CN116751880A - 与玉米穗粗主效qtl紧密连锁的分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与玉米穗粗主效QTL紧密连锁的分子标记及其引物和应用，属于生物技术领域。所述分子标记位于玉米第5号染色体上，包括分子标记chr5‑30和分子标记M3。扩增所述分子标记chr5‑30的引物序列为：chr5‑30‑L：5’‑AAACAAATCTATGCGCCCAC‑3’；chr5‑30‑R：5’‑AATGGACCGGTTCTCCTAGC‑3’；扩增所述分子标记M3：M3‑L：5’‑TTCCTACCTGCGGTACTTGC‑3’；M3‑R：5’‑GGTGGTGCCTGCTACAGAGT‑3’。本发明提供的分子标记与玉米穗粗主效QTL紧密连锁，其及其引物可应用于穗粗分子标记辅助育种，应用于穗粗种质资源筛选，应用于玉米穗粗的遗传改良。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与玉米穗粗主效QTL紧密连锁的分子标记及应用。
背景技术
玉米是我国十分重要的粮食作物和经济作物，也是世界总产量最高的农作物，同时也是重要的可再生工业原料。随着社会经济的快速发展和经济市场的迫切需求，不断提高玉米产量是满足经济快速发展的需要以及市场对玉米衍生食品、饲料和生物燃料的需求。玉米单产主要由亩穗数和单穗籽粒重共同决定，其中单穗籽粒重又可分解为穗长(行粒数)和穗粗(穗行数)和百粒重等三个要素。穗粗作为育种家首先考虑的育种目标之一，筛选和鉴定穗粗种质资源是培育高产玉米新品种的重要途径。
玉米穗粗是一种典型的数量性状，且易受环境条件影响。通过传统育种方法选育穗粗种质资源存在选育周期长、效率低等问题。已有一些研究通过尝试各种技术手段进行相关基因的挖掘和克隆。但目前为止只有极少数的玉米穗粗QTL被精细定位或克隆。因此，开发用于穗粗玉米培育的分子标记已成为玉米穗粗遗传改良的关键任务。
QTL定位是分离目标基因及其紧密连锁分子标记的重要步骤，适宜的定位群体对QTL定位的速度与准确度至关重要。单片段代换系是指除目标区段外，染色体其余部分与受体均一致。该类材料遗传背景单一，在QTL分析中可以消除遗传背景的影响，提高了定位的准确性；同时避免了上位性互作的干扰，可以使微效QTL被检测出来，增强了QTL鉴别能力；通过比较不同的单片段代换系，可以直接鉴定到目标QTL区域，将数量性状的多个位点分解为多个的单个孟德尔因子，简化了数量性状研究过程。因此，单片段代换系已被广泛应用于QTL克隆和功能分析。
目前虽然有利用单片段代换系定位玉米穗粗基因，但获得的定位区间较大，分子标记难以在生产上应用。因此需要开发一种与目标基因紧密连锁的分子标记，以应用于玉米穗粗的遗传改良。
发明内容
本发明的目的是提供一种与玉米穗粗主效QTL紧密连锁的分子标记及应用，该分子标记与玉米穗粗主效QTL紧密连锁，可用于玉米穗粗分子标记辅助育种。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
与玉米穗粗主效QTL紧密连锁的分子标记，所述分子标记位于玉米第5号染色体上，为分子标记chr5-30和分子标记M3。
进一步，所述分子标记chr5-30具体位置chr5：84399694-84400040，所述分子标记M3具体位置chr5：85072289-85072443。本发明物理位置是参照V5版本。
与玉米穗粗主效QTL紧密连锁的分子标记的引物，扩增所述分子标记chr5-30的引物序列为：
chr5-30-L：5’-AAACAAATCTATGCGCCCAC-3’(序列1)；
chr5-30-R：5’-AATGGACCGGTTCTCCTAGC-3’(序列2)；
扩增所述分子标记M3：
M3-L：5’-TTCCTACCTGCGGTACTTGC-3’(序列3)；
M3-R：5’-GGTGGTGCCTGCTACAGAGT-3’(序列4)。
与玉米穗粗主效QTL紧密连锁的分子标记在玉米穗粗遗传改良中的应用。
进一步，在玉米穗粗遗传改良中鉴定玉米穗粗性状的方法包括以下步骤：
提取玉米叶片基因组DNA；
以玉米叶片基因组DNA为模板，利用引物chr5-30-L/chr5-30-R、M3-L/M3-R分别进行PCR扩增；
琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增结果：当采用的引物为chr5-30-L/chr5-30-R时，当检测出所述分子标记chr5-30为上带，则表示待检样品的穗粗较粗；当检测出所述分子标记chr5-30为下带，则表示待检样品的穗粗较细；当采用的引物为M3-L和M3-R时，当检测出所述分子标记M3为上带，则表示待检样品的穗粗较粗；当检测出所述分子标记M3为下带，则表示待检样品的穗粗较细。
进一步，所述PCR扩增体系10μL，组分包含：2μL DNA，左右引物各0.5μL，5μL2×TaqMaster Mix和2μL dd H2O。
进一步，利用Touchdown PCR扩增程序：95℃3min；95℃30s，65℃30s，每个循环降落1℃，72℃30s，共9个循环；95℃30s，58℃30s，72℃30s，共29个循环；72℃5min。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明与玉米穗粗主效QTL紧密连锁的分子标记与玉米穗粗主效QTL紧密连锁，可应用于穗粗分子标记辅助育种，应用于穗粗种质资源筛选，应用于玉米穗粗的遗传改良。
