CN117887880A - 一种与辣椒核雄性不育基因msc-4共分离的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及蔬菜分子育种技术领域，公开了一种与辣椒细胞核雄性不育基因msc‑4共分离的分子标记及其应用。本发明所述分子标记CaMSC4属dCAPS标记，由特异引物CaMSC4‑F和CaMSC4‑R组成，配合核酸限制性内切酶Taq I使用。按照本发明提供的分子标记及其应用方法，可通过靶序列的酶切产物带型来准确甄别雄性不育和可育株。本发明提供的共分离标记，在细胞核雄性不育辣椒品种转育过程中，可以提高转育效率，降低成本；在辣椒杂交制种过程中，可以帮助提前剔除可育株，从而节约土地和人工成本。总之，本发明所提供分子标记在辣椒育种和制种中均具有重要应用价值。

Description

一种与辣椒核雄性不育基因msc-4共分离的分子标记及其 应用

技术领域

本发明涉及蔬菜分子育种技术领域，具体涉及一种与辣椒细胞核雄性不育基因msc-4共分离的分子标记和应用。

背景技术

辣椒是世界各国广泛栽培的重要经济作物。辣椒杂种优势十分明显，利用雄性不育系进行制种是辣椒杂种优势高效利用的重要途径。辣椒雄性不育包括细胞质核互作雄性不育(cytoplasmic male sterility，CMS)和细胞核雄性不育(genic male sterility，GMS)两种类型，其中GMS有不育性稳定、不受恢保关系制约以及转育程序简单等优点。因此，GMS是辣椒育种领域备受关注的重要性状之一。

分子标记辅助选择(marker assisted selection，MAS)是利用分子标记与目标基因紧密连锁的特点，通过对杂交后代进行基因分型从而选育出携带目标基因型的后代或个体的技术。该技术已在水稻、玉米和小麦等粮食作物以及番茄和黄瓜等园艺作物中广泛应用，极大提高了育种效率，切实保障了人类粮食安全和提高了人类生活品质。

辣椒GMS系的选育或转育通常采用饱和回交的方法。然而GMS多为隐性性状，每次回交需自交并待开花后选择出不育单株作为母本，导致选育时间长、土地成本高、工作量大。将分子标记应用于辣椒GMS系的选育或转育，可在苗期进行基因型选择，每一季仅种植标记基因型为杂合的单株，同时还省去了传统育种所需的鉴定回交母本基因型的自交程序，大大节约了土地成本、缩短了育种时间并减轻了工作量。此外，在利用GMS系进行杂交制种过程中，利用GMS基因共分离分子标记可以帮助提前剔除可育株，免除人工拔除可育株，从而节约土地和人工成本。因此，开发与辣椒GMS基因共分离的分子标记对于辣椒的杂交育种和制种均具有重要应用价值。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一个与辣椒GMS基因共分离的分子标记。该GMS基因是在一种簇生朝天辣椒中发现的，其所处染色体位置与辣椒中已有的相关报道均不相同。该GMS基因的共分离标记CaMSC4对核雄性不育两用系MSC4AB及其衍生的F₂育性分离群体和可育自然群体均适用，可以准确甄别上述育性分离群体中的雄性不育和雄性可育植株。

本发明的另一目的在于提供分子标记CaMSC4的引物对，包含两条单链核苷酸引物CaMSC4-F和CaMSC4-R，见序列表中SEQ1和SEQ2。

本发明的再一目的在于提供一种包含上述引物的试剂盒。以待测辣椒苗基因组DNA为模板，用本发明提供的试剂盒进行PCR扩增后可得到长度为81～82bp的小片段DNA，即为分子标记CaMSC4的靶片段，其序列见序列表中SEQ3。

本发明的第四个目的在于提供上述分子标记、引物对以及试剂盒在辣椒育性表型鉴定或辅助选择育种中的应用。采用上述引物得到的CaMSC4靶片段经限制性内切酶Taq I酶切和聚丙烯酰胺凝胶电泳后，可清楚地分辨电泳带型和鉴定植株的基因型，据此准确预判辣椒植株的花粉育性表型。

本发明的第五个目的在于提供一种辣椒雄性不育和雄性可育植株的鉴定方法。

本发明采用的具体方案为：

第一方面，一种与辣椒细胞核雄性不育基因msc-4共分离的分子标记，所述分子标记为核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的靶序列或包含所述靶序列的基因序列；所述靶序列的第24～27位碱基为Taq I限制性内切酶识别位点，不育株缺失第27位的A碱基。

第二方面，扩增上述分子标记的引物对。进一步地，所述引物对包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的特异引物对CaMSC4-F和CaMSC4-R。

