CN109112230B - 能够鉴定柱花草花粉不育基因的issr-scar标记及其鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能够鉴定柱花草花粉不育基因的ISSR‑SCAR标记及其鉴定方法，本发明提供了一段704bp能够在不育柱花草中扩增得到的特异性DNA片段和该序列的一对引物，所述片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示，可用于鉴别不育柱花草，本发明提供的鉴定不育柱花草的方法具有操作简单、重复性好、稳定性强，为建立柱花草稳定的雄性不育系提供新的理论基础，为柱花草杂交育种奠定基础。

Description

能够鉴定柱花草花粉不育基因的ISSR-SCAR标记及其鉴定 方法

技术领域

本发明属于分子标记鉴定领域，具体涉及一种能够鉴定柱花草花粉不育基因的ISSR-SCAR标记及其鉴定方法。

背景技术

柱花草(Stylosanthes)，巴西苜蓿，热带苜蓿等。描述夏季生长最旺的多年生直立的草本植物。高达1米。茎上多毛，叶羽状三出。穗状花序聚集成顶生头状花序，花黄色，荚果具一个结实的节和很小的喙，种子黄棕色。柱花草属植物原产南美洲、中美洲及加勒比海地区。1962年华南热带作物研究院从中美洲引入海南试种，主要作为橡胶园覆盖作物。1980年后，广东、广西、海南等地先后从澳大利亚、国际热带农业中心引种，并应用于生产。中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所从20世纪60年代起从哥伦比亚、澳大利亚等地引进柱花草种植，先后培养了热研2号(Stylosanthes guianenisis cv.Reyan No.2)、热研5号(Stylosanthes guianenisis cv.Reyan No.5)、西卡(Stylosanthes scabraVog.cv.Seca)、热研7号(Stylosanthes guianenisis cv.Reyan No.7)、热研10号(Stylosanthes guianenisis cv.Reyan No.10)、热研13 号(Stylosanthes guianenisiscv.Reyan No.13)、热研18号(Stylosanthes guianenisis cv.Reyin No.18)、热研20号(Stylosanthes guianenisis cv.Reyan No.20)及热研21号(Stylosanthes guianenisiscv.Reyan No.21)等9个优良柱花草品种。目前，热研2号、热研5号等优良柱花草品种已在广东、广西、福建、海南、云南、贵州、四川等地区广泛种植。这些品种均是通过常规选育或辐射育成的品种，还没有杂交品种，因此，开展柱花草杂交育种显得尤为重要。柱花草属于十字授粉植物，因其花小、去雄困难，阻碍了开展杂交育种的进程，因此获得稳定的雄性不育系是开展杂交育种的前提。利用分子标记技术，筛选与柱花草花粉不育基因相关的分子标记，从而可以筛选出稳定的柱花草雄性不育系，为柱花草杂交育种奠定基础。

近年来，DNA分子标记技术逐步成熟和完善，在遗传图谱构建、品种鉴定、亲缘关系分析和基因定位等方面得到了广泛的应用。目前常用的DNA分子标记主要有基于DNA分子杂交的RFLP、小卫星DNA等和基于PCR反应的RAPD、SCAR、SSR、SRAP等。序列特异性扩增区域(Sequence characterized amplified regions，SCARs)标记通常是由RAPD、 SRAP、ISSR标记转化而来，是将上述分子标记筛选出的特异标记片段进行克隆和测序，根据其碱基序列设计一对特异引物，用于对特征扩增区域的特异性扩增。SCAR标记一般表现为扩增片段的有无，是一种显性标记，具有稳定性好、可重复性强等优点，已成为育种实践中能直接应用的首选标记。经查阅资料，发现目前尚未有关于能够鉴定柱花草花粉不育基因的ISSR-SCAR标记的报道，本发明填补了该领域的空白。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种能够鉴定柱花草花粉不育基因的 ISSR-SCAR标记及其鉴定方法，该方法操作简单、重复性好、稳定性强，为建立柱花草稳定的雄性不育系提供新的理论基础，为柱花草杂交育种奠定基础。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：能够在不育柱花草中扩增得到的特异性DNA片段，所述片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

一组能够鉴定柱花草花粉不育基因的SCAR引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示，具体为：正链引物：5’-AGAGAGAGAGAGAGAGCCGTTG-3’；负链引物：5’-AGAGAGAGAGAGAGAGTCGAAG-3’。

上述的引物对在柱花草花粉不育基因鉴定方面的应用。

一种柱花草花粉不育基因的DNA分子鉴定方法，它包括以下步骤：利用序列为SEQID NO：2和SEQ ID NO：3所示的SCAR引物，对柱花草DNA样品用PCR进行扩增，通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定；电泳结果中出现一条704bp条带的样品为不育柱花草。

