PCR产物能被AciI酶切为348bp，267bp和81bp的三个片段，则待鉴定小麦具有或候选具有抗条锈病性状；若待鉴定小麦的PCR产物能被AciI酶切为267bp和81bp的两个片段，则待鉴定小麦具有或候选具有感条锈病性状。
本发明还提供了一种检测小麦抗条锈病基因YrAN1589等位基因的方法，所述方法可包括以下步骤：
E1)以待测小麦基因组DNA为模板，利用所述PCR引物进行PCR扩增，得到PCR产物；
E2)用AciI酶切所述PCR产物；
E3)根据酶切结果来判断小麦抗条锈病基因YrAN1589等位基因。
上述方法中，所述E3)可为：
当利用所述引物对1进行PCR扩增时，若待测小麦的PCR产物能被AciI酶切为324bp，187bp和137bp的三个片段，则待测小麦含有或候选含有YrAN1589抗病等位基因；若待测小麦的PCR产物不能被AciI酶切，则待测小麦含有或候选含有YrAN1589感病等位基因；
当利用所述引物对2进行PCR扩增时，若待测小麦的PCR产物能被AciI酶切为348bp，267bp和81bp的三个片段，则待测小麦含有或候选含有YrAN1589抗病等位基因；若待测小麦的PCR产物能被AciI酶切为267bp和81bp的两个片段，则待测小麦含有或候选含有YrAN1589感病等位基因。
上述方法中，所述PCR扩增的退火温度，所述引物对1为61℃，所述引物对2为54℃。
上述方法中，所述PCR扩增的反应体系可为：2×PCR Taq Mix 10μl，ddH2O 6.4μl，Forward Primer(10μmol/L)0.8μl，Reverse Primer(10μmol/L)0.8μl，DNA 2μl。
进一步地，利用所述引物对1进行PCR扩增的反应程序为：95℃5min；94℃30s、61℃30s、72℃30s，36个循环；72℃10min。
利用所述引物对2进行PCR扩增的反应程序为：95℃5min；94℃30s、54℃30s、72℃30s，36个循环；72℃10min。
上述方法中，所述酶切反应体系可为：10×CutSmart Buffer 1.0μl，ddH2O 3.8μl，AciI 0.2μl，PCR扩增产物5μl。
进一步地，所述酶切反应条件可为：37℃8h。
本发明还提供了一种选育抗条锈病小麦的方法，所述方法可为F1)和/或F2)：
F1)按照所述鉴定或辅助鉴定小麦抗条锈病性状的方法，选育出具有抗条锈病性状的小麦；
F2)按照所述检测小麦抗条锈病基因YrAN1589等位基因的方法，选育出含有抗条锈病基因YrAN1589抗病等位基因的小麦。
本文所述待鉴定小麦或待测小麦包括小麦种质资源、遗传群体或育种材料，可为含有抗条锈病基因YrAN1589的小麦或其与其他小麦的杂交后代。
本文所述抗条锈病小麦为侵染型IT＝0-2的小麦。本文所述感条锈病小麦为侵染型IT＝3-4的小麦。本文所述具有抗条锈病性状的小麦为侵染型IT＝0-2的小麦。本文所述具有感条锈病性状的小麦为侵染型IT＝3-4的小麦。
本文所述抗条锈病小麦具体可为小麦品种“安农1589”、小麦品种“铭贤169”、小麦品种“安农1589”的衍生品种或小麦品种“安农1589”与其它小麦品种的杂交后代。本文所述抗条锈病小麦可为小麦品种“安农1589”和小麦品种“铭贤169”的杂交后代。
本文所述条锈病可为条形柄锈菌引起的条锈病，具体可为条锈菌小种CYR32引起的条锈病。
本发明通过高通量测序技术BSR-seq结合中国春RefSeq v1.0(IWGSC，2018)参考基因组序列寻找双亲间存在差异的多态性位点，利用NEB cutter V3.0(https://nc3.neb.com/NEBcutter/)寻找合适的限制性内切酶。最终筛选获得与小麦抗条锈病基因YrAN1589连锁的分子标记YrAN1589-CAPS2(SEQ ID No.1)和YrAN1589-CAPS5(SEQ IDNo.2)，并进一步设计了用于检测(扩增)上述分子标记的引物，开发了一套鉴定或辅助鉴定小麦抗条锈病性状的方法和检测小麦抗条锈病基因YrAN1589等位基因的方法。实验表明，利用本发明的分子标记YrAN1589-CAPS2和YrAN1589-CAPS5及其检测引物可以快速、准确地筛选具有抗条锈病性状的小麦，可应用于鉴定、辅助鉴定具有抗条锈病性状的小麦、小麦抗条锈病分子育种和抗条锈病基因的克隆。本发明开发的紧密连锁的分子标记及其专用引物为抗条锈病基因YrAN1589应用于小麦抗条锈病分子标记辅助育种提供了良好工具，在小麦抗条锈病育种中发挥重要作用。