第三方面，包含上述引物对的试剂盒。进一步地，所述试剂盒还包括含镁离子的PCRbuffer、dNTP、Taq酶和ddH₂O。

第四方面，上述分子标记、引物对以及试剂盒在辣椒育性表型鉴定或辅助选择育种中的应用。

第五方面，一种辣椒雄性不育和雄性可育植株的鉴定方法，从待测辣椒单株的基因组DNA中特异扩增获得上述分子标记，再经酶切和电泳程序完成辣椒单株的基因分型，最终根据基因型甄别待测辣椒单株的育性。

上述方法具体包括以下步骤：

步骤一、提取待测植株辣椒基因组DNA；

步骤二、以步骤一提取的辣椒基因组DNA为模板，采用上述引物对扩增靶序列；

步骤三、采用Taq I限制性内切酶对步骤二扩增得到的靶序列进行酶切，然后根据电泳后的条带情况鉴定可育株和不育株。

进一步地，步骤三中，具体鉴定方法为：

当待测植株来源于MSC4AB两用系，若电泳后出现大小分别为81bp和58bp的两个条带，则为可育株；若电泳后仅出现大小为81bp的一个条带，则为不育株；

当待测植株来源于F2群体，若电泳后仅出现大小为58bp的一个条带，则为纯合可育株；若电泳后出现大小分别为81bp和58bp的两个条带，则为杂合可育株；若电泳后出现大小为81bp的一个条带，则为不育株。

有益效果：本发明通过BSA-seq分析和验证，开发了一个与辣椒细胞核雄性不育基因msc-4共分离的分子标记CaMSC4。CaMSC4属dCAPS(derived cleavedamplifiedpolymorphic sequences)标记，由特异引物CaMSC4-F和CaMSC4-R组成，配合核酸限制性内切酶Taq I使用。按照本发明提供的分子标记及其应用方法，可通过靶序列的酶切产物带型来准确甄别雄性不育和可育株。本发明提供的共分离标记，在辣椒杂交制种过程中，可以帮助提前剔除可育株，从而节约土地和人工成本；在细胞核雄性不育辣椒品种转育过程中，可以提高转育效率，降低成本。总之，本发明所提供分子标记在辣椒育种和制种中均具有重要应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1的辣椒细胞核雄性不育两用系MSC4AB中不育株和可育株的花粉育性表型。图(a)中不育株开放花朵上的花药开裂后无明显肉眼可见的花粉，图(b)中可育株开放花朵上的花药开裂后其表面布满大量肉眼可见的花粉。标尺长度为5.0mm。

图2为实施例1中BSA-seq分析获得的Δ(SNP-index)全基因组分布图，黑色折线为各位点的Δ(SNP-index)拟合平均值，蓝色和红色折线分别为95％和99％置信度阈值线。

图3为共分离标记CaMSC4的开发原理示意。图(a)示候选共分离位点附近序列的比对结果，图(b)示共分离标记CaMSC4对(纯合)可育株(Msc-4Msc-4)靶标序列的扩增和配套限制性核酸内切酶Taq I的可切割性，图(c)示共分离标记CaMSC4对纯合不育株(msc-4msc-4)靶序列的扩增和配套限制性核酸内切酶Taq I的非切割性。红色碱基表示关键变异位点，蓝色碱基表示核酸内切酶识别序列。

图4为核雄性不育两用系MSC4AB中不育株和可育株通过共分离标记CaMSC4进行基因型分析的结果。M表示DNA ladder；MS表示两用系中的纯合不育株，全部对应A带型；MF表示两用系中的杂合可育株，全部对应H带型。

图5为F₂分离群体中不育株和可育株通过共分离标记CaMSC4进行基因型分析的结果。M表示DNA ladder；MF表示F₂群体中的可育株，全部对应H或B带型；MS表示F₂群体中的不育株，全部对应A带型。

图6为不同遗传背景的辣椒雄性可育自交系通过共分离标记CaMSC4进行基因型分析的结果。M表示DNA ladder；MF为F₂群体中的纯合可育株，MS表示两用系群体中的不育株，19份不同遗传背景的雄性可育自交系全部对应B带型。

图7共分离标记CaMSC4在核雄性不育两用系转育中的应用方法。MSC4A表示核雄性不育两用系MSC4AB中的不育株；Rec表示需要进行核雄性不育基因导入的受体亲本；MAS表示利用共分离标记CaMSC4及其相关试剂盒进行辅助选择；育种年次按一年种植2茬计算。

