CN117248061B - 与大豆籽粒油分含量相关的InDel位点、分子标记、引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子标记技术领域，具体涉及与大豆籽粒油分含量相关的InDel位点、分子标记、引物及其应用。所述位点位于大豆17号染色体8462234bp的位置处，多态性为T或TC。本发明还公开了InDel位点的分子标记、分子标记的扩增引物、包含扩增引物的试剂盒及其在鉴定大豆油分含量中的应用。本发明还公开了一种鉴定大豆油分含量高低的方法，使用本发明所述方法对大豆籽粒油分含量进行鉴定，其精确度最高可达79.22％。本发明发掘与大豆籽粒油分含量相关的InDel标记可应用于大豆油分含量改良的分子标记辅助选择、油分含量相关基因的精细定位和图位克隆中的应用，从而加速大豆优异性状的改良进程。

Description

与大豆籽粒油分含量相关的InDel位点、分子标记、引物及其 应用

技术领域

本发明属于分子标记技术领域，具体涉及与大豆籽粒油分含量相关的InDel位点、分子标记、引物及其应用。

背景技术

大豆是世界上最常见的豆科植物，不仅属于粮食作物，更是重要的经济作物。因其籽粒富含优质油分含量，对人类消费和工业应用具有很大贡献。从遗传角度来看，大豆油分含量性状是由多基因控制的复杂数量性状，使用常规育种手段提高大豆油分含量效率较低。随着分子生物学技术的飞速发展，基因精细调控技术能够实现优异等位基因的聚合和高效利用，是选育突破性大品种的关键技术之一，也是未来提升大豆品种育种能力的必要手段。优异等位基因积累及其对应的分子标记的开发，是实现基因的精细调控与聚合的先决条件。

目前，我国是世界上大豆进口最多的国家，而且需求量还在与日俱增，选育高油大豆新品种已成为育种者和生产者的关键问题。因此，发掘大豆油分含量优异等位基因的分子标记，不但能够为高油大豆的优异等位基因的聚合提供技术储备，也可为基因精细调控技术改良大豆品质提供明确指导。

近年，伴随测序技术的发展，研究者对大豆基因组有了较全面的认识。全基因组关联分析(Genome-Wide Association Studies，GWAS)是当前研究生物基因组的先进方法，通过对大规模的群体DNA样本进行全基因组高密度遗传标记(如SNP或CNV等)分型，从而寻找与生物表型相关的基因型的研究方法。Leamy等人通过全基因组测序技术在570份野生大豆中检测到近30000个单核苷酸多态性(SNP)，并对这些野生大豆种子测定了蛋白质含量、籽粒油脂含量和5种脂肪酸水平，结果表明有29个SNP与野生大豆种子的7种组成性状显著相关。目前，关联分析已广泛应用于植物研究，如大豆籽粒蛋白质含量，水稻氨基酸组分，黑小麦铝毒抗性等。近年利用GWAS开发目标性状功能标记，已成为分子生物学研究的热点之一。分子标记辅助选择可显著加快大豆高油品种遗传改良进程。

目前国内外已有影响大豆籽粒油分含量相关位点的报道，当前功能位点涉及到的分子标记多数来源于重组自交系或单一父母本构建群体，可以在不同环境或不同遗传背景中被重复检测到的QTL较少。这些标记应用到杂交品种和地方品种等自然群体时，往往不能够作为分子标记辅助育种使用，也无法解释位点的遗传贡献率。插入/缺失(insertion-deletion,In Del)标记是一种以PCR扩增技术为基础的碱基序列长度多态性标记，InDel标记作为最近几年新兴的分子标记，广泛应用于遗传多样性分析、纯度鉴定及辅助育种等领域。但将其用于全基因组关联分析的报道还较少。

因此，选择更加快速、遗传稳定性高、重复结果好的分子标记手段是必要的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中现有与大豆籽粒油分含量相关的位点不能在不同环境或不同遗传背景中被重复检测的缺陷，提供与大豆籽粒油分含量相关的InDel位点、分子标记、引物及其应用方法。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案进行。