进一步地，所述PCR反应条件为：15μL体系中包含75ng基因组DNA， 0.67μmol/L引物，7.5μL 2×Easy Taq PCR SuperMix，混匀后加入20～30μL矿物油，扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，65℃复性45s，72℃延伸1min，共45个循环； 72℃延伸7min；4℃停止反应。

本发明具有以下优点：本发明提供了一段704bp能够在不育柱花草中扩增得到的特异性 DNA片段和该序列的一对引物，可用于鉴别不育柱花草，本发明提供的鉴定不育柱花草的方法具有操作简单、重复性好、稳定性强，为建立柱花草稳定的雄性不育系提供新的理论基础，为柱花草杂交育种奠定基础。

附图说明

图1为部分引物在基因池间引物筛选结果电泳图，图中：M：100bp DNA Laddermarker； S：不育基因池；F：可育基因池；箭头所指表示UBC835在不育基因池中产生的特异性条带；

图2为引物UBC835在基因池及基因池中各单株中的验证电泳图，图中：M：100bpPlus DNA Ladder marker；1：不育基因池；2：可育基因池；3～7：不育植株；8～12可育植株；箭头所指表示不育单株间的特异性条带；

图3为引物UBC835在BC1F1代分离群体各单体的扩增情况电泳图，其中，M:100bpPlus DNA Ladder marker；P1、P2：亲本；1～15：不育植株；16～30：可育植株；箭头所指表示不育单株间的特异性条带；

图4为ISSR特异片段回收图，图中，M:100bp Plus DNA Ladder marker；1、4、7：不育基因池；2、5、8：可育基因池；3、6、9：回收片段，箭头所指为引物UBC 835；

图5为SCAR引物在BC1F1代分离群体中的验证电泳图，图中，M:100bp Plus DNALadder marker；1～15：不育植株；16～30：可育植株。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：

实施例1：基因组DNA的提取及检测

1.试验材料：试验材料为柱花草1979(花粉不育)和热研5号柱花草(花粉可育)。以1979 为母本，热研5号柱花草为轮回父本进行杂交，从BC1F1代群体中分别选取花粉可育群体15 株，不育群体15株。试验材料种植保存于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所草业研究室试验基地。

2.试验方法：参考Huang等(2014)的CTAB法提取基因组DNA。提取产物经琼脂糖凝胶电泳以及核酸蛋白含量仪测定后，筛选出符合试验要求的样品保存于-20℃冰箱。提取基因组 DNA的方法具体如下：

(1)在研钵中加入充足的液氮，放入柱花草顶端新鲜嫩叶试验材料后迅速研磨，磨成粉末状，快速转入2mL离心管中，加入1mL 4℃预冷的CTAB-free缓冲液，放入冰中，冰浴10min。然后再使用离心机离心6min，转速为8 000r/min，之后弃掉上层清液；

(2)再次加入1mL 4℃预冷的CTAB-free缓冲液，充分混匀，再放入冰中，冰浴10min。再使用离心机离心6min，转速为8 000r/min，之后弃掉上层清液；

(3)每个离心管中加入1mL 65℃预热的3×CTAB提取缓冲液，使缓冲液与下层沉淀充分混匀，放入65℃中水浴45min，其间大概每15min拿出轻轻地上下颠倒两次。水浴完毕后，再使用离心机在4℃中离心6min，设定转速为11000r/min；

(4)取800μL的上清液，加到灭菌过的新的2mL的离心管中。再加入与之等体积的平衡酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)溶液，轻微地颠倒混匀，然后在4℃中离心8min，设定转速为12000 r/min；

(5)轻轻地抽取600μL的上清液，加到灭菌过的新的2mL离心管中，然后加入等体的氯仿/异戊醇(24:1)溶液，轻轻颠倒混匀，在4℃中离心8min，设定转速为12000r/min；

(6)轻轻抽取400μL的上清液，此步骤必须小心，不易过多、过快吸取上清液，不要震荡，以免造成蛋白杂质污染。加到灭菌过的新的2mL的离心管中，并再次加入等体的氯仿/异戊醇(24:1)溶液，轻微地颠倒混匀，然后在4℃中离心8min，设定转速为12000r/min；

(7)吸取200μL的上清液，此步骤注意事项如上步，加入灭菌过的新的1.5mL的离心管之中，然后加入等体积的异丙醇，轻微左右震荡，置于-20℃冷藏室沉淀30min～1h。

(8)在4℃中离心6min，设定转速为11000r/min，弃掉液相，沉淀附着在管底，之后用4℃预冷的70％乙醇清洗一次，弃掉上层液相部分。再用4℃预冷的无水乙醇溶液清洗一次，再次弃掉上层液相部分，确保沉淀在管中彻底干燥后加入100μLTE缓冲液溶解沉淀，同时加入1μL RNaseA酶(10mg/mL)，然后放入到37℃水浴锅中水浴30min；水浴后放入-20℃冰箱保存。