具体实施方式

A.一个与辣椒GMS基因共分离的位点的筛选，它包含以下步骤：

1)DNA样品构建：利用经过花粉育性表型鉴定的辣椒细胞核雄性不育两用系MSC4AB群体，分别构建不育DNA池(sterile pool，SP)样品，可育DNA池(fertile pool，FP)样品，以及不育单株DNA样品(sterile individual，SI)。

2)重测序和多态性位点筛选：将以上3个样品经二代高通量重测序后，分别比对至Zunla-1辣椒参考基因组，获取在SP、FP和SI样品间存在多态性的变异位点。

3)连锁位点筛选：根据MSC4AB的不育性遗传特征，可知与GMS基因有潜在连锁关系的位点在SI、SP和FP中的不育等位基因频率分别应该约等于1、1和0.5。据此对上述位点进行过滤，仅保留在SP和FP样品间有多态性的位点，获得与GMS基因连锁的候选位点共15,767个。

4)共分离位点的筛选：上述与GMS基因连锁的候选位点中，若某位点与GMS基因共分离，则该位点在SI和SP样品的重测序数据中的对应reads应全部为不育等位型。据此，筛选出与GMS基因共分离的位点695个，其中仅有一个位点引起非同义突变。该位点的物理坐标为Zunla-1参考基因组第3染色体248,789,782bp处，参考基因组此处为A碱基。重测序结果表明，FP样品中此处为A碱基和A碱基缺失的杂合型，SP样品中此处为A碱基缺失的纯合型。

B.分子标记CaMSC4的开发、制备试剂盒和使用方法，主要有以下内容：

1)分子标记CaMSC4的开发：根据Zunla-1参考基因组第3染色体248,789,782bp位置的两侧序列，设计了一个dCAPS标记CaMSC4，它由两条单链核苷酸引物CaMSC4-F和CaMSC4-R组成，其序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

2)分子标记CaMSC4的制备试剂盒：该试剂盒除了包含共分离标记CaMSC4的两条引物外，还包含PCR buffer(含镁离子)、dNTP、Taq酶和ddH₂O。该试剂盒包含了PCR扩增靶序列的全部成分。

3)分子标记CaMSC4的使用方法：利用上述试剂盒，通过特定PCR反应程序，可在辣椒基因组DNA中扩增出长度为81～82bp的小片段DNA，其序列如SEQ ID NO：3。当以MSC4AB两用系中可育株的基因组DNA为模板时，得到的PCR片段经限制性内切酶Taq I酶切和聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将可见两个大小分别为81bp和58bp的条带(将此带型定义为H带型)；当以不育株的基因组DNA为模板，经同样方法酶切和电泳后，则仅可见一个大小为81bp的条带(将此带型定义为A带型)。当分别以F₂群体中可育株和不育株的基因组DNA为模板时，纯合可育株对应一个大小为58bp的条带(将此带型定义为B带型)，杂合可育株对应H带型，不育株对应A带型。此外，用该分子标记对可育自交系进行分型，将得到B带型。因此依据电泳带型可准确判断目标辣椒材料的基因型，从而达到甄别不育株和可育株的目的以及应用于辅助选择育种。

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。

以下的实施例便于更好理解和应用本发明提供的技术方案，但本发明的保护范围不限于此。下述实施例中所采用的实验方法和试剂，如无特别说明，均指常规方法和试剂。

实施例1：共分离标记CaMSC4的开发

1)辣椒核雄性不育两用系MSC4AB(从商业杂交种中分离和选育而成)的花粉育性表型调查：将MSC4AB群体按常规栽培方法种植于塑料大棚，分别于始花期和盛花期进行育性表型调查。将花朵开放、花药开裂后肉眼可见大量花粉的单株视为可育株(图1a)，无明显花粉、不能自然坐果的则视为不育株(图1b)；每次调查时，每个单株至少观察3个花朵。

2)GMS基因的遗传规律分析：以MSC4AB中的一个不育单株为母本与可育自交系BB3进行杂交，获得F₁种子并种植后进行隔离自交获得F₂群体种子。通过在田间种植360株的F₂群体，按照步骤1)的方法进行花粉育性表型调查，结果发现其中283株为可育株，77株为不育株。经卡平方适合性检验发现，可育株和不育株的数量之比符合3︰1(P＝0.11，χ²＝0.02)，表明该GMS基因的遗传符合单基因隐性遗传规律。

