CN103160583A - 一种水稻温敏雄性核不育基因RNaseZ分型的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻温敏雄性核不育基因RNaseZ分型的方法，包括：提取水稻样品DNA；根据RNaseZ基因的第70～71位核苷酸的多态性，设计引物，进行PCR扩增；对PCR扩增产物进行特性分析，确定水稻样品的基因型；其中，RNaseZ基因的核苷酸序列如SEQ NO.1所示。本发明水稻温敏雄性核不育基因分型的方法简单，有效，准确率高，且成本低廉。本发明确定了水稻RNaseZ基因控制水稻的温敏雄性不育性状，为水稻的温敏雄性不育基因，并针对该温敏不育基因RNaseZ的序列特点，开发了功能性的分子标记。

Description

一种水稻温敏雄性核不育基因RNaseZ分型的方法

技术领域

本发明属于农业生物工程技术领域，尤其涉及一种水稻温敏雄性核不育基因RNaseZ分型的方法。

背景技术

植物雄性不育特性可由细胞质基因引起，称细胞质雄性不育（CMS），也可因核基因突变引起，又名核基因雄性不育（GMS）。水稻是自花授粉作物，其杂种优势利用必须依赖于雄性不育性。在杂交水稻研究和应用之初，使用的雄性不育系都是CMS类型。1973年石明松在湖北晚粳稻品种农垦58群体中发现了自发突变的光周期敏感雄性不育（photoperiod-sensitive genic male sterile，PGMS）株，后来定名为农垦58S（石明松,中国农业科学,1985,2:44-48），开启了利用光温敏雄性不育特性培育两系法杂交水稻的序幕。

经过几十年的研究，两系不育系根据其对光照长度和温度的敏感性可分为光敏不育(PGMS)、温敏不育（temperature-sensitive genic male sterility,TGMS)和光温敏核不育(P/TGMS)三类(程式华,中国农业科学,1996,29(4):11-16)。PGMS水稻具有长日照条件下抽穗雄性不育，短日照条件下抽穗雄性可育的基本特征，如农垦58S及其衍生的部分不育系。TGMS水稻在高温条件下抽穗雄性不育，低温条件下抽穗雄性部分可育，如安农S-1（邓华凤等,杂交水稻,1999,14(3):1-3），广占63S（杨振玉等,杂交水稻,2002,17(4):4-6），株1S（杨远柱等,杂交水稻,2000,15(2):6-9）等。PGMS和TGMS共同构成了目前生产上大面积应用的两系法杂交稻不育系基因的主要来源。有的水稻则对光照和温度都有一定的敏感性，在长日照、高温下抽穗表现不育，短日照、低温下表现部分可育，如培矮64S（罗孝和等,杂交水稻,1992,(1):27-29）。

系谱分析表明大多早期商业化应用的P/TGMS系主要有3个起源：农垦58S，安农S-1和株1S（斯华敏等,作物学报,2012,38(3):394-407）。在农垦58S衍生的后代中有些保持了光敏特性如玉兔S（赵海军等,中国水稻科学,2004,18(6):515-521），而有些则表现为温敏特性如广占63S（杨振玉等,杂交水稻,2002,17(4):4-6）。大量遗传分析表明，PGMS和TGMS都受单隐性基因控制，如安农S-1（Yang et al.Planta,2007,225:321-330），株1S（杨远柱等,中国稻米,2007,(6):17-22）。

为精细定位并最终克隆TGMS，许多研究者针对不同的温敏不育材料已经做了不少工作。安农S-1是很多目前在生产上应用的水稻TGMS不育系的不育基因（tms5）的供体，Yang等(Yang et al,2007)已将tms5定位在染色体2上一个19kb的区域，在其5’和3’端分别由STS标记4039-1和4039-2界定，并认为其候选基因是NAC家族的一个成员（Yang et al.Planta，2007,225:321-330）。Peng等（Peng et al,2010）将温敏不育系籼S的不育基因同样也定位于第2号染色体上，介于2个SSR标记RMAN81和RMX21之间183kb的与安农S-1定位区间相近的区域，但认为有着不同于安农S-1的候选基因（Peng et al.Theor Appl Genet,2010,120:1013-1020）。