实施例2：柱花草花粉育性基因池的构建

根据BSA法原理(Michelmore,1991)，参照王成等(2007)的方法，从BC1F1代的可育、不育个体DNA样品中，随机选取5株，分别等量混匀，构成花粉可育基因池和花粉不育基因池，将构建好的基因池置于4℃冰箱中保存备用。

实施例3：ISSR反应

利用哥伦比亚大学公布的100条ISSR引物，由英上海滩捷基贸易有限公司合成。以不育基因池和可育基因池为模板进行引物筛选，筛选在不育基因池中扩增稳定、带型清晰具有多态性的引物。利用筛选出的引物在不育和可育基因池各单株及BC1F1代所有分离群体中验证，确定其是否与花粉不育基因连锁及遗传连锁距离。

ISSR反应体系为15μL，包括75ng基因组DNA，0.67μmol/L引物，7.5μL 2×Easy TaqPCR SuperMix(北京全式金)，混匀后加入20～30μL矿物油。在Thermal Cycler Dice ^TM(Bio-Rad S1000^TM)型PCR仪上扩增。扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，50～60℃复性45s，72℃延伸1min，共45个循环；72℃延伸7min；4℃停止反应。扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。

试验结果：

1.筛选多态性引物：

利用100条ISSR引物对基因池中的DNA模板进行扩增，筛选在不育基因池中有差异条带、带型清晰、扩增稳定的引物，扩增部分结果如表1所示，部分引物在基因池中的筛选结果见图1。从图1可以看出，引物UBC835，能在不育基因池中700bp处扩增出明显特异条带。由此推断，ISSR标记UBC835-700bp与柱花草花粉不育基因可能存在一定的连锁关系。

表1：花粉不育基因池特异ISSR引物筛选结果

2：特异ISSR引物在基因池各单株中的验证：

关于所获得的多态性片段是否与花粉不育基因相关或连锁，还需在后代群体中验证，先用基因池各单株进行验证。以基因池各单株DNA为模板，分别对以上经筛选获得的不育基因池有特异条带的引物进行PCR扩增，这些引物都能在不育基因池各单株中扩增出特异性条带，而在可育基因池各单株中未扩增出此条带。因此推断这些标记与不育基因存在一定的连锁关系。图2为引物UBC835对基因池各单株的扩增结果。从图2可以看出，引物UBC835在可育与不育基因池各单株间能稳定的扩增出差异条带，其中花粉不育基因池各单株在700bp处，可扩增出一条差异带，而花粉可育基因池没有这一条带。由此推断，ISSR标记UBC835-700 可能与柱花草花粉不育基因存在一定的相关关系。

3.特异ISSR引物在BC1F1代分离群体中的验证

为了更确切地说明以上获得的ISSR标记与柱花草育性基因间的紧密相关程度，利用上述筛选出的特异引物对BC1F1群体进行验证，其中UBC835-700bp特异标记在分离群体中验证成功，再次证实了这个标记确实与柱花草花粉不育基因连锁。图3为引物UBC835对BC1F1所有分离群体个体进行验证结果，从图中可以看出1-15号不育群体在700bp处都拥有自己的特征条带，而16-30号可育群体中均没有该条条带，结果证实了ISSR标记UBC835-700与柱花草花粉不育基因存在一定的连锁关系。

实施例4：SCAR转化

利用DNA凝胶回收试剂盒(Takara)回收不育基因池特异片段，送ThermoFisher公司进行测序。利用DNAMAN软件对目的片段测序结果进行分析，结合引物设计的原则，将设计好的引物送到英滩捷基(上海)贸易有限公司合成。

合成条件为：15μL体系中包含75ng基因组DNA，0.67μmol/L引物，7.5μL 2×EasyTaq PCR SuperMix，混匀后加入20～30μL矿物油。在Thermal Cycler Dice^TM(Bio-RadS1000 ^TM)型PCR仪上扩增。ISSR-SCAR扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，60～70℃复性45s，72℃延伸1min，共45个循环； 72℃延伸7min；4℃停止反应。扩增产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测。

回收试剂盒回收步骤具体为：

将筛选得到与柱花草花粉不育基因连锁的ISSR的特异标记回收。用无菌的手术刀割下不育基因池中特异标记的琼脂糖凝胶，再利用DNA凝胶回收试剂盒进行回收。DNA凝胶回收试剂盒回收步骤：

(1)在离心管中加入割下的凝胶，加入600μL的Buffer GM，在50℃～55℃水浴溶解。将胶溶解后的溶液倒入DNA离心柱中，并加上收集管，离心1min，转速为12000r/min。

