CN103045588A

CN103045588A - 大豆籽粒蛋白质含量主效qtl 的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN103045588A
Application number: CN2012105316285A
Authority: CN
Inventors: 盖钧镒; 张英虎; 赵团结
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2012-12-11
Filing date: 2012-12-11
Publication date: 2013-04-17
Anticipated expiration: 2032-12-11
Also published as: CN103045588B

Abstract

本发明公开了大豆籽粒蛋白质含量主效QTL的分子标记及其应用。本发明大豆籽粒蛋白质含量主效QTL，所述主效QTL位点位于大豆第8号染色体Gm08:13000kb-17000kb。该分子标记的上游引物序列为SEQ ID NO.1，下游引物序列为SEQ ID NO.2。在新配置的杂交组合中，以待测F₂单株大豆籽粒的基因组DNA为模板，Z56引物对进行PCR扩增，检测扩增产物，扩增产物中具有一个大小为180bp-190bp的特异DNA片段的待测大豆为候选的具有高籽粒蛋白质含量材料。利用本发明的分子标记可以简便快捷的筛选大豆籽粒高蛋白质材料，可以加快大豆籽粒高蛋白质含量育种。

Description

大豆籽粒蛋白质含量主效QTL 的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于遗传育种领域，涉及大豆籽粒蛋白质含量主效QTL的分子标记及其应用。

背景技术

大豆籽粒蛋白质是当今世界上最重要的植物蛋白来源，其含量为40%左右。培育高籽粒蛋白质含量的大豆材料，是大豆品质育种的重要目标之一。

传统的大豆籽粒蛋白质含量育种是通过表型进行选择。大豆籽粒蛋白质含量表型的测定可以通过化学法测定和光谱法进行测定。基于化学法测定大豆籽粒蛋白质含量，需要对大豆种子进行破坏，同时需要大量时间和劳力。基于光谱法测定能快速准确对大豆种子蛋白质含量进行测定，但光谱法测定需要先建立大豆籽粒蛋白质含量模型，同时光谱仪器较贵，一般实验室一般无实力购买。

大豆籽粒蛋白质含量是典型的数量性状，由多基因控制、易受环境影响，表型选择具有很大的盲目性。随着分子生物学和基于组学的迅速发展，以及数量性状作图方法的不断完善，使得数量性状基因座（Quantitative trait loci,QTL）定位变成了现实。利用分子标记定位数量性状QTL，其实质就是分析分子标记与目标性状QTL之间的连锁关系。基于获得的标记基因型分离与数量性状的量之间的关系，可直接把握数量性状基因，并开发可应用于分子标记辅助选择（Molecular-assisted selection,MAS）育种的技术。

利用MAS进行育种，核心是找到与性状紧密连锁的分子标记。在双亲本构建的群体，进行QTL定位，结果一般只限定在两亲本的范围内，同时由于重组代数较少，定位的结果在很大的区间内，利用自然材料的关联分析，可以分析整个自然材料的变异，同时基于自然材料历史的重组事件，定位的精度较高，能够找到与性状紧密连锁的标记。

目前虽然定位了大量大豆籽粒蛋白质含量主效QTL，但发现新的主效QTL及与主效QTL紧密连锁的标记任是大豆遗传学家和育种家们的一个长期目标和挑战。

发明内容

本发明的目的是提供一个大豆籽粒蛋白质含量主效QTL及其分子标记。

本发明的另一目的是提供该大豆籽粒蛋白质含量主效QTL的分子标记在大豆品质育种中的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一个大豆籽粒蛋白质含量主效QTL，所述主效QTL位点位于大豆第8号染色体Gm08:13000kb-17000kb，所述的紧密连锁标记Z56位于大豆第8号染色体Gm08:14193kb。所述的主效QTL位点在‘NJRSXG’重组自交系中解释10.7%的大豆籽粒蛋白特征，在地方材料中解释4.6%的大豆籽粒蛋白特征，在WT133和XG30的杂交组合中F2:3解释了24.0%的遗传特征，在F2:4解释了20.0%的遗传特征。