附图说明
图1为单片段代换系SSSL1272与许178穗粗比较图；
图2为第5号染色体上3对差异标记分布图；
图3为第5号染色体上1.08M范围内的目标基因；
图4为连锁差异标记图。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
在本发明的描述中，如未特殊说明，所用试剂均为市售，所用方法均为本领域常规技术。
实施例1
本实施例提供与玉米穗粗主效QTL的定位过程，具体如下：
(1)玉米单片段代换系群体的构建：
实验室前期以玉米自交系综3位供体亲本，许178位受体亲本通过多代的回交和自交，与SSR分子标记辅助选择相结合构建了单片段代换系。通过在新乡、浚县、许昌两年六个试验点的考察鉴定，通过对单片段代换系和许178的穗部性状考察，发现了单片段代换系SSSL1272与许178相比穗粗差异极其显著，结果参见图1。表明该单片段代换系存在一个控制穗粗的主效QTL。
(2)玉米穗粗主效QTLqED5初定位：
2.1定位群体的构建：在河南原阳和海南三亚试验基地种植单片段代换系SSSL1272和许178，以SSSL1272为母本，许178为父本，杂交组配F1。在海南试验基地种植F1和许178，以F1为母本，许178为父本构建新的BC1F1群体。
2.2穗粗表型鉴定：2019年10月收获后对BC1F1群体单株进行穗部性状调查，从回交一代群体中挑选出极端粗和极端细的极端表型，并于2019年12月和2020年6月分别在海南三亚和河南原阳试验基地种植鉴定单株自交后代BC1F2，设置一点三个重复，2020年3月和2020年10月对收获的单株利用考种仪对穗部性状进行测定。
2020年12月利用BC1F2群体筛选新的交换单株，2021年6月和2021年12月，挑选交换单株自交后代种植于河南原阳和海南鉴定表型。
2.3DNA提取和分子标记开发
利用SLS法提取玉米叶片基因组DNA，于-20℃冰箱保存备用。
从MaizeGDB(http://www.maizegdb.org/)数据库IBM 2008Neighbors Frame2分子标记参考图谱中，选取覆盖玉米全基因组的1000对SSR引物。
InDel标记开发：比对许178和综3基因组序列，挑选两个材料序列差异在5个碱基以上的位点，利用Primer3.0设计引物，引物长度在18-24bp之间，具体序列参见表1。
2.4PCR程序和扩增产物基因型分析
PCR扩增体系(10μL)组分包含：2μLDNA，1μL引物(左右引物各0.5μL)，5μL2×TaqMaster Mix(诺维赞)和2μLdd H2O。利用Touchdown PCR扩增程序：95℃3min；95℃30s，65℃30s(每个循环降落1℃)，72℃30s，共9个循环；95℃30s，58℃30s，72℃30s，共29个循环；72℃5min。PCR扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖胶电泳进行基因型分析。
2.5玉米穗粗主效QTL初定位
利用1000对均匀覆盖在玉米10条染色体的SSR标记对许178和SSSL1272两个亲本的全基因组进行筛选多态性标记。从BC1F1分离群体中挑选出10株表型显著穗粗和10株表型显著穗细的单株，分别DNA等量混合构建显性池和隐性池，筛选到3对差异标记分布在第5号染色体上，结果参见图2。图中从左往右分别为SSSL1272、许178、显性池、隐性池。利用自交系B73、W22序列又开发了250对SSR和Indel标记，利用BSA混池的方法，又筛选到6对差异标记，分子标记引物信息参见表1。
表1分子标记引物信息
通过2019年12月和2020年6月在海南和原阳进行BC1F1后代鉴定，每个交换单株后代随机自交一行，收获后考种，以鉴定BC1F1表型，挑选出有表型单株70株，最终将目标基因定位在第5染色体上的umc1815和5.04-InDel-19两个标记之间，并将目标区段锁定在1.08M范围内，结果参见图3。图3中白色代表来自许178的片段，黑色代表许178和SSSLqED5杂合片段。右侧柱状图代表重组单株自交子代穗粗平均数，显著性差异P为与许178进行t测验获得。黑色虚线代表内侧的差异标记。
(3)玉米穗粗主效QTL qED5精细定位：
3.1分子标记开发：为了进一步缩小定位范围，实现穗粗主效QTL的精细定位，根据玉米自交系B73和许178序列间的差异，在初定位1.08M的区间内，进一步开发Indel和SSR标记，并用许178和SSSLqED5筛选差异标记，找到6个差异标记，具体序列参见表2。
表2分子标记引物信息
3.2定位群体的构建：在BC1F1群体中选择目标区段为杂合的单株自交构建BC1F2群体。
3.3穗粗表型鉴定：2021年利用umc1815和5.04-InDel-19两个连锁标记筛选BC1F220000籽粒群体。对筛选到的重组单株2021年原阳晚夏播种植，并取样品提取DNA，利用标记umc1815和5.04-InDel-19筛选在该区段内的重组单株，将这些纯合重组单株用新开发的分子标记去鉴定，发现产生11种新的交换类型，收获后于2022年原阳、海南种植鉴定表型。
