CN105483225B - 水稻温敏核不育基因tms5的功能特异性分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于两系杂交水稻育种中的分子标记辅助选择与种子纯度检测技术领域，特别涉及一组水稻温敏核不育基因tms5的功能特异性分子标记及其应用。一组水稻温敏核不育基因tms5的功能特异性标记，该特异性标记引物选自：核苷酸序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。本发明根据引起水稻温敏核不育基因tms5功能变化的单碱基突变(C‑A)，设计了一系列能特异扩增野生型C和突变型A的引物，并在3’端位置引入错配碱基，利用限制性内切酶对PCR产物酶切，将野生型和突变型准确的区分开。
Description
技术领域
本发明属于两系杂交水稻育种中的分子标记辅助选择与种子纯度检测技术领域，特别涉及一组水稻温敏核不育基因tms5的功能特异性分子标记及其应用。
背景技术
水稻是我国重要的粮食作物之一，全国有超过半数的地区以稻米为主食，并且随着人民生活水平的提高，越来越多的人开始关注稻米的食味品质，因此产量高品质好成为选育水稻新品种的重要标准。杂交水稻的杂种优势在水稻产量和品质方面尤为突出，杂交水稻育种技术也倍受关注。目前杂交水稻体系包括三系杂交水稻和两系杂交水稻，二者的区别主要在于不育系的选择和繁育。两系法中的不育系具有一系两用、配组自由、繁种制种程序简单等优势，在育种领域发展迅速。
随着两系杂交育种方法的广泛推广，对水稻两系不育系的研究也越来越深入。以往选育两系不育系主要根据抽穗开花期的田间表现，花粉镜鉴，套袋自交等方法，步骤繁琐，准确性低，时间长，见效慢。但是随着分子生物学的发展，更多的分子手段运用到两系不育系的筛选中，大大提高了选育效率。目前很多水稻光温敏核不育基因已经被定位，有些已经被克隆，对两系杂交水稻的应用起到很大的推动作用。本发明就是在已经定位克隆的温敏雄性核不育基因tms5的研究基础上，设计特异性功能标记，并将其应用于水稻温敏核不育系的选育中。中科院遗传所利用安农S-1×南京11杂交产生的重组自交系F8代群体，对安农S-1的不育基因进行了定位分析，将其温敏不育基因定位于第2染色体，位于标记C365和G227之间，并将该基因命名为tms5；进一步地，华南农业大学发现了与tms5基因完全共分离的EST标记HN57，该标记位于第2染色体的31.2cM处，并用SSR标记和516株F2不育株将其定位在RMAN7和RMAN54之间的181kb区域；华南农大对安农S-1和株1S测序发现在Os02g0214300基因的第71个碱基的位置有一个C-A碱基的突变，这个突变导致RNA酶ZS1功能缺失。RNA酶ZS1能够在体外和体内把3个泛素核糖体L40融合蛋白基因(UbL40)mRNA加工成多个片段。高温使得UbL40mRNA水平上升，在tms5突变体中，RNA酶ZS1功能缺失，由于UbL40mRNA过度积累，导致花粉产量降低和雄性不育，而野生型中过量的UbL40mRNA能被ZS1裂解，育性正常。
本发明在此基础上对tms5基因引起水稻温敏核不育的单碱基突变(C-A)，设计了一系列能特异扩增野生型C和突变型A的引物，并在3’端位置引入错配碱基，利用限制性内切酶对PCR产物酶切,可有效检测温敏核不育基因tms5。本发明提供的分子标记对水稻温敏核不育基因tms5的检测具有普遍应用价值，可以广泛地应用于tms5的转育研究和两系杂交稻种子的纯度检测中。
发明内容
本发明提供一组水稻温敏核不育基因tms5的特异性标记引物，用于利用分子标记辅助选择技术快速高效地筛选出具有温敏核不育基因tms5的水稻材料。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一组水稻温敏核不育基因tms5的功能特异性标记，该特异性标记引物为：
dtms51/PvuI的上游引物序列为5’-CATCGTGCTTCGTGCCAAAACGG-3’,所述核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；下游引物序列5’-TCGACGGTGAGGGGCGGCGCGATC-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
dtms52/BsiWI的上游引物序列为5’-CCCATCGTGCTTCGTGCCAAAAC-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；下游引物序列5’-TCGACGGTGAGGGGCGGCGCGTAC-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；