本发明所述的大豆籽粒蛋白质含量主效QTL的分子标记Z56，该分子标记的上游引物序列为SEQ ID NO.1，下游引物序列为SEQ ID NO.2。

本发明所述的大豆籽粒蛋白质含量主效QTL的分子标记Z56在大豆育种中的应用。

本发明所述的大豆籽粒蛋白质含量主效QTL的分子标记Z56在大豆育种中的应用，优选用所述的Z56引物对扩增大豆基因组DNA，扩增产物在8%聚丙烯酰胺凝胶电泳后，如果获得180~190bp的扩增片段，则表明存在本发明所述的大豆籽粒蛋白质含量增效QTL位点，预测该大豆具有较高的籽粒蛋白质含量，如果获得150~160bp的扩增片段，则表明存在本发明所述的大豆籽粒蛋白质含量减效QTL位点，预测该大豆具有较低的籽粒蛋白质含量。

本发明所述的大豆籽粒蛋白质含量主效QTL的分子标记Z56在检测所述的大豆籽粒蛋白质含量主效QTL中的应用。

本发明所述的大豆籽粒蛋白质含量主效QTL的分子标记Z56的引物对，该分子标记的上游引物序列为SEQ ID NO.1，下游引物序列为SEQ ID NO.2。

本发明所述的大豆籽粒蛋白质含量主效QTL的分子标记Z56的引物对在检测本发明所述的大豆籽粒蛋白质含量主效QTL中的应用。

一种检测大豆籽粒蛋白质含量主效QTL的方法，利用本发明所述的引物对扩增大豆基因组DNA，扩增产物在8%聚丙烯酰胺凝胶电泳后，如果获得185bp的扩增片段，则表明存在本发明所述的大豆籽粒蛋白质含量主效QTL。

本发明所述的大豆籽粒蛋白质含量主效QTL的分子标记Z56的引物对在大豆育种中的应用。

本发明所述的大豆籽粒蛋白质含量主效QTL的分子标记Z56的引物对在大豆育种中的应用，优选用用所述的Z56引物对扩增大豆基因组DNA，扩增产物在8%聚丙烯酰胺凝胶电泳后，如果获得180~190bp的扩增片段，则表明存在本发明所述的大豆籽粒蛋白质含量增效QTL位点，预测该大豆具有较高的籽粒蛋白质含量，如果获得150~160bp的扩增片段，则表明存在本发明所述的大豆籽粒蛋白质含量减效QTL位点，预测该大豆具有较低的籽粒蛋白质含量。

本发明大豆籽粒蛋白质含量主效QTL连锁的分子标记是通过下列步骤筛选的：

（1）利用先进2号和赶泰2-2杂交，得到杂种F₁，通过‘单粒传’法构建群体，获得147个F2:7代重组自交系（‘NJRSXG’）。

（2）利用SSR分子标记分析两个亲本，统计分析亲本间具有多态性的位点，在重组自交系鉴定亲本间具有多态性标记的遗传类型，然后对其进行连锁分析，构建‘NJRSXG’的遗传连锁图谱。

（3）对先进2号和赶泰2-2及其衍生的‘NJRSXG’群体的大豆籽粒蛋白质含量进行测定，利用混合线性模型（QTLNetwork 2.0）进行定位，在第8号染色体15300kb附近检测到大豆籽粒蛋白质含量的主效QTL。