附图说明
图1为引物对YrAN1589-CAPS2(引物对1)对抗感亲本和F2群体株系的扩增及酶切结果。
图2为引物对YrAN1589-CAPS5(引物对2)对抗感亲本和F2群体株系的扩增及酶切结果。
图3为2个SSR标记、1个STS标记和5个CAPS标记与该抗病基因的连锁图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的条锈菌CYR32小种记载于如下文献中：姚强,王洁荣,孟岩等.中国小麦条锈病菌CYR32和CYR33的毒性及基因型多样性[J].植物保护学报,2018,45(01):46-52。
下述实施例中的小麦品种安农1589记载于如下文献中：中华人民共和国农业农村部公告第432号—2021年小麦品种审定公告。安农1589是安徽农业大学利用济麦22//M0959/168杂交选育的多抗广适小麦品种，并于2021年通过国家品种审定。连续多年对该品种进行苗期抗性鉴定，在安农1589中发现一个对CYR32高抗的显性抗条锈病基因。
下述实施例中的小麦品种铭贤169，公众可从国家作物种质资源库(https://www.cgris.net/)获得，资源库编号：I1B12652，统一编号：ZM009379。
下述实施例中的侵染型分级标准采用6级标准(即IT＝0、0；、1、2、3或4)(Bariana和McIntosh 1993)，详见表1。
表1、小麦条锈病苗期侵染型分级标准
侵染型 划分标准
0 叶片上不产生任何症状
0； 叶片上产生小型坏死斑，零星分布，不产生夏孢子堆
1 叶片上产生坏死斑，坏死斑上零星的散生很小的夏孢子堆
2 叶片上产生坏死斑，坏死斑上着生较多的很小的夏孢子堆
3 叶片连片褪绿，孢子堆大型且数量多
4 叶片不褪绿，上面着生大量夏孢子堆
注：0-2级为抗条锈病的小麦(R)，3-4级为感条锈病的小麦(S)。
实施例1、用于鉴定小麦抗条锈病性状的分子标记及检测引物的获得
使用条锈菌CYR32小种在温室对安农1589/铭贤169的杂交后代15株F1，1,174株F2分离群体进行接种及表型鉴定。表型鉴定结果表明，F1代15个单株对CYR32均表现出高抗，表明安农1589中的抗条锈病基因为显性基因。F2分离群体中，抗病株系为880株，感病株系为294株，根据后代分离比例，经卡方检测符合3:1的分离比(χ2＝0.01，P＝0.97)。表明安农1589中含有一个显性抗病基因。在F2群体中选择50个极抗单株(侵染型为0；)和50个极感单株(侵染型为4)取其叶片分别组成抗病池和感病池。安农1589、铭贤169以及F2后代对CYR32的苗期侵染型见表2。
表2、安农1589、铭贤169以及F2后代对CYR32的苗期侵染型
采用3B染色体上57个SSR标记，以安农1589、铭贤169和安农1589/铭贤169F2单株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，筛选多态性SSR标记。对所有SSR标记的PCR扩增产物进行6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显色。位于3BS上的2个SSR标记Xwmc291和Xwmc418在亲本和F2单株之间有多态性，且与抗条锈病基因YrAN1589的连锁距离较近，分别为13.0cM和11.2cM。
首先利用集群分离分析法结合RNA测序(BSR-seq)分析产生的5个高可信度SNP，将其中两个SNP，物理位置分别为585.70Mb和586.13Mb，转化为一个CAPS标记CAPS4和一个STS标记STS1。其次利用660K芯片产生的606个可信度SNP，将其中三个SNP物理位置分别为663.18Mb，669.71Mb和671.86Mb，转化成3个CAPS标记YrAN1589-CAPS1，YrAN1589-CAPS2和YrAN1589-CAPS3，用这些标记构建遗传图谱，将YrAN1589定位在分子标记YrAN1589-CAPS2和CAPS3之间的4.0cM的遗传区间内，对应6.6Mb物理区段(663.1-669.7Mb)。其中引物对YrAN1589-CAPS2与YrAN1589的连锁距离最近，为1.4cM，PCR检测结果如图1所示。图1中，M为Marker，Pr为安农1589，Ps为铭贤169，R为抗病单株，S为感病单株。