本发明的第一方面提供一种与大豆籽粒油分含量相关的InDel位点，所述InDel位点位于大豆17号染色体8462234bp的位置处，多态性为T或TC。

本发明的第二方面提供含有所述InDel位点的分子标记。

本发明的第三方面提供所述的分子标记的扩增引物。

本发明的一些实施方式中，所述扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示。

本发明的第四方面提供包含所述扩增引物的试剂盒。

本发明的第五方面提供所述InDel位点、所述分子标记、所述扩增引物或所述试剂盒在鉴定大豆油分含量中的应用。

本发明的一些实施方式中，所述InDel位点多态性为T的大豆相比于多态性为TC的大豆品种油分含量高。

本发明的第六方面提供所述InDel位点、所述分子标记、所述扩增引物或所述试剂盒在培育高油分含量大豆中的应用。

本发明的第七方面提供一种鉴定大豆油分含量高低的方法，所述方法包括以下步骤：

S1，利用CTAB法提取待鉴定大豆基因组DNA；

S2，以所述大豆基因组DNA为模版，利用所述的扩增引物进行PCR扩增，得到扩增产物；

S3，将所述扩增产物进行测序分析，根据所述测序分析的结果判断种子油分含量高低。

本发明的一些实施方式中，S3中，所述判断的标准为：当所述扩增产物自5′端第169位的碱基为T时，判断为高油分含量大豆品种；当所述扩增产物自5′端第169位的碱基为TC时，判断为低油分含量大豆品种。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明所述的InDel分子标记能够广泛应用于不同栽培大豆群体中筛选油分含量，并进一步应用到大豆品质遗传改良中。本发明的17号染色体的8462±50kb的区间都是调控大豆油分含量的理想标记区间，其中8462234bp位InDel的油分含量遗传贡献率为16.33-21.92％，加性效应为0.68-0.90％。2020和2022年在该位点有79.22％和61.57％为T的品系油分含量高于为TC品系的20.63％和20.61％，精确度最高可达79.22％，大大减少了选择成本，提高了品质改良的效率。本发明通过全基因组重测序技术，筛选到与目标性状显著连锁的InDel标记，可用于分子标记辅助选择育种，显著提高大豆的优异等位基因聚合进程，及基因精细调控大豆种子油分含量的品质改良。

附图说明

图1为334份关联群体2020年和2022年中油分含量(Oil)；其中，图1A为E1(2020年)334份关联群体中油分含量；图1B为E2(2022年)334份关联群体中油分含量。

图2为基于InDel，通过admixture软件，得到的关联群体的群体结构图。

图3为334份自然群体E1(2020年)和E2(2022年)中大豆油分含量的MLM关联分析结果曼哈顿图；其中，图3A为E1(2020年)中大豆油分含量的MLM关联分析结果曼哈顿图；3B为E1(2022年)中大豆油分含量的MLM关联分析结果曼哈顿图。

图4为334份自然群体两年中大豆油分含量的分子标记对应的大豆油分含量差异Box图；其中，图4A为E1(2020年)334份自然群体中大豆油分含量的分子标记对应的大豆油分含量差异Box图；图4B为E2(2022年)334份自然群体中大豆油分含量的分子标记对应的大豆油分含量差异Box图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本研究中收集测定我国40°N以北的大豆种质资源3000份，均由吉林省农业科学院大豆研究所栽培大豆种质资源研究团队组收集、评价，并保存于吉林省农业科学院种质资源库。

实施例1大豆种子油分含量关联群体的构建及性状测定

本实施例中使用大豆种质资源库内3000份种质资源，其来源地涵盖我国高纬度大豆主产区的大部分，包括黑龙江省、吉林省、辽宁省、内蒙古自治区、新疆维吾尔自治区等。田间种植3000份资源，待种子完全成熟后，收获种子，每个品种随机选取20粒有代表性的种子进行测量。3000份资源的油分含量在群体内符合正态分布，遗传多样指数为1.95。从中抽取334份资源，油分含量遗传多样指数仍为1.95，将334资源作为关联群体。其操作步骤如下：

(1)采集群体334份大豆种质的完全成熟种子，将种子收获晒干后(含水量<15％)，选取200-300粒形态饱满，籽粒完整，无病虫害和霉变的种子样品，使用InfratecTM-1241谷物分析仪(丹麦福斯分析仪器)测定每个品种的油分含量，每个品种重复3次，取平均值作为该品种油分的表型值。

根据群体油分含量平均值(X)和标准差(δ)分为10类群，1类<X-2δ，10类≥X+2δ，中间每类相差0.5δ。各性状的遗传多样性采用Shannon's信息指数(H')进行评价，H'＝-ΣPilnPi，Pi表示第i种变异出现的频率，通过计算3000份资源油分含量的遗传多样性为1.95。

