CN104004828B - 一种鉴定洋葱细胞质类型的分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种洋葱细胞质雄性不育SCAR标记，其中所述SCAR标记的特异片段长为2175bp，其核苷酸序列如SEQ？ID？No.2所示；共同片段长度为1053bp,其核苷酸序列如SEQ？ID？No.3所示。本发明还公开了所述SCAR标记的引物，包括正向引物和反向引物，如SEQ？ID？No.4、5所示。利用本发明的SCAR分子标记及引物可对洋葱材料的细胞质类型进行快速而又准确的判断，且可避免因为实验操作失误和PCR的无效扩增而导致错误分类情况，可加快洋葱细胞质雄性不育新品系的选育，建立新型的洋葱杂交种亲本选配体系。

Description

一种鉴定洋葱细胞质类型的分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及一种SCAR标记及其应用，尤其涉及一种洋葱细胞质雄性不育SCAR标记及其在鉴定洋葱细胞质基因型中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
洋葱（Alliumcepa.L），又称圆葱、葱头，百合科、葱属，二年生植物，已有5000多年的栽培历史，是世界上主要蔬菜种类之一，素有保健食品的美称，为我国主要的栽培品种和出口品种[HouXL,WuZX.Cultivation,storageandprocessingofonioninChina.In:theinternationalsymposyiumontheutilizationandprocessingofonions,1997,11:107-121]。据初步统计，我国洋葱种植面积达22.6万hm2（1999），居世界第二位，总产量462.9万t，居世界第一位[苏保乐.创汇蔬菜出口指南.北京:中国农业科技出版社,1999:180-195]。2000年仅美国生产的洋葱产值就超过10亿美元，在蔬菜中列第三，其产值以每年5%的速度递增。洋葱不仅可鲜食，还大量用于加工制品，富含多种硫化物和糖类是其独特风味的主要成分，具有降低和预防血栓形成，降血脂、降血压、抗动脉硬化、预防心肌梗塞的作用，深受消费者的喜爱。
我国上世纪八十年代从日本、美国等国家引种杂交品种，其品质、产量及一致性都明显优于常规种[BerningerE.Contributional’etudedelasterilitemaledel’oignon(AlliumcepsL).AnnAmehorPlantes,1965,15:183-199]。自1925年Jones[JonesH,ClarkeA.Inheritanceofmalesterilityintheonionandtheproductionofhybridseed.ProcAmSocHorticSci,1943,43:189-194]首先在“意大利红”（ItalianRed）品种中发现雄性不育株后，国外便开始了洋葱杂种优势利用的研究，在上世纪三十年代至四十年代成功的育成杂交品种，开创了蔬菜品种杂交育种的先例。目前的论文研究主要涉及传统标记、生化标记、分子标记。Havey等[HaveyMJ.Identificationofcytoplasmsusingthepolymerasechainreactiontoaidintheextractionofmaintainerlinesfromopen-pollinatedpopulationsofonionTheorApplGenet,1995,90:263-268]利用PCR胞质鉴定能够快速从开放型传粉洋葱种群中分离出保持系，并利用PCR技术对洋葱cpDNA进行特异扩增，发现100bp的片段可以区分不育系、保持系。之后，利用RFLP分子标记手段找出洋葱雄性可育系和不育系线粒体基因组之间的差异[HaveyMJ.Diversityamongmale-sterility-inducingandmale-fertilecytoplasmsofonionTheorApplGenet,2000,101:778-782]。Engelk等[EngelkeT,TatliogluT.MitochondrialgenomediversityinconnectionwithmalesterileinAlliunschoenoprasumL.TheorApplGenet,2000,100:942-948]也发现洋葱雄性不育与线粒体基因组差异有关。Sato[SatoY.PCRamplificationofCMS-specificmitochondrialnucleotidesequencestoidentifycytoplasmicgenotypesofonion(AlliumcepaL.)TheorApplGenet,1998,96:367-370]利用CMS特殊线粒体核苷酸序列的PCR扩增来鉴定洋葱胞质基因型。Holford[HolfordP,CroftJH,NewburyHJ.Differencesbetween,andpossibleoriginsof,thecytoplasmsfoundinfertileandmale-sterileonions(AlliumcepaL.)