3)重测序样品的DNA获取：根据步骤1)的花粉育性表型调查结果，从MSC4AB两用系群体中选取50株可育株，然后从每株分别取等量嫩叶混合，置于研钵中加入液氮研磨成粉末并用CTAB法提取基因组DNA，最终得到可育池DNA样品(fertile pool，FP)。同理，获取不育池DNA样品(sterile pool，SP)。此外，还提取一株不育株的DNA样品(sterileindividual，SI)，用于后续定义不育等位型。

4)BSA-seq分析：将上述SP、FP和SI样品进行重测序(测序深度约30×)，质控过滤后分别比对至Zunla-1参考基因组，进行全基因组变异信息提取。根据MSC4AB的不育性遗传特征，可知与GMS基因有潜在连锁关系的位点在SI、SP和FP中的基因型分别应该为隐性纯合、隐性纯合和隐性杂合。因此，若将与Zunla-1相同的等位型视为可育等位型，与SI相同的等位型视为不育等位型，则与GMS基因连锁的位点其不育等位型频率在SP和FP中分别应接近于1和0.5。于是设定筛选条件为SP·SNP-index≥0.7且0.3≤FP·SNP-index≤0.7，由此得到与不育基因连锁的高可信度多态性位点共15,767个。基于上述标记对不育基因进行基于Δ(SNP-index)的BSA-seq分析，取95％置信度，结果共发现19个与核不育基因关联的区间(图2)。

5)共分离位点的筛选：由于步骤2)的结果清楚表明MSC4AB的不育表型受单基因调控，然而步骤4)的生物信息学分析却在各染色体上共检测到多达19个区间与GMS基因连锁，因此基于Δ(SNP-index)的BSA-seq分析方法不适用于MSC4AB两用系群体中的GMS基因定位。于是转变分析策略，基于步骤4)中15,767个多态性位点的相关reads进一步分析：首先筛出基因型在SI样本中为纯合不育(1|1)型，在SP样本中为纯合不育(1|1)型，且在FP样本中为杂合可育(0|1)型的位点，共695个；然后，对以上695个位点按进一步过滤(即SNP-index)，筛出SI·SNP-index＝1且SP·SNP-index＝1的位点共85个，将这些位点作为候选共分离位点。基于Zunla-1参考基因组对以上85个候选共分离位点进行注释分析，发现其中仅有一个位点造成非同义突变。该位点的物理坐标为Zunla-1参考基因组第3染色体248,789,782bp处，参考基因组此处为A碱基，可育池中此处为A碱基和A碱基缺失的杂合型，不育池中此处为A碱基缺失的纯合型。

6)共分离标记开发：基于Zunla-1基因组第3染色体248,789,782bp旁侧序列和MSC4AB不育株在此处的变异特征(图3a)，在Snapgene软件辅助下设计了一对dCAPS标记引物CaMSC4(图3b和c)，按设计原理Taq I限制性核酸内切酶能切割可育株的靶序列，但不能切割不育株的靶序列。

分子标记CaMSC4包含两条单链核苷酸引物CaMSC4-F和CaMSC4-R，核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；分子标记CaMSC4的靶片段如SEQ ID NO：3所示。

引物序列如下：

CaMSC4-F：5’-TGACTAAGCTTGGCATCATAGAGTCG-3’

CaMSC4-R：5’-CTCCAAGGTCTCATACTTTCTCATAAC-3’。

靶序列如下：

(下划线为Taq I限制性内切酶识别位点，加粗的A碱基表示其在不育株中缺失)。

实施例2：共分离标记CaMSC4及相关试剂盒的应用

1)共分离标记CaMSC4在核雄性不育系MSC4AB中的应用：按照实例1中的方法，对253株MSC4AB核雄性不育两用系群体进行育性表型鉴定，结果发现该群体包含179株可育株和74株不育株。用CTAB法提取各单株的DNA作为模板，使用表1中所示的试剂盒，并按照表2所示的反应程序进行靶序列的PCR扩增。然后，按照表3所示的Taq I酶切反应体系和表4所示的Taq I酶切反应程序对来自于各单株的PCR产物(靶序列)进行TaqI酶切。最后，将酶切后的产物用6％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分型。结果发现，所有不育株都对应A带型，所有可育株则都对应H带型(图4)。这与核雄性不育两用系MSC4AB中不育株为隐性纯合基因型(msc-4msc-4)，可育株为杂合基因型(Msc-4msc-4)的特征相吻合。以上结果表明，采用本发明提供的分子标记CaMSC4及相关试剂盒，可以达到100％甄别辣椒核雄性不育系MSC4AB中的可育株和不育株的效果。