（4）利用大豆第8号染色体13000kb-17000kb的indel信息，设计新的分子标记。

（5）利用国家大豆改良中心保存的366份大豆地方材料，测定大豆籽粒蛋白质含量表型，同时鉴定新设计分子标记的遗传带型。

（6）利用地方材料表型数据和分子标记数据，发现最紧密连锁标记Z56。在4环境下都能检测到，4环境联合的解释率为4.6%。

（7）利用WT133和XG30（国家大豆改良中心保存）配制新的杂交组合，提取F₂（WXF₂）代单株DNA，分析Z56在F2单株的遗传带型。

（8）将WT133和XG30组合的F2:3和F2:4种成株行，测定株行籽粒蛋白质含量，利用Z56和籽粒蛋白质含量表型进行分析，发现Z56遗传带型在F_2:3解释了24.0%的遗传特征，在F_2:4解释了20.0%的遗传特征。

有益效果：

本发明在国际上首次鉴定了一个位于大豆Gm08号染色体Gm08:13000kb-17000kb区域控制大豆籽粒蛋白质含量主效QTL，同时发现一个紧密连锁标记Z56。Z56分子标记在地方材料和杂交后代中的表现使其在大豆籽粒蛋白质含量的育种中具有重要的价值。

1、首次鉴定了位于大豆Gm08号染色体Gm08:13000kb-17000kb附近的一个控制大豆籽粒蛋白质含量分子标记。

2、紧密连锁分子标记Z56。在地方材料4个环境中，大豆籽粒蛋白质含量与分子标记Z56引物对相关性都显著，在配制组合中，F₂单株基因型能有效预测的F_2:3和F_2:4代籽粒蛋白质含量表型，在育种实践中有很好的应用前景。

3、本发明提出了利用大豆种质资源中籽粒蛋白质含量QTL的方法。

附图说明

图1：地方材料Z56引物对扩增产物。

其中1-46为地方材料，M：50bp DNA Marker，箭头所指为185bp特异扩增条带。

图2：WXF₂群体Z56引物对扩增产物。

其中1为WT133材料带型，2位XG30材料带型，3-48位WXF₂群体F₂材料扩增带型，M：50bp DNA Marker，箭头所指为185bp特异扩增条带。

具体实施方式

实施例1.大豆籽粒蛋白质含量主效QTL的获得

(1)、‘NJRSXG’群体构建

利用我国两个大豆材料先进2号和赶泰2-2进行杂交，得到杂种F₁，通过“单籽传”法构建群体，获得147个F_2:7代重组自交系（‘NJRSXG’）。

“单籽传”法步骤如下：在父母本杂交当代从母本植株上收获的一粒种子种植后长成一个F1代单株，其自交（即自花授粉）结实收获1株F₂代种子，后者种植长成一个包含分离性状的F2代株行，它的每一单株自交结实收获F₃代种子，将分离的同类性状植株单株收获并脱粒装袋，每株种子次年单独种植一个F₃株行，自交结实收获F₄代种子，……，直至各家系内不同植株之间的性状完全稳定一致。像这样最初由单粒种子经过连续多代自交、分离、纯化、种植、选育及鉴定等程序，最终发展成一个有数百个重组自交系构成的大群体，即为“单籽传” 法构建群体。

（2）、‘NJRSXG’群体遗传图谱的构建

利用SSR分子标记方法分析两个亲本及147个重组自交系材料，统计分析在亲本间具有多态性的位点在后代群体中的遗传类型。利用Jionmap3.0作图软件，构建了一张包含400个SSR标记的‘NJRSXG’群体的遗传连锁图谱。

采用CTAB法提取‘NJRSXG’大豆叶片的基因组DNA，所用引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。PCR反应体系（10ul）,其中含有3ulDNA模板（15ng）、上下游引物（0.2mmol/L）各1.5ul、1.2ulMgCl2(2.5mmol/L)、0.24ul dNTP（10mmol/L，N=A,C,G,T），0.12ul Taq酶（5U/ul）和1.4ul ddH2O。PCR反应程序：95℃变性5min；随后进行33个循环的94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s；再经72℃延伸10min；最后4℃保存。PCR扩增产物用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色。胶片在BIO-RAD visadoc3.0（Bio-RAD,USA）成像系统中扫描分析。