[J].TheorApplGenet,1991,82:737-744]利用BamHI、HindIII酶切洋葱mtDNA，EcoRI、HindⅢ,Xbal酶切cpDNA，成功地区分了不育系、保持系。可见，洋葱雄性不育性与叶绿体基因组和线粒体基因组都存在联系。通过研究洋葱胞质不育，已获得了大量的RFLP标记，部分标记已成功应用于筛选、鉴别S胞质和N胞质，Kim[KimS,LeeET,ChoDY,HanT,BangH,PatilBS,AhnYK,YoonMK.Identificationofanovelchimericgene,orf725,anditsuseindevelopmentofamolecularmarkerfordistinguishingamongthreecytoplasmtypeinonion(AlliumcepaL.)Theor.Appl.Genet.2009,118:433-441]在S型和T型细胞质中发现了一个嵌合的开放阅读框orf725，并且开发了一个分子标记，能通过一次简单的PCR区分三种洋葱细胞质类型。与传统的“测交-回交、自交”等方法相比，这种技术可大大缩短两系的选育年限，提高育种效率。然而，由于细胞质中的DNA序列产生缺失、插入等变异现象、再加上遗传背景的差异、人工选择和自然选择等，上述的研究成果能否直接应用于我国的洋葱杂交种的选育，目前尚不清楚，需要进行大量的研究工作。
我国洋葱栽培历史较短，品种资源较匮乏。目前种植的品种可分为红皮、黄皮及白皮洋葱，栽培品种为开放授粉的常规品种，随着农业产业结构的调整，对洋葱优良品种的需求日益增加。由于洋葱品种选育的周期长，为普通蔬菜作物如白菜、萝卜的2～4倍，生产上主要以品种引进和常规品种选育为主，缺少有自主知识产权的杂交一代品种，需要花费大量的外汇从国外进口种子，使得出口创汇蔬菜生产的成本居高不下。要改变我国在洋葱育种领域上的落后局面，关键在于尽快广泛收集品种资源，走现代分子生物学技术与常规育种相结合的道路，缩短育种年限，加快分子标记辅助选择以及雄性不育系利用的研究。因此，不育材料与可育材料的鉴定工作已成为目前亟待解决的难题，是洋葱产业化的源头工作。
近年来，分子生物学的发展为植物遗传标记提供了一种基于DNA变异的新技术手段，即分子标记技术。与其他标记方法相比，分子标记具有无比的优越性。它直接以DNA形式出现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境的限制，不存在表达与否的问题；数量多，遍及整个基因组；多态性高，利用大量引物、探针可完成覆盖基因组的分析。基因标记的目的是实现分子标记辅助育种（MarkerAssistedSelection,MAS）。无论是与细胞质位点还是与核基因连锁的标记的辅助选择都可减少工作量，提高育种效率。利用与细胞质位点连锁的标记，可鉴别出单株的细胞质类型，淘汰可育材料中S型细胞质，只从N型细胞质类型的单株中选保持系，从而减少测交组合数和自交株数，减少工作量，避免盲目性，提高了选择效果。目前我们已经开发了一个洋葱细胞质雄性不育SCAR标记（专利号：ZL200910014679.9，公开号101492738A），利用该标记S型细胞质能扩增出339bp的条带，而N型细胞质无扩增产物。从理论上来讲，该SCAR标记可通过一次PCR区分洋葱S型和N型细胞质，但是在实际应用过程中，可能会因为实验操作失误和PCR的无效扩增最终导致错误的细胞质类型分类，如果错误的结果应用到田间育种中，将会给育种工作带来无法弥补的损失。因此，开发一种新的洋葱细胞质育性标记，避免这种错误分类情况的产生，对于洋葱不育系和保持系配套，选育洋葱杂交种具有重要意义。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种新的洋葱细胞质雄性不育SCAR标记。本发明利用已有的细香葱orfA501细胞质雄性不育的特异引物，对洋葱细胞质雄性不育系及其相应的保持系进行了PCR扩增，并对获得的片断进行了测序，根据测序结果利用PrimerPremier5.0设计Tail-PCR引物进行染色体步移，获得了部分侧翼序列。根据侧翼序列开发了鉴定洋葱细胞质基因型的分子标记，利用得到的分子标记可对洋葱材料的细胞质类型进行快速而又准确的判断，避免因为实验操作失误和PCR的无效扩增而导致错误分类情况，可加快洋葱细胞质雄性不育新品系的选育，建立新型的洋葱杂交种亲本选配体系。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种洋葱细胞质雄性不育SCAR标记，所述分子标记的特异片段长为2175bp，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；共同片段长度为1053bp，其核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。
上述洋葱细胞质雄性不育SCAR标记引物是：