dtms53/Hpy99I的上游引物序列为5’-CGGCCCGGCCCATCGTGCTTCGT-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；下游引物序列5’-TCGACGGTGAGGGGCGGCGCCGTC-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
本发明所述的水稻温敏核不育基因tms5的功能特异性分子标记，可用于利用分子标记辅助选择技术快速高效地筛选出具有温敏核不育基因tms5的水稻材料。3个位于水稻温敏不育基因tms5上的dCAPs标记：dtms51/PvuI、dtms52/BsiWI和dtms53/Hpy99I。
根据研究报道的温敏核不育基因tms5的序列分析结果，tms5是功能缺失的基因，其功能缺失是开放阅读框的第71个碱基由C－A的突变导致，即水稻品种tms5开放阅读框第71个碱基为C时,环境高温和低温条件下可育，tms5开放阅读框第71个碱基为A时，高温不育，低温可育。利用这个SNP突变，本发明设计了3个位于tms5基因内的dCAPS标记。这3个dCAPS标记用于判定水稻材料是否为温敏型不育材料，从而实现标记辅助选择温敏核不育系，并鉴定两系杂交水稻的种子纯度。
一种采用所述的特异性标记引物检测水稻温敏核不育基因tms5的方法，该方法包括如下步骤：
提取待测水稻标本基因组DNA作为模板，利用3对引物中任意一对特异性标记引物对水稻样品DNA进行扩增，再对PCR产物用限制性内切酶进行酶切后电泳，PCR产物源于正常可育的TMS5基因可以被酶切，而扩增产物源于高温不育的tms5基因不能被酶切，所以tms51/PvuI扩增产物酶切后电泳谱带为可育材料142bp，携有tms5基因的温敏核不育系谱带为165bp；dtms52/BsiWI扩增产物酶切后电泳谱带为可育材料147bp，携有tms5基因的温敏核不育系167bp；dtms53/Hpy99I扩增产物酶切后电泳谱带为可育材料150bp，携有tms5基因的温敏核不育系169bp；杂交稻水稻材料则会扩增出不育和可育的两条谱带。
所述的特异性标记引物的PCR扩增采用如下体系：pH 8.8的Tris-HCl33.5mM，(NH4)2SO48.0mM，MgCl21.5mM，TWEEN-200.05％，dNTPs 0.2mM，上、下游引物各3.3ng/μl，TaqDNA聚合酶2.0单位，模版DNA50ng。
作为优选，PCR反应条件具体参数为：94℃2分钟；94℃45秒、63℃45秒、72℃1分钟，30个循环；72℃8分钟。
作为优选，特异性标记引物的PCR产物的酶切反应条件为：反应体系为10μl的PCR产物，3.0单位的内切酶，1.5μl的10×Buffer，加ddH2O至15μl，反应条件：PvuI和Hpy99I限制性内切酶37℃，3小时；BsiWI为55℃，3小时。
本发明的有益效果是：本发明属于两系杂交水稻育种中的分子标记辅助选择与种子纯度检测技术领域，开发了水稻温敏核不育基因tms5的一系列功能特异性的衍生酶切扩增多态性序列(derived cleaved amplified polymorphic sequences,dCAPS)分子标记。
本发明根据引起水稻温敏核不育基因tms5功能变化的单碱基突变(C-A)，设计了一系列能特异扩增野生型C和突变型A的引物，并在3’端位置引入错配碱基，利用限制性内切酶对PCR产物酶切，将野生型和突变型准确的区分开。这些分子标记的开发有助于运用分子标记辅助选择技术准确有效地筛选到具有tms5基因的水稻温敏核不育系，节省育种时间，加快育种进程，降低育种成本，整个检测过程操作简单且准确性高。
附图说明
图1dtms51/PvuI对35个水稻品种的凝胶电泳图，其中，M：分子量标记；01-04：未携带tms5基因的恢复系内香恢2156、成恢727、岳恢9113和中恢161；05-35：携带纯合tms5基因温敏核不育系瑞97S、128S、雨03S、株1S、628S、33S、雨06S、1892S、深08S、H638S、中广S、C815S、科08S、MS、龙S、广占63S-4、BPH68S、Y04S、潭农S、占S、旭98S、089S、134S、152S、163S、广湘24S、井大1S、福龙S、2301S、764S、望S；
图2dtms51/PvuI在深08S/宜香B的F2群体中筛选温敏雄性核不育单株的凝胶电泳和花粉粒染色图，其中：图2Adtms51/PvuI在深08S/宜香B的F2群体中筛选温敏雄性核不育单株的凝胶电泳，M：分子量标记；01-24：未携带tms5基因和携带杂合tms5基因的24个可育单株；25-46：携带纯合tms5基因的23个不育单株；S：母本深08S；Y：父本宜香B；图2B，可育单株的1％I2-KI溶液花粉粒染色图；图2C，不育单株的1％I2-KI溶液花粉粒染色图。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1、水稻温敏核不育基因tms5的特异性dCAPS分子标记的设计与筛选