用引物对YrAN1589-CAPS2的扩增产物经AciI酶切之后2％琼脂糖凝胶电泳检测，出现了两种带型，分别称为带型A1(具有324bp，187bp和137bp的特异片段)和带型A2(具有324bp的特异片段)，安农1589和抗病单株扩增酶切之后可显示出324bp，187bp和137bp的特异DNA片段，铭贤169和感病单株扩增酶切之后显示出324bp的特异DNA片段。
采用基因组挖掘的方法，以中国春的参考基因组(Triticum_aestivum IWGSCreference v1.0)为序列模板设计引物，以安农1589和铭贤169的基因组DNA为PCR模板，开发了1个CAPS分子标记YrAN1589-CAPS5。以安农1589/铭贤169F2单株的基因组DNA为模板，进行PCR检测，结果表明YrAN1589-CAPS5与YrAN1589的连锁距离为1.3cM，YrAN1589-CAPS5的PCR检测结果如图2所示。图2中，M为Marker，Pr为中麦175，Ps为Avocet S，R为抗病单株，S为感病单株。用引物对YrAN1589-CAPS5的扩增产物经AciI酶切之后2％琼脂糖凝胶电泳检测，出现了两种带型，分别称为带型B1(具有348bp，267bp和81bp的特异片段)和带型B2(具有267bp和81bp的特异片段)，安农1589和抗病单株扩增酶切之后可显示出348bp，267bp和81bp的特异DNA片段，铭贤169和感病单株扩增酶切之后显示出267bp和81bp的特异DNA片段。
以安农1589/铭贤169F2单株的基因组DNA为模板，利用上述8个标记(2个SSR标记Xwmc291和Xwmc418、1个STS标记YrAN1589-STS1和5个CAPS标记YrAN1589-CAPS1，YrAN1589-CAPS2，YrAN1589-CAPS3，YrAN1589-CAPS4，YrAN1589-CAPS5)进行PCR扩增获得PCR扩增产物。用MapMaker3.0进行处理，绘制基因连锁图，如图3所示，8个标记均与抗条锈病基因连锁，将YrAN1589定位在分子标记YrAN1589-CAPS2和YrAN1589-CAPS5之间2.7cM的遗传区间内。
与小麦抗条锈病基因YrAN1589连锁的分子标记YrAN1589-CAPS2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；YrAN1589-CAPS5的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；YrAN1589-CAPS2和YrAN1589-CAPS5用于鉴定或辅助鉴定小麦抗条锈病性状。
用于检测分子标记YrAN1589-CAPS2的引物对1如下：
上游引物F1：5’-AATGGAGACTTTGCACCCA-3’(SEQ ID No.3)，
下游引物R1：5’-CCTGGAGTTCATCCGAGTA-3’(SEQ ID No.4)。
用于检测分子标记YrAN1589-CAPS5的引物对2如下：
上游引物F2：5’-GTGTCCTAACCCTAACTCCA-3’(SEQ ID No.5)，
下游引物R2：5’-TCATCCGAACTCAACAAAC-3’(SEQ ID No.6)。
所述引物对1用于扩增分子标记YrAN1589-CAPS2(SEQ ID No.1)，分子标记YrAN1589-CAPS2为以小麦基因组DNA为模板采用上游引物F1(SEQ ID No.3)和下游引物R1(SEQ ID No.4)组成的引物对进行PCR扩增得到的DNA片段。
所述引物对2用于扩增分子标记YrAN1589-CAPS5(SEQ ID No.2)，分子标记YrAN1589-CAPS5为以小麦基因组DNA为模板采用上游引物F2(SEQ ID No.5)和下游引物R2(SEQ ID No.6)组成的引物对进行PCR扩增得到的DNA片段。
分子标记YrAN1589-CAPS2的核苷酸序列为：