在每个类群随机抽取33-34份资源，共抽取334份资源，计算遗传多样指数H'，当等于1.95时，即确定这334资源为关联群体，该群体的油分含量呈正态分布(如图1A和图1B所示)。

实施例2大豆油分含量全基因组关联分析

(1)用CTAB法提取关联群体的334份资源单株叶片DNA，用Thermo nanodrop 2000检测DNA浓度并用1％琼脂糖电泳检测DNA纯度及完整性。

(2)利用安诺优达基因有限公司的全基因组重测序技术对334份资源进行群基因组测序，具体操作如下：

酶切方案：利用酶切预测软件对已公布大豆参考基因组进行酶切预测，选择内切酶RsaI和HaeIII对检测合格的各样品基因组进行酶切，选择基因组片段范围在364-414bp的SLAF片段。

测序流程：对得到的SLAF片段用Klenow Fragment(3′→5′exo–)(NEB)和dATP在37℃下进行3′端加A处理、连接Dual-index测序接头、PCR扩增(PCR扩增上游引物如表1中SEQID NO.1所示，下游引物如表1中SEQ ID NO.2所示)、纯化(Agencourt AMPure XP beads(Beckman Coulter,High Wycombe,UK))、混样、切胶选取目的片段，文库质检合格后用IlluminaHiSeqTM进行测序。为评估建库实验的准确性，选用大豆(‘Williams 82’:G.maxWm82.a2.v1)作为对照(Control)进行相同的处理参与建库和测序。

根据测序Reads在参考基因组上的定位结果，GATK进行局部重比对(LocalRealignment)、GATK变异检测，samtools变异检测，取GATK和samtools两种方法得到的交集变异位点等步骤，以保证检测得到的InDel的准确性。以两种方法得到的InDel标记交集作为最终可靠的InDel标记数据集，共得到3,306,713个群体InDel。

表1PCR扩增引物

引物名称	序列	编号
			上游引物	5′-AATGATACGGCGACCACCGA-3′	SEQ ID NO:1
下游引物	5′-CAAGCAGAAGACGGCATACG-3′	SEQ ID NO:2

(3)系统发育树用来表示物种之间的进化关系，根据各类生物间的亲缘关系的远近，把各类生物安置在有分枝的树状的图表上，简明地表示生物的进化历程和亲缘关系。基于InDel，通过MEGA5软件，neighbor-joining算法，构建样品的群体进化树。

(4)群体遗传结构分析能够提供个体的血统来源及其组成信息，是一种重要的遗传关系分析工具。基于InDel，通过admixture软件，分析样品的群体结构，分别假设样品的分群数(K值)为1-19，进行聚类。如图2所示，并对聚类结果进行交叉验证，根据交叉验证错误率的谷值确定最优分群数为13。

(5)基于InDel，通过TASSEL5软件，进行主成分分析(Principal componentsanalysis，PCA)，得到样品的主成分聚类情况。通过PCA分析，能够得知哪些样品相对比较接近，哪些样品相对比较疏远，可以辅助进化分析。

(6)使用plink软件可以对自然群体两两个体间的亲缘关系(relative kinship)进行估计。亲缘关系本身是定义两特定材料之间的遗传相似度与任意材料之间的遗传相似度的相对值，因此当结果出现两材料之间的亲缘关系值小于0时，则直接定义为0。

(7)基于关联群体InDel分子标记数据、遗传结构数据、Kinship矩阵数据以及油分含量数据，利用GAPIT数据包的混合线性模型((Mixed linear model，MLM)进行全基因组关联分析(Genome wide association study，GWAS)。X为基因型，Y为表型，最终每个InDel位点都能得到一个关联结果。如图3A和图3B所示，一个点代表一个InDel位点；红色虚线为1/InDel数目的负对数，高于红线的点，表明对应的InDel标记与油分含量显著相关，其中17号染色体红线上对应的点是8462234bp位InDel，以-log₁₀(p)≥5.40为筛选标准，在17号染色体的8462234bp位得到与油分含量显著关联的InDel标记(T/TC)，详细信息如表2所示。

表2大豆籽粒油分含量(Oil)显著关联InDel信息

实施例3大豆油分含量显著关联InDel标记的应用

与大豆油分含量紧密连锁的InDel标记为17号染色体的8462234bp位(T/TC)，命名为qOil17-1，其是以待鉴定材料的基因组DNA作为模板，以qOil17-1引物(引物序列如表3中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示)进行PCR扩增所得的片段；扩增所得片段的核苷酸序列如表4中SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。