(2)倒掉收集管中的废液，加入600μL的Buffer WB到离心柱中，离心1min，转速为12000r/min；倒掉废液，再重复1次步骤(3)。

(3)倒掉废液，空离心2min，转速为12000r/min。打开离心柱顶盖，静置2min，再把离心柱从收集管中拿出，放在新的离心管上。再加入20μL的Elution Buffer，离心1min，转速为12000r/min。去除离心柱，离心管中为目标样品，放置-20℃保存。

试验结果：

1.特异片段的测序及SCAR引物的设计

以不育基因池为模板，利用上述筛选出的能扩增出不育特异标记的引物对其进行扩增，并利用回收试剂盒对其产生的特异条带进行回收，图4为特异条带回收图，从图中可看出引物UBC835在700bp处能回收到产物。

将上述回收的片段送去英滩捷基(上海)贸易有限公司测序。引物UBC835在704bp处成功测序。引物UBC835特异片段核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，在序列的上下游都找到了引物UBC835自身及其反向互补序列的位置，该片段长度为704bp。与ISSR引物扩增出的目标片段(700bp)结果相一致，这也证明回收片段是正确的。

根据测序结果，应用DNAMAN软件进行分析，考虑到引物设计的原则，还有引物中GC的含量，尽量减少发卡结构和碱基错配的现象发生，共设计了1对正反链的ISSR-SCAR引物，引物名称及序列见表2。

表2：ISSR-SCAR引物序列及特异片段

2.SCAR标记在BC1F1代群体中的验证

利用设计的1对ISSR-SCAR引物，对BC1F1群体扩增验证，获得较好的扩增效果，在不育群体中均有目标条带，在不育群体中均为目标条带，说明这个ISSR标记成功转化为SCAR 标记。图5为引物ISSR-SCAR03对BC1F1群体的验证结果，从图5中可以看出，1～15号花粉不育群体中均有704bp条带，16～30号花粉可与群体中无此条带，说明此ISSR标记已被成功转化为SCAR标记，是与不育基因连锁的SCAR标记。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所

<120> 能够鉴定柱花草花粉不育基因的ISSR-SCAR标记及其鉴定方法

<130> 2018

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 704

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 1

agagagagag agagagccgt tggcggagag agagagagat ccgacgagag agaggttccg 60

ccaccaccac ctccgttcaa gggagccgcc accctcgtct cgtcgccgcc gtagaaggtt 120

ccgtcgccgc gccgtgggtg gtggtgacgg cttctccgtc aatggaggac ttcgtcatca 180

atggcgacgg agaagacggc ggttcgagtt acagtggcgt cggaatccgc catctctgcc 240

cgtttcggct gtctctctct ctctttccgt ttccttcttc ttcgatggcg acccaactca 300

gaacgacggc ggcgatgggg tcgacaacag tggtgacgag ctcttgctgc gtaatgaagc 360

gcggctggag ctggcagcat tggagccgca gccacatagg cacaactgat cgctcatgat 420

gagtatgatc tggcagcctt tgtcgccaag ccgaattcgt acgcagtcca ttcacccagt 480

atatgccgta tcgtgcatgt tggattgcct gtgttctctc cttttacacc tcattgtatg 540

tgacgctcgc gaacatgccg gagcgtcacg tagactgaag tgtgagctga tataaagtga 600

ggcactctac cgagcagggt tgacgctctt tcattttctt gggtagctcc tccttgttga 660

ccggtttgga ctcaaactca cccttcgact ctctctctct ctct 704

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 2

agagagagag agagagccgt tg 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 3

agagagagag agagagtcga ag 22

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 4

agagagagag agagagyc 18

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 5

gagagagaga gagagaa 17

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 6

gtgtgtgtgt gtgtgtt 17

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 7

gagagagaga gagagayc 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 8

gaagaagaag aagaagaa 18

<210> 9

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 9

ccctccctcc ctccct 16

<210> 10

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 10

ggatggatgg atggat 16

Claims (5)

1.能够在不育柱花草中扩增得到的特异性DNA片段，其特征在于所述片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一组能够鉴定柱花草花粉不育基因的SCAR引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

3.权利要求2所述的引物对在柱花草花粉不育基因鉴定方面的应用。

4.一种柱花草花粉不育基因的DNA分子鉴定方法，其特征在于，它包括以下步骤：利用序列为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的SCAR引物，对柱花草DNA样品用PCR进行扩增，通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定；电泳结果中出现一条704bp条带的样品为不育柱花草。

5.如权利要求4所述的一种柱花草花粉不育基因的DNA分子鉴定方法，其特征在于，所述PCR反应条件为：15μL体系中包含75ng基因组DNA，0.67μmol/L引物，7.5μL 2×Easy TaqPCR SuperMix，混匀后加入20～30μL矿物油，扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，65℃复性45s，72℃延伸1min，共45个循环； 72℃延伸7min；4℃停止反应。

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