正向引物：OC2175-F:5'-ATGCCACTTCTCCTTCCTCATATGGT-3'
反向引物：OC2175-R:5'-CCAAGGATTGCCAAGCATTTGGCACTGAC-3'；如SEQIDNo.4、5所示。
本发明根据Engelke和Tatlioglu[EngelkeT,TatliogluTA.PCR-markerfortheCMS1-inducingcytoplasminchivesderivedfromrecombinationeventseffectingthemitochondrialgeneatp9.TheorApplGenet,2002,104:698-702]报道的鉴别细香葱细胞质雄性不育的特异引物（5’-ATGGCTCGCCTTGAAAGAGAGC-3’和5’-CCAAGCATTTGGCGCTGAC-3’，如SEQIDNo.6、7所示）对洋葱细胞质雄性不育系S110、S118及其相应的保持系N210和N218的总DNA进行PCR扩增，结果仅在部分不育系材料中扩增出大小为472kb的片段，针对其不能准确区分洋葱细胞质育性的缺点，本发明的发明人对这一片段进行回收测序分析，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；根据测序结果，应用PrimerPremier5.0本发明的发明人设计了Tail-PCR引物进行染色体步移，获得了该片段的侧翼序列，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，根据获得的侧翼序列设计了一对分子标记引物：
正向引物：OC2175-F:5'-ATGCCACTTCTCCTTCCTCATATGGT-3'；
反向引物：OC2175-R:5'-CCAAGGATTGCCAAGCATTTGGCACTGAC-3'。
由北京博尚生物技术有限公司合成，PAGE纯化。
使用正向引物OC2175-F和反向引物OC2175-R，对洋葱细胞质雄性不育系S110、S118及其相应的保持系N210和N218的总DNA进行PCR扩增，不育系S110、S118均扩增出了一条2175bp的特异性条带和一条1053bp的条带，而相应的保持系N210和N218只扩增出1053bp的条带。
对已知育性的340份材料进行PCR验证（见表1），所有的不育系中均扩增出一条2175bp的特异性条带和一条1053bp的条带，而相应的保持系N210和N218只扩增出1053bp的条带（见图1）。PCR结果与田间判断结果吻合，说明应用这对引物完全可以鉴别洋葱细胞质基因型，1053bp条带在N型细胞质材料中的存在可以消除因为实验操作失误和PCR的无效扩增而导致的错误分类。
对以上洋葱细胞质雄性不育系S110和S118中扩增出来的特异片段，经过回收、转化、克隆和测序，得到S110和S118的测序结果完全一致，序列全长2175bp，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，两端含有引物序列，把这段序列与Genbank和DDBJ数据库进行序列比对，与洋葱的COXⅠ基因同源性达到98%（ADB54351.2）。
上述分子标记引物的筛选过程如下：
（1）选用洋葱细胞质雄性不育系S110、S118和对应的保持系N210、N218；
（2）CTAB法提取洋葱基因组总DNA；
（3）利用细香葱细胞质雄性不育特异性引物扩增洋葱总DNA；
（4）从不育系中回收特异性片断，经连接、转化、测序后，设计Tail-PCR引物进行染色体步移，获得侧翼序列；
（5）利用侧翼序列设计引物，对不育系S110、S118和保持系N210、N218进行验证；
（6）利用分子标记引物对已知基因型的其他个体材料共340份进行验证。
洋葱DNA提取采用改良CTAB法；PCR扩增在美国伯乐的TC-XP-D型基因扩增仪上进行，25μL体系，其中10×PCRBuffer(withMg2+)2.5μL，dNTPs(each2.5mM)2.0μL，Primer1、2(0.5μmol/L)各1.0μL，TaqDNApolymerase(5U/μL)TaqDNApolymerase(5U/μL)0.3μL，ddH2O17.2μL，反应程序为94℃预变性4min，[94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸2:30min]，35个循环，72℃延伸5min，4℃保存；PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶进行电泳分离分析，溴化乙啶染色，凝胶成像系统自动成像；特异条带回收纯化，按照BiospinGelExtractionKit使用说明；连接、转化、鉴定采用分子克隆II的方法；DNA序列测定委托北京博尚生物技术有限公司完成。其结果为，使用正向引物OC2175-F和反向引物OC2175-R，对洋葱细胞质雄性不育系S110、S118及其相应的保持系N210和N218的总DNA进行PCR扩增，不育系中均扩增出一条2175bp的特异性条带和一条1053bp的条带，而相应的保持系N210和N218只扩增出1053bp的条带。