根据研究报道的温敏核不育基因tms5的序列分析结果，tms5是功能缺失的基因，其功能缺失是开放阅读框的第71个碱基由C－A的突变导致，即水稻品种tms5开放阅读框第71个碱基为C时,环境高温和低温条件下皆可育，tms5开放阅读框第71个碱基为A时，高温不育，低温可育。利用这个SNP突变，本发明设计筛选了3个位于tms5基因内的dCAPS标记，具体为：
dtms51/PvuI的上游引物序列为5’-CATCGTGCTTCGTGCCAAAACGG-3’,所述核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；下游引物序列5’-TCGACGGTGAGGGGCGGCGCGATC-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
dtms52/BsiWI的上游引物序列为5’-CCCATCGTGCTTCGTGCCAAAAC-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；下游引物序列5’-TCGACGGTGAGGGGCGGCGCGTAC-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；
dtms53/Hpy99I的上游引物序列为5’-CGGCCCGGCCCATCGTGCTTCGT-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；下游引物序列5’-TCGACGGTGAGGGGCGGCGCCGTC-3’，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
应用下述步骤检测35个水稻品种中的tms5基因。
1.DNA提取
(1)将35个水稻品种的种子分别置于预先标号的培养皿，30℃发芽7天。
(2)剪取水稻幼苗叶片2～3cm，剪成0.5cm长的碎片，放入2.0mL离心管中。
(3)加入450μl DNA提取液和一颗钢珠，应用组织研磨仪进行研磨。
(4)加入450μl氯仿萃取液，盖紧盖子，上下颠倒混匀。
(5)11,000rpm离心2分钟至清晰分相。吸取上清液400μl，转入新的1.5ml离心管中，弃枪头。
(6)加入800μl预冷的无水乙醇，盖紧盖子，上下颠倒混匀。-20℃放置30分钟。
(7)11,000rpm离心3分钟至沉淀附于离心管底部，弃上清液。
(8)用70％乙醇洗涤沉淀2遍，将1.5ml离心管倒置于纸上，自然干燥。
(9)加入100μl的1/10×TE缓冲液溶解沉淀。
(10)取2μl进行PCR扩增。
2.PCR扩增
采用10μl反应体系，Tris-HCl(pH 8.8)33.5mM，(NH4)2SO48.0mM，MgCl21.5mM，TWEEN-200.05％，dNTPs 0.2mM，上、下游引物各3.3ng/μl，Taq DNA聚合酶2.0单位，模版DNA50ng。PCR反应条件具体参数为：94℃2分钟；94℃45秒、63℃45秒、72℃1分钟，30个循环；72℃8分钟。。
3.PCR产物的酶切反应
在10μl的PCR产物中加入3.0单位的限制性内切酶，1.5μl的10×Buffer，并加ddH2O至15μl。反应条件：PvuI和Hpy99I限制性内切酶37℃，3小时；BsiWI为55℃，3小时。
4.酶切产物电泳及显色
在酶切产物中加入10*NEBuffer，每样品取8μl上样于3％琼脂糖凝胶；接通电极，在100V恒定电压下电泳4小时，关闭电源；取下凝胶，GelRed核酸染色液显色。
dtms51/PvuI对35个水稻品种的凝胶电泳图如图1所示：其中，01-04为未携带tms5基因的水稻恢复系，为可育材料，tms51/PvuI扩增产物可以被酶切，酶切后电泳谱带为142bp，05-35为携带纯合tms5基因的两系温敏核不育系，tms51/PvuI扩增产物不能被酶切，携有tms5基因的温敏核不育系谱带为165bp，因此dtms51/PvuI特异性功能标记能从水稻品种中筛选出携带tms5基因的温敏核不育系。
实施例2、特异性dCAPS分子标记在水稻温敏核不育系选育中的应用验证
2015年将深08S/宜香B的F2群体种植在中国水稻研究所实验基地，植株幼苗期取少量叶片提取DNA。
1.DNA提取
(1)剪取水稻幼苗叶片2～3cm，剪成0.5cm长的碎片，放入2.0mL离心管中。
(2)加入450μl DNA提取液和一颗钢珠，应用组织研磨仪进行研磨。
(3)加入450μl氯仿萃取液，盖紧盖子，上下颠倒混匀。
(4)11,000rpm离心2分钟至清晰分相。吸取上清液400μl，转入新的1.5ml离心管中，弃枪头。
(5)加入800μl预冷的无水乙醇，盖紧盖子，上下颠倒混匀。-20℃放置30分钟。