表1试剂盒成分

表2PCR反应程序

表3Taq I酶切反应体系

表4Taq I酶切反应程序

2)共分离标记CaMSC4在F₂育性分离群体中的应用：以辣椒核雄性不育两用系MSC4AB中的一个不育株MSC4A(msc-4msc-4)作为母本，辣椒雄性可育自交系BB3(Msc-4Msc-4)作为父本，进行杂交后获得F₁材料，然后再自交获得F₂育性分离群体。种植940株F₂群体，按照实例1中的花粉育性表型鉴定方法，发现该群体中有736株可育株和203株不育株。按照实例2中步骤1)的方法对F₂群体各单株进行基因分型，发现所有可育株均对应H或B带型，不育株则对应A带型(图5)。以上结果表明，采用本发明提供的分子标记CaMSC4及相关试剂盒在苗期对辣椒植株进行基因分型，可以达到100％甄别辣椒F₂育性分离群体中的可育株和不育株的效果。

3)共分离标记CaMSC4在自然群体中的应用：按照实例2中步骤1)的方法，利用分子标记CaMSC4对99个具有不同遗传背景的雄性可育自交系(表5)进行分析，结果发现所有材料都得到B带型，其中19份不同遗传背景的雄性可育自交系基因分型结果见图6，表明本发明提供的分子标记CaMSC4及相关试剂盒在可育自交系中同样适用。据此，说明本发明提供的分子标记CaMSC4及相关试剂盒，在将不育基因msc-4转育到其他可育自交系从而选育出新的辣椒核雄性不育系的过程中具有重要价值。

表5标记CaMSC4对自然群体的基因分型结果

4)共分离标记CaMSC4及相关试剂盒在核不育两用系转育过程中的应用：回交育种是将核不育基因转育到目标材料中的主要方法。当以MSC4AB中的不育株(MSC4A)作为供体亲本进行回交转育时，由于不育表型为隐性性状，则需要将回交一代自交，然后在自交后代中选不育单株再行回交；或者，在回交一代中同时作较多的回交和自交，下一茬同时种植回交和自交株系，凡自交后代育性会分离的回交一代株系，说明其回交后代可供进一步选株回交和自交。而自交后代不分离的，相应的回交后代可直接淘汰。然而，这两种方法都存在田间工作量大、栽培成本高和(或)转育年限长的缺点。在核不育两用系转育过程中，本发明提供的共分离标记CaMSC4及相关试剂盒可在定植前就快速鉴定基因型，仅筛出携带隐性不育基因的杂合回交后代用于再次回交，据此省去了用于田间基因型鉴定的自交步骤和(或)不必要的回交组合，从而缩短育种时间并省去数倍的土地消耗和栽培等成本(图7)。

需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种与辣椒细胞核雄性不育基因msc-4共分离的分子标记，其特征在于：所述分子标记为核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的靶序列或包含所述靶序列的基因序列；所述靶序列的第24～27位碱基为Taq I限制性内切酶识别位点，不育株缺失第27位的A碱基。

2.扩增权利要求1所述分子标记的引物对。

3.根据权利要求2所述的引物对，其特征在于：所述引物对包括核苷酸序列分别如SEQID NO：1和SEQ ID NO：2所示的特异引物对CaMSC4-F和CaMSC4-R。

4.包含权利要求2所述引物对的试剂盒。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括含镁离子的PCRbuffer、dNTP、Taq酶和ddH₂O。

6.根据权利要求1所述的分子标记、权利要求2-3任意一种所述的引物对或权利要求4-5任意一种所述的试剂盒在辣椒育性表型鉴定或辅助选择育种中的应用。

7.一种辣椒雄性不育和雄性可育植株的鉴定方法，其特征在于：从待测辣椒单株的基因组DNA中特异扩增权利要求1所述的分子标记，再经酶切和电泳程序完成辣椒单株的基因分型，最终根据基因型甄别待测辣椒单株的育性。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

步骤一、提取待测植株辣椒基因组DNA；

步骤二、以步骤一提取的辣椒基因组DNA为模板，采用权利要求3所述的引物对扩增靶序列；

步骤三、采用Taq I限制性内切酶对步骤二扩增得到的靶序列进行酶切，然后根据电泳后的条带情况鉴定可育株和不育株。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤三中，具体鉴定方法为：

当待测植株来源于MSC4AB两用系，若电泳后出现大小分别为81bp和58bp的两个条带，则为可育株；若电泳后仅出现大小为81bp的一个条带，则为不育株；

当待测植株来源于F2群体，若电泳后仅出现大小为58bp的一个条带，则为纯合可育株；若电泳后出现大小分别为81bp和58bp的两个条带，则为杂合可育株；若电泳后出现大小为81bp的一个条带，则为不育株。