本发明获得了一个稳定准确高效的鉴定洋葱细胞质基因型的分子标记。本发明的分子标记避免了实验操作失误和无效的PCR扩增而导致的细胞质基因型的错误分类，确保了洋葱不育系和保持系选育的准确性，在辅助选育洋葱细胞质雄性不育新品系中可以广泛应用，具体应用方式为：利用本发明的SCAR标记的引物对待测个体的总DNA进行PCR扩增，检测PCR扩增产物，若扩增出一条2175bp的特异性条带和一条1053bp的条带，则该待测个体为不育系；若至扩增出1053bp的条带，则该待测个体为保持系。
本发明选用洋葱细胞质雄性不育系S110、S118及其相应的保持系N210和N218的总DNA进行PCR扩增，获得了区分两系细胞质的稳定的分子标记，标记稳定可靠，为洋葱分子标记辅助选择育种体系奠定了基础。与现有技术相比，其优点是：本发明涉及的鉴定洋葱细胞质基因型的分子标记，除了在S型细胞质中有一条2175bp的特异条带外，在不育系和保持系中均能扩增出一条1053bp的条带。这种扩增结果避免了因为实验操作失误和无效的PCR扩增而导致的细胞质基因型的错误分类，保证了鉴定结果的准确可靠性，其鉴定结果与所用材料的表型完全一致。利用该分子标记辅助选择保持系，操作简便，节约成本。通过本发明，只需简单提取洋葱总DNA，然后进行简单的PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳，即可有效的鉴定材料的细胞质基因型。不仅避免了常规方法繁琐的筛选过程，更重要的是避免了因为实验操作失误和无效的PCR扩增而导致的细胞质基因型的错误分类，使得鉴定结果更加准确可靠有效。
附图说明
图1：不育系及其保持系的DNA电泳图谱。
其中：M为Marker，S为不育单株，N为可育单株。
图2：引物OC2175-F、OC2175-R对洋葱不育系及其保持系的PCR扩增结果。
其中：M为Marker，S为S110和S118的单株，N为N210和N218的单株。
图3：洋葱雄性不育系的分子验证。
其中：M为Marker，S为不育单株，N为可育单株。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1SCAR标记的筛选与应用
（一）材料与方法
1.DNA的提取与检测
洋葱细胞质雄性不育系及其相应的保持系基因组DNA提取方法采用改良CTAB法，琼脂糖凝胶电泳及分光光度计检测。
2.基因池的建立
应用分离群体分组分析法（BulkedSegregationAnalysis）即BSA法，将不育系的10个单株和与之对应的保持系10个单株的DNA样品分别等量混合，组成洋葱细胞质雄性不育系及其保持系的基因池。
3.引物的设计与合成
根据Engelke和Tatlioglu报道的鉴别细香葱细胞质雄性不育的特异引物（5’-ATGGCTCGCCTTGAAAGAGAGC-3’和5’-CCAAGCATTTGGCGCTGAC-3’，如SEQIDNo.6、7所示）对洋葱细胞质雄性不育系S110、S118及其相应的保持系N210和N218进行PCR扩增，结果仅在部分不育系材料中扩增出大小为472kb的片段，针对其不能准确区分洋葱细胞质雄性不育系和保持系的缺点，对这一片段进行测序分析，根据测序结果，应用PrimerPremier5.0本发明人设计了Tail-PCR引物进行染色体步移，获得了该片段的侧翼序列，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，根据获得的侧翼序列设计了一对分子标记引物：
正向引物：OC2175-F:5'-ATGCCACTTCTCCTTCCTCATATGGT-3'；
反向引物：OC2175-R:5'-CCAAGGATTGCCAAGCATTTGGCACTGAC-3'。
由北京博尚生物技术有限公司合成，PAGE纯化。
4.PCR扩增及检测
PCR扩增在美国伯乐的TC-XP-D型基因扩增仪上进行，25μL体系，其中10×PCRBuffer(withMg2+)2.5μL，dNTPs(each2.5mM)2.0μL，Primer1、2(0.5μmol/L)各1.0μL，TaqDNApolymerase(5U/μL)TaqDNApolymerase(5U/μL)0.3μL，ddH2O17.2μL，反应程序为94℃预变性4min，[94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸2:30min]，35个循环，72℃延伸5min，4℃保存；PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶进行电泳分离分析，溴化乙啶染色，凝胶成像系统自动成像。
5.特异条带回收纯化、克隆与测序
按照BiospinGelExtractionKit使用说明回收纯化特异条带；
特异条带的分子克隆采用分子克隆II的方法；
DNA序列测定委托北京博尚生物技术有限公司完成。
6.单株验证
通过田间观察判断各株系的育性，从而得到不育系和保持系17个组合，从每个组合的不育系和保持系中各随机抽取10株材料，提取基因组总DNA，用下述引物对这些已知育性的340份材料进行PCR扩增验证，反应体系及程序同4。引物序列为：