(6)11,000rpm离心3分钟至沉淀附于离心管底部，弃上清液。
(7)用70％乙醇洗涤沉淀2遍，将1.5ml离心管倒置于纸上，自然干燥。
(8)加入100μl的1/10×TE缓冲液溶解沉淀。
(9)取2μl进行PCR扩增。
2.PCR扩增
采用10μl反应体系，Tris-HCl(pH 8.8)33.5mM，(NH4)2SO48.0mM，MgCl21.5mM，TWEEN-200.05％，dNTPs 0.2mM，上、下游引物各3.3ng/μl，Taq DNA聚合酶2.0单位，模版DNA50ng。PCR反应条件具体参数为：94℃2分钟；94℃45秒、63℃45秒、72℃1分钟，30个循环；72℃8分钟。。
3.PCR产物的酶切反应
在10μl的PCR产物中加入3.0单位的限制性内切酶，1.5μl的10×Buffer，并加ddH2O至15μl。反应条件：PvuI和Hpy99I限制性内切酶37℃，3小时；BsiWI为55℃，3小时。
4.酶切产物电泳及显色
在酶切产物中加入10*NEBuffer，每样品取8μl上样于3％琼脂糖凝胶；接通电极，在100V恒定电压下电泳4小时，关闭电源；取下凝胶，GelRed核酸染色液显色。
dtms51/PvuI对35个水稻品种的凝胶电泳图如图1所示：其中，01-24为未携带tms5基因和携带杂合tms5基因的24个可育单株，为可育材料，tms51/PvuI扩增产物可以被酶切，酶切后电泳谱带为142bp，可育单株表现为花粉可育(图2A、图2B)；25-46为携带纯合tms5基因的23个不育单株表现为花粉败育(图2A、图2C)，tms51/PvuI扩增产物不能被酶切，谱带为165bp，因此dtms51/PvuI特异性功能标记可以育种群体中有效识别携带tms5基因的温敏核不育系，可以在分子标记辅助选择育种中广泛应用。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
Claims (5)
1.一组水稻温敏核不育基因tms5的功能特异性分子标记引物，其特征在于该功能特异性分子标记引物选自以下 3 组引物之一：
dtms51/PvuI 的上游引物序列为 5’- CATCGTGCTTCGTGCCAAAACGG-3’；
下游引物序列5’-TCGACGGTGAGGGGCGGCGCGATC -3’；
dtms52/BsiWI 的 上 游 引 物 序 列 为5’-CCCATCGTGCTTCGTGCCAAAAC-3’；
下游引物序列 5’- TCGACGGTGAGGGGCGGCGCGTAC-3’；
dtms53/Hpy99I 的 上 游 引 物 序 列 为5’-CGGCCCGGCCCATCGTGCTTCGT-3’；
下游引物序列 5’-TCGACGGTGAGGGGCGGCGCCGTC-3’。
2.一种采用权利要求 1所述的特异性标记引物检测水稻温敏核不育基因tms5 的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：提取待测水稻标本基因组 DNA 作为模板，利用 3 对引物中任意一对特异性标记引物对水稻样品 DNA 进行扩增，再对 PCR 产物用限制性内切酶进行酶切后电泳， PCR 产物源于正常可育的 TMS5 基因可以被酶切，而扩增产物源于高温不育的 tms5 基因不能被酶切，所以tms51/PvuI扩增产物酶切后电泳谱带为可育材料142bp，携有 tms5 基因的温敏核不育系谱带165bp；dtms52/BsiWI 扩增产物酶切后电泳谱带为可育材料 147bp，携有 tms5基因的温敏核不育系 167bp；dtms53/Hpy99I 扩增产物酶切后电泳谱带为可育材料 150bp，携有 tms5 基因的温敏核不育系 169bp；杂交稻水稻材料则会扩增出不育和可育的两条谱带。
3.根据权利要求 2 所述的方法，其特征在于：所述的特异性标记引物的 PCR扩增采用如下体系：pH 8.8 的 Tris-HCl 33.5 mM，(NH4)2SO4 8.0 mM，MgCl2 1.5 mM，TWEEN-200.05%，dNTPs 0.2 mM，上、下游引物各 3.3 ng/µl，Taq DNA聚合酶2.0单位，模版DNA 50ng。
4.根据权利要求 2 所述的方法，其特征在于：PCR 反应条件具体参数为：94℃ 2 分钟；94℃ 45 秒、63℃45 秒、72℃ 1 分钟，30 个循环；72℃ 8分钟。
5.根据权利要求 2 所述的方法，其特征在于：特异性标记引物的 PCR 产物的酶切反应条件为：反应体系为 10µl 的 PCR 产物，3.0 单位的内切酶，1.5µl的10×Buffer，加ddH2O 至 15µl，反应条件：PvuI 和 Hpy99I 限制性内切酶 37℃，3 小时；BsiWI 为 55℃，3 小时。
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