3.4PCR程序和扩增产物基因型分析：PCR扩增体系(10μL)组分包含：2μL DNA，1μL引物(左右引物各0.5μL)，5μL2×Taq Master Mix(诺维赞)和2μL ddH2O。利用TouchdownPCR扩增程序：95℃3min；95℃30s，65℃30s(每个循环降落1℃)，72℃30s，共9个循环；95℃30s，58℃30s，72℃30s，共29个循环；72℃5min。PCR扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖胶电泳进行基因型分析。
3.5玉米穗粗主效QTL精细定位
利用玉米考种仪对收获的材料进行穗部性状鉴定，对考种的数据进行分析后，利用连锁差异标记和田间性状鉴定结果相结合，将目标基因定位在chr5-30和MC-10两个连锁差异标记之间，两者之间物理距离为673kb，结果参见图4。白色框代表来自许178基因组片段，黑框代表SSSL1272基因组片段。显著性差异P为与许178进行t测验获得。
实施例2
实施例1得出的与玉米穗粗主效QTL紧密连锁的分子标记可以在玉米穗粗遗传改良中的应用，在玉米穗粗分子标记辅助育种过程中鉴定玉米穗粗性状的方法包括以下步骤：
提取玉米叶片基因组DNA；
以玉米叶片基因组DNA为模板，利用引物chr5-30-L/chr5-30-R、M3-L/M3-R分别进行PCR扩增；
琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增结果：当采用的引物为chr5-30-L/chr5-30-R时，当检测出所述分子标记chr5-30为上带，则表示待检样品的穗粗较粗；当检测出所述分子标记chr5-30为下带，则表示待检样品的穗粗较细；当采用的引物为M3-L和M3-R时，当检测出所述分子标记M3为上带，则表示待检样品的穗粗较粗；当检测出所述分子标记M3为下带，则表示待检样品的穗粗较细。
其中，所述PCR扩增体系10μL，组分包含：2μLDNA，左右引物各0.5μL，5μL2×TaqMaster Mix和2μLdd H2O。利用Touchdown PCR扩增程序：95℃3min；95℃30s，65℃30s，每个循环降落1℃，72℃30s，共9个循环；95℃30s，58℃30s，72℃30s，共29个循环；72℃5min。
需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (7)
1.与玉米穗粗主效QTL紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记位于玉米第5号染色体上，为分子标记chr5-30和分子标记M3。
2.根据权利要求1所述的与玉米穗粗主效QTL紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记chr5-30具体位置chr5：84399694-84400040，所述分子标记M3具体位置chr5：85072289-85072443。
3.根据权利要求1所述的与玉米穗粗主效QTL紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记的引物为：
扩增所述分子标记chr5-30的引物序列为：
chr5-30-L：5’-AAACAAATCTATGCGCCCAC-3’；
chr5-30-R：5’-AATGGACCGGTTCTCCTAGC-3’。
扩增所述分子标记M3：
M3-L：5’-TTCCTACCTGCGGTACTTGC-3’；
M3-R：5’-GGTGGTGCCTGCTACAGAGT-3’。
4.与玉米穗粗主效QTL紧密连锁的分子标记的应用，其特征在于，所述分子标记用于玉米穗粗遗传改良中。
5.根据权利要求4所述的与玉米穗粗主效QTL紧密连锁的分子标记的应用，其特征在于，在玉米穗粗遗传改良中鉴定玉米穗粗性状的方法包括以下步骤：
提取玉米叶片基因组DNA；
以玉米叶片基因组DNA为模板，利用权利要求2所述引物chr5-30-L/ chr5-30-R、M3-L/M3-R分别进行PCR扩增；
琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增结果：当采用的引物为chr5-30-L/ chr5-30-R时，当检测出所述分子标记chr5-30为上带，则表示待检样品的穗粗较粗；当检测出所述分子标记chr5-30为下带，则表示待检样品的穗粗较细；当采用的引物为M3-L和M3-R时，当检测出所述分子标记M3为上带，则表示待检样品的穗粗较粗；当检测出所述分子标记M3为下带，则表示待检样品的穗粗较细。
6.根据权利要求5所述的与玉米穗粗主效QTL紧密连锁的分子标记的应用，其特征在于，所述PCR扩增体系10 μL，组分包含：2 μL DNA，左右引物各0.5 μL，5 μL 2×Taq MasterMix和2 μL dd H2O。
7.根据权利要求5所述的与玉米穗粗主效QTL紧密连锁的分子标记的应用，其特征在于，利用Touchdown PCR扩增程序：95℃ 3min；95℃ 30s，65℃ 30s，每个循环降落1℃，72℃30s，共9个循环；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，共29个循环；72℃ 5 min。
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