其中，扩增引物如表3所示：

表3qOil17-1扩增引物

引物名称	序列	编号
			qOil17-1-F	5′-GCAACAAAACTTTGGAAGAGC-3′	SEQ ID NO.3
qOil17-1-R	5′-ACAATTGCAACGACACTCCT-3′	SEQ ID NO.4

表4扩增所得片段核苷酸序列

利用上述InDel分子标记辅助判断品种后代油分含量的具体步骤如下：

(1)利用CTAB法提取待鉴定材料基因组DNA

1)取大豆新鲜叶片加入液氮研磨成粉状，取适量放入1.5mL离心管中。

2)加入0.6mL预热的CTAB提取液，颠倒混匀几次，在65℃的温度下水浴一小时，每15min混匀一次，12000rpm离心15min。

3)加入0.6mL 24：1(V/V)的氯仿：异戊醇溶液，颠倒混匀5-10次，10000rpm离心15min。

4)取上清溶液转移到另外一个空的离心管中，用24:1(V/V)的氯仿：异戊醇溶液重新抽提一次，然后加50μL RNase(10mg/mL)室温下放置30min。

5)加等体积-20℃预冷的异丙醇，于-20℃冰箱中30min，5000rpm离心10min去上清。

6)用70％乙醇清洗两次。吹干后用灭菌水溶解，得到基因组模板DNA，将基因组模板DNA放入4℃冰箱保存备用。

7)用0.8％的琼脂糖检测DNA的浓度，稀释到工作浓度用于PCR扩增。

2.利用InDel标记引物进行PCR扩增，得到扩增产物。

1)PCR扩增体系：总体积为20μL，包括10-50ng基因组模板DNA 3μL，10μL QuickTaq HSDyeMix，10pmol的引物各2μL和ddH2O 3μL。

2)PCR扩增条件：94℃预变性30s，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min；循环30次；72℃终延伸10min。

3.根据序列比对结果判断种子油分含量

将扩增产物进行测序分析，扩增产物自5′端第169位为T的品系亚群油分含量均值显著高于该位点为TC的品系亚群均值。如图4A和图4B所示，2020和2022年在该位点有79.22％和61.57％为T的品系油分含量高于为TC品系的20.63％和20.61％，精确度最高可达79.22％。这表明该标记用于辅助选择是切实有效的。

实施例4大豆油分含量显著关联InDel标记在育种中的应用

目前利用该标记已开展对于新品种的选育工作。例如，通过该标记及其它油分含量标记位点，选育出一批聚合多个高油及高产位点且自身油分含量高的种质资源，例如‘东农44’、‘黑河35’、‘公野04L-141’等，可直接用于新品种的选育。此外，在引进不同地区优异种质资源时，例如‘东大2号’等，通过结合该分子标记及其它油分蛋白分子标记，能够对该资源今后用于本地新品种选育提供指导方向。同时，我们也利用分子标记对老品种开展提纯复状工作，例如‘黑河35’，在长期种植过程中品种油份含量出现下滑，但从表型很难判断出是否出现混杂。因此，我们借助该标记及其他大豆油分含量分子标记联合鉴定，重新提纯该品种，使该品种油份含量能够恢复原有性状。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (5)

1.一种与大豆籽粒油分含量相关的InDel分子标记，其特征在于，所述分子标记的序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；其中，序列如SEQ ID NO:5所示的分子标记对应高油分含量大豆，序列如SEQ ID NO:6所示的分子标记对应低油分含量大豆。

2.如权利要求1所述的分子标记在鉴定大豆油分含量中的应用。

3.如权利要求1所述的分子标记在培育高油分含量大豆中的应用。

4.如权利要求2或3任一项所述的应用，其特征在于，所述分子标记由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物扩增。

5.一种鉴定大豆油分含量高低的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S1，利用CTAB法提取待鉴定大豆基因组DNA；

S2，以所述大豆基因组DNA为模版，利用权利要求4中所述的引物进行PCR扩增，得到扩增产物；

S3，将所述扩增产物进行测序分析，根据所述测序分析的结果判断种子油分含量高低；

S3中，所述判断的标准为：当所述扩增产物的序列如SEQ ID NO:5所示时，判断为高油分含量大豆品种；当所述扩增产物的序列如SEQ ID NO:6所示时，判断为低油分含量大豆品种。