5’-AATGGAGACTTTGCACCCAGGAACTGCAGCCGGTACAGAAAAACAGAT GCATATGTAGTACAAAATTCTTAGCTGGTGCTCATGATGCACATGTAGAATACGTTTAATCAGAAAAACCGAGAGCAGTTACAAACTGCAGTGTATCGCCGGGTCATGTTACGAAAGAACTGCAGATTAGTTTCTACTACTACCCCACGGTCAACACTAAGATCTGTAATACCAAAAACAGCATTCAAACTTGTTTCAGGGCAAAACTACAGCTATTTTCCATGTCGATGTAGCCGGAATTTCCATTGGCACCAACCTACTCGGATGAACTCCAGG-3’(SEQ ID No.1)。
分子标记YrAN1589-CAPS5的核苷酸序列为：
5’-GTGTCCTAACCCTAACTCCAGCACTGTAAATTCTCAAATATTCCCCCTAC ACCAGAGGGGGTGCAAAAATACTTCTCCACCGCCATAATCTTATGTTCTTGTGATATCCCATCTTGAGCCTTTTCCAGTACTCCGTCGGAGGGGGATTCGATCACGGAGGGCATCTACATCAACGTAGTTGCCCTTTCGATGATGTGTGAGTAGTTTACCACAGACCTACGGGTCCATAGCTGGTAGCCAGATGGCTTCTTCTCTCTCTTTGATCTTCAATACAATGTTCTCCTCGATGTTCTTGGAGATCTATTCGGTGTAATCTTCTTTTGTGGTGTGTTTGTTGAGTTCGGATGA-3’(SEQ ID No.2)。
实施例2、分子标记及其检测引物的应用
本实施例为实施例1中开发设计的分子标记YrAN1589-CAPS2和YrAN1589-CAPS5及其检测引物对1和引物对2在鉴定或辅助鉴定小麦抗条锈病性状中的应用，建立了一种利用YrAN1589-CAPS2和YrAN1589-CAPS5及其检测引物对(引物对1和引物对2)筛选抗条锈病小麦的方法。
1、待测株系的获得
(1)以安农1589为母本，以铭贤169为父本，进行杂交，得到F1代种子。
(2)F1代种子长成的植株为F1代植株，F1代植株自交获得F2代种子。
(3)种植F2代种子，获得F2代单株，从中随机选取10个单株。
(4)步骤(3)得到的每个单株自交产生株系，10个单株总计产生10个株系，依次命名为A1株系至A10株系。
2、用引物对1和引物对2从待测株系中筛选抗条锈病小麦
取A1株系至A10株系(F2代单株的自交后代)，取安农1589和铭贤169，分别作为待测小麦进行如下检测：
(1)提取待测小麦叶片的基因组DNA。
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，采用YrAN1589-CAPS2引物对(引物对1)进行PCR扩增。
PCR反应体系：2×PCR Taq Mix 10μl，ddH2O 6.4μl，Forward Primer(引物F1，浓度10μmol/L)0.8μl，Reverse Primer(引物R1，浓度10μmol/L)0.8μl，DNA 2μl。
PCR扩增程序：95℃5min；94℃30s、61℃30s、72℃30s，36个循环；72℃10min。
(3)将步骤(2)得到的扩增产物进行酶切，获得酶切产物。
酶切反应体系：10×CutSmart Buffer 1.0μl，ddH2O 3.8μl，AciI 0.2μl，PCR扩增产物5μl。
酶切反应条件：37℃8h。
(4)将步骤(3)得到的酶切产物进行2％琼脂糖凝胶电泳。
按照如下标准检测待测小麦抗条锈病性状：
如果酶切产物为324bp，187bp和137bp的三个片段，则待测小麦携带小麦抗条锈病基因YrAN1589抗病等位基因，即待测小麦为抗条锈病小麦；
若待测小麦的扩增产物不能被AciI酶切，则待测小麦携带小麦抗条锈病基因YrAN1589感病等位基因，即待测小麦为感条锈病小麦。
结果表明：A1株系、A3株系、A4株系、A6株系、A7株系和A8株系均与安农1589的带型相同，显示具有324bp，187bp和137bp三个特异片段，因此将A1株系、A3株系、A4株系、A6株系、A7株系和A8株系鉴定为抗条锈病小麦；A2株系、A5株系、A9株系和A10株系与铭贤169的带型相同，显示具有324bp的特异片段，不具有187bp和137bp的特异片段，因此将A2株系、A5株系、A9株系和A10株系鉴定为感条锈病小麦。