OC2175-F:5'-ATGCCACTTCTCCTTCCTCATATGGT-3'；
OC2175-R:5'-CCAAGGATTGCCAAGCATTTGGCACTGAC-3'。
（二）结果与分析
1.不育系及其相应的保持系基因组DNA的检测分析
应用改良的CTAB法提取洋葱鳞茎基因组总DNA的结果表明，所提取的DNA溶液清亮，无褐化现象。0.8%琼脂糖凝胶电泳结果见图1，电泳结果表明所提取的DNA在点样孔处没有明显的残留，说明多糖和蛋白质含量都不高；RNA含量甚少；DNA带位于同一位置，且清楚、无弥散、无明显降解。所以，提取到的高质量洋葱鳞茎DNA，适用于PCR扩增、AFLP分子标记等生物学试验。
2.PCR扩增结果
应用鉴别细香葱细胞质雄性不育育性的特异引物（5’-ATGGCTCGCCTTGAAAGAGAGC-3’和5’-CCAAGCATTTGGCGCTGAC-3’，如SEQIDNo.6、7所示）对洋葱细胞质雄性不育系S110、S118及其相应的保持系N210、N218进行扩增，结果在S110和S118部分个体中扩增出长度为472kb的片段，对此片段进行测序，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。
根据SEQIDNo.1所示的核苷酸序列，应用PrimerPremier5.0本发明的发明人设计了Tail-PCR引物进行染色体步移，获得了该片段的侧翼序列，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，根据获得的侧翼序列设计了一对分子标记引物：
正向引物：OC2175-F:5'-ATGCCACTTCTCCTTCCTCATATGGT-3'；
反向引物：OC2175-R:5'-CCAAGGATTGCCAAGCATTTGGCACTGAC-3'。
应用OC2175-F和OC2175-R引物对洋葱细胞质雄性不育系S110、S118及其相应的保持系N210和N218的基因池为模板进行PCR扩增，结果见图2，图中可以清楚的看到，在洋葱不育系中均扩增出一条2175bp的特异性条带和一条1053bp的条带，而相应的保持系N210和N218只扩增出1053bp的条带。
3.个体验证
对通过观察判断获得洋葱细胞质育性的340份材料进行PCR验证（见表1），所有的不育系中均扩增出一条2175bp的特异性条带和一条1053bp的条带，而相应的保持系N210和N218只扩增出1053bp的条带（见图3），PCR结果与田间判断结果吻合。在不育系单株中有2175bp和1053bp的条带，而保持系单株中只有1053bp的条带，说明应用这对引物完全可以鉴别本课题组洋葱的细胞质基因型，据此可得知扩增出的2175bp片段与洋葱育性有一定的联系。
表1洋葱不育系和保持系单株验证结果
“＋”表示有扩增片段；“-”表示无扩增片段。

Claims (7)

1.一种洋葱细胞质雄性不育SCAR标记，其特征在于：所述分子标记的特异片段长为2175bp，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；共同片段长度为1053bp，其核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。
2.根据权利要求1所述的洋葱细胞质雄性不育SCAR标记，其特征在于：所述SCAR标记的引物是：
正向引物：OC2175-F:5'-ATGCCACTTCTCCTTCCTCATATGGT-3'
反向引物：OC2175-R:5'-CCAAGGATTGCCAAGCATTTGGCACTGAC-3'；如SEQIDNo.4、5所示。
3.权利要求1或2所述的洋葱细胞质雄性不育SCAR标记在鉴定洋葱细胞质基因型中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：具体应用方式为：利用SCAR标记的引物对待测个体的总DNA进行PCR扩增，检测PCR扩增产物，若扩增出一条2175bp的特异性条带和一条1053bp的条带，则该待测个体为不育系；若至扩增出1053bp的条带，则该待测个体为保持系。
5.一对引物，其特征在于：包括正向引物和反向引物，序列如下：
正向引物：OC2175-F:5'-ATGCCACTTCTCCTTCCTCATATGGT-3'
反向引物：OC2175-R:5'-CCAAGGATTGCCAAGCATTTGGCACTGAC-3'；如SEQIDNo.4、5所示。
6.权利要求5所述的引物在鉴定洋葱细胞质基因型中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：具体应用方式为：利用引物对待测个体的总DNA进行PCR扩增，检测PCR扩增产物，若扩增出一条2175bp的特异性条带和一条1053bp的条带，则该待测个体为不育系；若至扩增出1053bp的条带，则该待测个体为保持系。
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