除上述提及的两系水稻不育系外，不同研究所还报道了不少独立发现的P/TGMS不育水稻材料，有的已经育成商用不育系在两系杂交水稻生产中应用，如琼香1S（郭国强等,杂交水稻,2009,24(1):399-400），绵9S（王志等,西南农业学报,1999,12(4):11-14），雁农S（阳花秋等,杂交水稻,1996(1):9-10）等，但均未见有与这些不育基因相连锁的分子标记的公开报道。

在水稻两系不育系选育中，通常需要在田间自然条件下鉴定不育单株。但是，光温条件在各地及同一地点的不同季节存在很大差异，这对两系不育系的选育十分不利。如：（1）海南是我国水稻冬、春季节水稻加代繁育的重要场所，在3月前抽穗时，由于气温相对也较低，因此多数TGMS水稻也表现可育。因此，在海南TGMS基本不能表达，从而制约了两系不育系的选育。（2）在长江流域及北方水稻区，TGMS水稻在正常水稻生产季节都表现为不育，一旦选到不育株，需要在割茬再生后才有可能结实；由于后期气温一般较高，即使再生分蘖也往往高度不育，很难使收获种子，因此需要将稻桩带海南、让其再生分蘖才能获得种子，不但费时费力，而且严重制约可选择群体的大小。

利用分子标记辅助选择是目前作物育种中的一种先进育种方法。对TGMS这样的性状，基于如上所说的原因，利用分子标记辅助选择育种尤为重要。因为，即使生长环境无法使其TGMS特性得以展现，利用分子标记仍然可以确定其基因型。此外，一旦确定其基因型，还可以通过调节播期有意让其在可育环境下开花结实，避免需要采用割茬再生、冷水灌溉等费力但效果欠佳的方法。但是，可能是由于没有特别适宜的分子标记，迄今尚未见基于分子标记辅助选择TGMS水稻的报道。同时，由于尚无TGMS基因特异性分子标记，迄今尚未能将TGMS基因像其他基因一样如抗稻瘟病基因（董巍等,分子植物育种,2010,8(5):853-860）和白叶枯病抗性基因（兰艳荣等,中国水稻科学,2011,25(2):169-174）聚合在一个不育系中，提高不育系对环境的稳定性。

目前用于辅助选择育种的分子标记主要有微卫星标记（SSR标记），INDEL标记，RFLP标记，RAPD标记，AFLP标记，STS标记和基于PCR扩增的限制性酶切的CAPS或dCAPS标记（冯建成,中国农学通报,2006,22(2):43-47）。最近，利用有序列变化的扩增子之间微弱的Tm值差异，通过DNA片段溶解曲线的差异进行突变检测的原理，还发展起来区分SNP的HRM分析方法（Reed et al.Pharmacogenomics,2007,8:597-608），以及基于DNA分子杂交的SNP芯片技术。

与其他性状一样，在控制每个性状的基因被克隆之前，可以获得与目标性状基因无限接近、在不同品种之间具有多态性的分子标记。传统利用与温敏不育紧密连锁的4039-1和4039-2（Yang et al.Planta,2007,225:321-330）以及RMAN81和RMX21（Peng et al.Theor Appl Genet,2010,120:1013-1020）开发了大量的分子标记，这些分子标记的多态性只与研究的表型存在连锁关系，在生物学上不存在因果关系，并不是功能性分子标记。在这些分子标记的实际应用中，首先要确定在研究的不育系和野生型材料之间是否存在多样性，只有在存在多样性的前提下，才能进一步用分子标记辅助选择等。在很多情况下，特别是品种之间杂交时往往不存在多态性；同时，即使存在多态性，由于只是连锁关系，减数分裂时的基因重组，也会打破这种连锁关系，从而影响选择效果。

功能性分子标记是指根据在基因水平上决定某一性状差异的核苷酸序列而开发的分子标记，其特征是用该分子标记表示的不同等位基因直接代表一种表型性状，分子标记与性状之间不像其他分子标记只是连锁关系（连锁关系意味着分子标记与性状之间存在多种可能的相斥或相向关系；同时，在育种过程中这种连锁关系可能被打破）。迄今，尚无公开报道开发出了水稻TGMS基因的功能性分子标记。

发明内容

本发明公开了一种水稻温敏雄性核不育基因RNaseZ分型的方法，通用性广，简单有效，准确率高且成本低廉。

一种水稻温敏雄性核不育基因RNaseZ分型的方法，包括：

（1）提取水稻样品DNA；

（2）根据RNaseZ基因的第70～71位核苷酸的多态性，设计引物，进行PCR扩增；

（3）对PCR扩增产物进行特性分析，确定水稻样品的基因型。

其中，RNaseZ基因的核苷酸序列如SEQ NO.1所示。

温敏雄性不育水稻的RNaseZ基因第70～71位核苷酸为⁺⁷⁰TA，而正常可育的水稻或光敏不育水稻在该位点为⁺⁷⁰TC或⁺⁷⁰GC，因此可针对包含该位点的核苷酸多态性，对水稻样品进行基因分型。