(5)将步骤(2)得到的PCR扩增产物进行测序验证，与步骤(4)得到的结果一致。
(6)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，采用YrAN1589-C4PS5引物对(引物对2)进行PCR扩增，得到扩增产物。
PCR反应体系：2×PCR Taq Mix 10μl，ddH2O 6.4μl，Forward Primer(引物F2，浓度10μmol/L)0.8μl，Reverse Primer(引物R2，浓度10μmol/L)0.8μl，DNA 2μl。
PCR扩增程序：95℃5min；94℃30s、54℃30s、72℃30s，36个循环；72℃10min。
(7)将步骤(6)得到的PCR产物进行酶切，得到酶切产物。
酶切反应体系：10×CutSmart Buffer 1.0μl，ddH2O 3.8μl，AciI 0.2μl，PCR扩增产物5μl。
酶切反应条件：37℃8h。
(8)将步骤(7)得到的酶切产物进行2％琼脂糖凝胶电泳。
按照如下标准检测待测小麦抗条锈病性状：
如果酶切产物为348bp，267bp和81bp的三个片段，则待测小麦携带小麦抗条锈病基因YrAN1589抗病等位基因，即待测小麦为抗条锈病小麦；
如果酶切产物为267bp和81bp两个片段，则待测小麦携带小麦抗条锈病基因YrAN1589感病等位基因，即待测小麦为感条锈病小麦。
结果表明：A1株系、A3株系、A4株系、A6株系、A7株系和A8株系均与安农1589的带型相同，显示具有348bp，267bp和81bp三个特异片段，因此将A1株系、A3株系、A4株系、A6株系、A7株系和A8株系鉴定为抗条锈病小麦；A2株系、A5株系、A9株系和A10株系与铭贤169的带型相同，显示具有267bp和81bp两个特异片段，不具有348bp的特异片段，因此将A2株系、A5株系、A9株系和A10株系鉴定为感条锈病小麦。
3、抗病型鉴定
利用条锈菌接种的方法分别检测步骤2中的各个待测小麦的抗病性，步骤如下所示：
待检材料按每钵10粒种子种植，将每一粒种子按顺时针均匀摆放在植于9cm×9cm×9cm的塑料钵中，当需要鉴定的麦苗长到一心一叶的时候，利用扫抹法将条锈菌小种CYR32的孢子均匀接种至小麦叶片，扫抹法接种具体流程是：将0.05％的吐温20均匀地喷洒在待接种的材料上，使叶面表面形成雾状水滴，然后拿一盆待接菌种对着材料扫抹，该过程使含菌种的叶片与材料叶片充分接触，接种完后放在可控温室内潜育发病。表型鉴定方法：当对照材料铭贤169发病充分时(通常14d左右)，可采用6级标准来对单株侵染型分级。0～2表示抗病；3～4表示感病。
结果见表3。结果表明：A1株系、A3株系、A4株系、A6株系、A7株系和A8株系为抗病型株系，A2株系、A5株系、A9株系和A10株系为感病型株系。
表3、安农1589、铭贤169以及F2代单株的自交后代对CYR32的苗期侵染型
株系名称 侵染型
安农1589 10株植株均侵染型IT＝0；
铭贤169 10株植株均侵染型IT＝4
A1 12株植株均侵染型IT＝0；
A2 4株植株侵染型IT＝3,5株植株均侵染型IT＝4
A3 1株植株侵染型IT＝0，6株植株侵染型IT＝0；
A4 9株植株均侵染型IT＝0；
A5 3株植株侵染型IT＝3，3株植株侵染型IT＝4
A6 2株植株侵染型IT＝0,5株植株侵染型IT＝0；
A7 1株植株侵染型IT＝0,8株植株均侵染型IT＝0；
A8 7株植株均侵染型IT＝0；
A9 4株植株侵染型IT＝3，4株植株侵染型IT＝4
A10 5株植株侵染型IT＝3,2株植株侵染型IT＝4
以上结果表明，利用分子标记YrAN1589-CAPS2和YrAN1589-CAPS5可应用于筛选、辅助鉴定具有抗条锈病性状的小麦。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1.用于鉴定或辅助鉴定小麦抗条锈病性状的分子标记，其特征在于，所述分子标记为下述任一种：
A1)分子标记YrAN1589-CAPS2，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