（3）‘NJRSXG’群体大豆籽粒蛋白质含量表型测定

利用1095Knifetec样品磨（FOSS Tecator,瑞士）将‘NJRSXG’群体干燥大豆种子磨粉。利用VECTOR 22/N傅立叶红外光谱仪测定大豆种子粉光谱，利用建立的大豆蛋白质含量模型预测大豆种子蛋白质含量。

（4）结果与分析：

利用QTLNetwork 2.0结合‘NJRSXG’群体表型数据和分子数据，进行大豆籽粒蛋白质含量的QTL定位，在第8号染色体15300kb附近（Satt089）发现大豆籽粒蛋白质含量的主效QTL，5环境联合有10.7%的表型解释率。

实施例2.大豆籽粒蛋白质含量主效QTL紧密标记Z56的获得

（1）分子标记开发

利用公布的大豆物理图谱信息及国家大豆改良中心测序材料的序列信息，在第8号染色体Gm08:13000kb-17000kb区域设计多个分子标记。

（2）地方材料表型测定

用于分析的大豆地方材料包含全国6个生态区的366份材料，利用1095Knifetec样品磨（FOSS Tecator,瑞士）将干燥大豆种子磨粉。利用VECTOR 22/N傅立叶红外光谱仪测定大豆种子粉光谱，利用建立的大豆蛋白质含量模型预测大豆种子蛋白质含量。

（3）地方材料分子标记鉴定

采用CTAB法提取大豆地方材料叶片的基因组DNA，PCR反应体系（10ul）,其中含有3ulDNA模板（15ng）、上、下游引物（0.2mmol/L）各1.5ul、1.2ulMgCl2(2.5mmol/L)、0.24ul dNTP（10mmol/L，N=A,C,G,T），0.12ul Taq酶（5U/ul）和1.4ul ddH2O。PCR反应程序：95℃变性5min；随后进行33个循环的94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s；再经72℃延伸10min；最后4℃保存。PCR扩增产物用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色。胶片在BIO-RADvisadoc3.0（Bio-RAD,USA）成像系统中扫描分析。

(4)、结果与分析

在设计的多个分子标记中，Z56具有最小的P值和最大的表型解释率，认为是与籽粒蛋白质含量主效QTL紧密连锁的标记。在366份地方材料中Z56只有两种等位变异，条带大小分别为155bp和185bp，拥有185bp带型的材料具有很大高籽粒蛋白质含量的可能。在4环境联合分析中Z56的表型解释率为4.6%（表1）。Z56分子标记上游引物序列为SEQ ID NO.1，下游引物序列为SEQ ID NO.2。

表1Z56分子标记在366份地方材料中多个环境下的表现

实施例3.Z56分子标记在大豆籽粒蛋白质含量选择上的应用

(1)、双亲本基因组扩增检测

用于验证大豆籽粒蛋白质含量QTL亲本分别为亲本WT133(Z56等位条带为155bp，大豆种子蛋白质含量49.9%)，亲本XG30（Z56等位条带为185bp，大豆种子蛋白质含量46.9%）,XG30虽然种子蛋白质含量比WT133小，但在Z56位点含有增效位点。

(2)、群体扩增检测及标记分析

用以上两个亲本进行杂交，得到F₁代种子种植后长成一个F₁代单株，其自交结实收获1株F2代种子，后者种植长成一个包含分离性状的F₂代株行，对F₂单株收获种子F_2：3种成株行，设两个重复，测定表型，取平均值分析。F_2：3收获的种子F_2：4再种成株行，设两个重复，测定表型，取平均值分析。

采用CTAB法分别提取每份F₂单株叶片的基因组DNA。PCR反应体系（10ul）,其中含有3ulDNA模板（15ng）、上、下游引物（0.2mmol/L）各1.5ul、1.2ulMgCl₂(2.5mmol/L)、0.24ul dNTP（10mmol/L，N=A,C,G,T），0.12ul Taq酶（5U/ul）和1.4ul ddH₂O。PCR反应程序：95℃变性5min；随后进行33个循环的94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s；再经72℃延伸10min；最后4℃保存。