所述的水稻样品可以为籼稻、粳稻或非洲栽培稻，也可以为不同类型水稻杂交产生的非典型的籼稻、粳稻、非洲栽培稻等。

按品种划分，所述的水稻样品可以为水稻常规品种、杂交品种、育种中间材料等，当然，所述水稻样品也可以为采用杂交以外的方法得到的新品系。

提取水稻DNA时，可以采用水稻的种子、叶片、根、花器等组织。对水稻DNA的提取方法也没有特殊要求，可以为CTAB法、SDS提取法、ROSE一管法、TPS提取法等，也可以直接采用商用试剂盒进行DNA的提取。

所述特性分析为高分辨率溶解曲线分析或扩增产物酶切片段多态性分析。

若进行高分辨率溶解曲线分析，步骤（2）中，所述引物的碱基序列为：

上游引物RNZ-F3：5’-ATGGCGAACAGCGGCAAGTCA-3’；

下游引物RNZ-R1：5’-TGAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG-3’。

步骤（2）中，所述PCR扩增的体系为：2×PCR Master Mix，5μL；10μM的上游引物RNZ-F3，0.2μL；10μM的下游引物RNZ-R1，0.2μL；10×LC green-Plus，1μL；25ng/μL的DNA，1μL；无菌水2.6μL；矿物油10-20μL。

所述PCR扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50-60℃退火30s，72℃延伸30s，共35-40个循环；72℃延伸7min。

若进行扩增产物酶切片段多态性分析，步骤（2）中，所述引物为两对，其中，

第一对引物的碱基序列为：

上游引物RNZ-F1：5’-ACCGCGCCGCCACCGGGTCGGCCGGAG-3’；

下游引物RNZ-R1：5’-TGAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG-3’；

第二对引物的碱基序列为：

上游引物RNZ-F2：5’-ACCGCGCCGCCACCGGGTCGGCCCAAG-3’；

下游引物RNZ-R1：5’-TGAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG-3’。

步骤（2）中，所述PCR扩增的体系为：2×PCR Master Mix，10μL；10μM的上游引物，0.4μL；10μM的下游引物，0.4μL；25ng/μL的DNA，1μL；补充无菌水至20μL。

所述PCR扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50-60℃退火30s，72℃延伸30s，共35-40个循环；72℃延伸7min。

进行扩增产物酶切片段多态性分析时，第一对引物的扩增产物采用Hinf I进行酶切，第二对引物的扩增产物采用Sty I进行酶切。

酶切的反应体系为：10×H Buffer，1μL；0.1%BSA，1μL；限制性内切酶，0.3μL；PCR扩增产物，2μL；无菌水补足至10μL。

酶切的反应条件为：37℃水浴4-12h。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

（1）本发明水稻温敏雄性核不育基因RNaseZ分型的方法简单，有效，准确率高，且成本低廉。

（2）本发明确定了水稻RNaseZ基因控制水稻的温敏雄性不育性状，为水稻的温敏雄性不育基因，并针对该温敏不育基因RNaseZ的序列特点，开发了分子标记。

本发明开发的分子标记是根据造成水稻温敏雄性不育性状变异的遗传基础，即在确定造成水稻温敏雄性不育生物学机制的基础上发展起来的，因此属于功能性分子标记。这样，本发明开发的分子标记在育种中不但适用于任何组合，而且也不会因遗传重组而发生变化，具有通用性和广适性。

（3）HRM分子标记易于高通量操作。采用HRM分子标记时，由于在PCR结束后，扩增产物可以在仪器上如LightScanner上直接分型，因此较其他类型的分子标记更加适用于高通量分析。

（4）利用本发明的方法辅助育种，方便、准确，节约成本，能大大提高品种选择效率，加快温敏不育水稻品种育种进程，而且可以避免环境因素对于表型的影响。

附图说明

图1为温敏不育候选基因RNaseZ结构及dCAPS分子标记引物设计示意图；

其中，黑色方框代表外显子，直线代表内含子；温敏不育突变位点用白色三角标出；箭头代表所设计的分子标记引物位置；并在图下方方框中列出了所修改的碱基位置和类型，以及所形成的限制性内切酶的识别位点；