A2)分子标记YrAN1589-CAPS5，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.用于检测权利要求1中所述分子标记的PCR引物，其特征在于，所述PCR引物为下述任一种：
B1)用于检测权利要求1中所述分子标记YrAN1589-CAPS2的引物对1，所述引物对1由上游引物F1和下游引物R1组成，所述上游引物F1为核苷酸序列是SEQ IDNo.3的单链DNA，所述下游引物R1为核苷酸序列是SEQ ID No.4的单链DNA；
B2)用于检测权利要求1中所述分子标记YrAN1589-CAPS5的引物对2，所述引物对2由上游引物F2和下游引物R2组成，所述上游引物F2为核苷酸序列是SEQ IDNo.5的单链DNA，所述下游引物R2为核苷酸序列是SEQ ID No.6的单链DNA。
3.用于鉴定或辅助鉴定小麦抗条锈病性状的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的PCR引物。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括限制性内切酶AciI。
5.权利要求1所述的分子标记、权利要求2所述的PCR引物或权利要求3或4所述试剂盒的下述任一种应用：
C1)在鉴定或辅助鉴定小麦抗条锈病性状中的应用；
C2)在筛选或辅助筛选抗条锈病小麦中的应用。
6.一种鉴定或辅助鉴定小麦抗条锈病性状的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
D1)以待鉴定小麦基因组DNA为模板，利用权利要求2所述的PCR引物进行PCR扩增，得到PCR产物；
D2)用AciI酶切所述PCR产物；
D3)根据酶切结果来鉴定或辅助鉴定小麦抗条锈病性状。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述D3)为：
当利用权利要求2中所述的引物对1进行PCR扩增时，若待鉴定小麦的PCR产物能被AciI酶切为324bp，187bp和137bp的三个片段，则待鉴定小麦具有或候选具有抗条锈病性状；若待鉴定小麦的PCR产物不能被AciI酶切，则待鉴定小麦具有或候选具有感条锈病性状；
当利用权利要求2中所述的引物对2进行PCR扩增时，若待鉴定小麦的PCR产物能被AciI酶切为348bp，267bp和81bp的三个片段，则待鉴定小麦具有或候选具有抗条锈病性状；若待鉴定小麦的PCR产物能被AciI酶切为267bp和81bp的两个片段，则待鉴定小麦具有或候选具有感条锈病性状。
8.一种检测小麦抗条锈病基因YrAN1589等位基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
E1)以待测小麦基因组DNA为模板，利用权利要求2所述的PCR引物进行PCR扩增，得到PCR产物；
E2)用AciI酶切所述PCR产物；
E3)根据酶切结果来判断小麦抗条锈病基因YrAN1589等位基因。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述E3)为：
当利用权利要求2中所述的引物对1进行PCR扩增时，若待测小麦的PCR产物能被AciI酶切为324bp，187bp和137bp的三个片段，则待测小麦含有或候选含有YrAN1589抗病等位基因；若待测小麦的PCR产物不能被AciI酶切，则待测小麦含有或候选含有YrAN1589感病等位基因；
当利用权利要求2中所述的引物对2进行PCR扩增时，若待测小麦的PCR产物能被AciI酶切为348bp，267bp和81bp的三个片段，则待测小麦含有或候选含有YrAN1589抗病等位基因；若待测小麦的PCR产物能被AciI酶切为267bp和81bp的两个片段，则待测小麦含有或候选含有YrAN1589感病等位基因。
10.一种选育抗条锈病小麦的方法，其特征在于，所述方法为F1)和/或F2)：
F1)按照权利要求6或7所述的方法，选育出具有抗条锈病性状的小麦；
F2)按照权利要求8或9所述的方法，选育出含有抗条锈病基因YrAN1589抗病等位基因的小麦。
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