PCR扩增产物用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色。胶片在BIO-RAD visadoc3.0（Bio-RAD,USA）成像系统中扫描分析。分析Z56条带类型亲本WT133(155bp)和XG30（185bp）。

（3）、WT133和XG30杂交后代种子蛋白质含量测定

利用Infratec 1241近红外分析仪测定大豆种子蛋白质含量。

(4)、结果与分析

在WT133和XG30的杂交组合后代中，在F₂代基因型的检测中，共有58个材料的DNA扩增产物出现155bp条带，这58株在F_2:3代籽粒蛋白质含量平均值为47.2，在F_2:4代籽粒蛋白质含量平均值为47.4；共有73个材料的DNA扩增产物出现185bp条带，这73株在F_2:3代籽粒蛋白质含量平均值为49.2，在F_2:4代籽粒蛋白质含量平均值为49.2（表2）。用Z56分子标记预测大豆籽粒蛋白质含量有较好的预测效果。

表2Z56引物对在WT133和XG30杂交后代中与大豆种子蛋白质含量的相关性。

Claims

1.一个大豆籽粒蛋白质含量主效QTL，其特征在于所述主效QTL位点位于大豆第8号染色体Gm08:13000kb-17000kb，所述的紧密连锁标记Z56位于大豆第8号染色体Gm08:14193kb。

2.权利要求1所述的大豆籽粒蛋白质含量主效QTL的分子标记Z56，其特征在于该分子标记的上游引物序列为SEQ ID NO.1，下游引物序列为SEQ ID NO.2。

3.权利要求2所述的大豆籽粒蛋白质含量主效QTL的分子标记Z56在大豆育种中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：用所述的Z56引物对扩增大豆基因组DNA，扩增产物在8%聚丙烯酰胺凝胶电泳后，如果获得180~190bp的扩增片段，则表明存在权利要求1所述的大豆籽粒蛋白质含量增效QTL位点，预测该大豆具有较高的籽粒蛋白质含量，如果获得150~160bp的扩增片段，则表明存在权利要求1所述的大豆籽粒蛋白质含量减效QTL位点，预测该大豆具有较低的籽粒蛋白质含量。

5.权利要求2所述的大豆籽粒蛋白质含量主效QTL的分子标记Z56在检测权利要求1所述的大豆籽粒蛋白质含量主效QTL中的应用。

6.权利要求2所述的大豆籽粒蛋白质含量主效QTL的分子标记Z56的引物对，其特征在于该分子标记的上游引物序列为SEQ ID NO.1，下游引物序列为SEQ ID NO.2。

7.权利要求6所述的大豆籽粒蛋白质含量主效QTL的分子标记Z56的引物对在检测权利要求1所述的大豆籽粒蛋白质含量主效QTL中的应用。

8.一种检测权利要求1所述的大豆籽粒蛋白质含量主效QTL的方法，其特征在于利用权利要求6所述的引物对扩增大豆基因组DNA，扩增产物在8%聚丙烯酰胺凝胶电泳后，如果获得180~190bp的扩增片段，则表明存在权利要求1所述的大豆籽粒蛋白质含量增效QTL，如果获得150~160bp的扩增片段，则表明存在权利要求1所述的大豆籽粒蛋白质含量减效QTL位点。

9.权利要求6所述的大豆籽粒蛋白质含量主效QTL的分子标记Z56的引物对在大豆育种中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：用权利要求6所述的大豆籽粒蛋白质含量主效QTL的分子标记Z56的引物对扩增大豆基因组DNA，扩增产物在8%聚丙烯酰胺凝胶电泳后，如果获得180~190bp的扩增片段，则表明存在权利要求1所述的大豆籽粒蛋白质含量主效QTL位点，预测该大豆具有较高的籽粒蛋白质含量。