图2a为dCAPS分子标记（引物为RNZ-F1/RNZ-R1）对株1S和08EZ01两个亲本及其F₂代中不育单株进行检测的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

其中，M为DNA分子量标准；泳道1为株1S；泳道2为08EZ01；泳道3为F₁；泳道4-27为F₂代不育单株；

图2b为是dCAPS分子标记（引物为RNZ-F1/RNZ-R1）对株1S和08EZ01两个亲本及其F₂代中可育单株进行检测的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

其中，M为DNA分子量标准；泳道1为株1S；泳道2为08EZ01；泳道3为F₁；泳道4-30为F₂代可育单株；

图3a为dCAPS分子标记（引物为RNZ-F2/RNZ-R1）对Y58S和Z10两个亲本及其F₂代中不育单株进行检测的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

其中，M为DNA分子量标准；泳道1为Y58S；泳道2为Z10；泳道3为F₁；泳道4-36为F₂代不育单株；

图3b为dCAPS分子标记（引物为RNZ-F2/RNZ-R1）对Y58S和Z10两个亲本及其F₂中可育单株进行检测的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

其中，M为DNA分子量标准；泳道1为Y58S；泳道2为Z10；泳道3为F₁；泳道4-23为F₂代可育单株；

图4a为水稻温敏不育基因RNaseZ的HRM分子标记中不同基因型随温度变化的溶解曲线图；

其中，沿着箭头方向，曲线依次代表的基因型为TC、TA、TA/TC、TA/GC和GC；

图4b为HRM分子标记对温敏不育候选基因位点不同基因型进行分型的峰图；

图5a为利用dCAPS分子标记（Hinf I酶切）检测不同类型的光温敏不育系的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

图5b为利用dCAPS分子标记（Sty I酶切）检测不同类型的光温敏不育系的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

其中，图5a-图5b中，M为DNA分子量标准；前6个泳道为酶切前的PCR产物对照；泳道1为株1S；泳道2为08EZ01；泳道3为日本晴；泳道4为株1S和08EZ01的混合；泳道5为株1S和日本晴的混合；泳道6为08EZ01和日本晴的混合；泳道7-25分别为GS138；广占63S；Y58S；广湘24S；N422S/R8272(F₁)；双8S/0293(F₁)；W6154S；龙S；Z9S；海丰1S；1892S；桂科-1S；桂科-2S；X07S；雁农S；GS2011-20；安7S-III；绵9S；943S。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释。

实施例1水稻温敏不育功能性分子标记的开发

于2011年，构建温敏不育系株1S和野生型08EZ01的杂交F₂后代群体，并于田间调查分离比，结果发现在1260个F₂单株中有286株完全不育单株，表型分离比符合3：1，说明温敏性状为单隐性基因控制。

在开花期镜检观察取样完全不育的单株549株，用于定位控制株1S温敏不育性状的基因，并构建基因池，利用348对均匀分布于各条染色体上的SSR标记进行初步定位，将温敏不育基因定位于第2号染色体上。之后在该条染色体上发展更多的标记，并利用这549株完全不育的单株进行更加精细的定位，最后将该基因定位于第2号染色体RM12721和RM12735之间。

在定位区间内寻找有可能的候选基因，测序发现位于第2染色体上的RNaseZ（RNZ）水稻同源基因RNZ（LOC_Os02g12290）在不育系和野生型品种中存在差异，温敏不育品种在该基因第1外显子中存在的一个提前终止的突变⁺⁷⁰TAG，并且该突变与水稻温敏雄性不育（TGMS）性状完全一致，所有检测的TGMS水稻在该位点均为⁺⁷⁰TAG，而正常可育的水稻品种或光敏不育水稻在此位点上要么为⁺⁷⁰TCG，要么为⁺⁷⁰GCG。据此，我们认为该基因为控制温敏不育的基因，并开发了一组特异性区别上述变异的分子标记。

以下将上述三种RNZ等位基因分别记为RNZ^TA，RNZ^TC和RNA^GC。

1、水稻温敏不育功能性dCAPS(扩增产物酶切片段多态性)分子标记的开发

（1）区分RNZ^TA和RNZ^TC等位基因的功能性dCAPS分子标记

在Gramene网站（http://www.gramene.org/）下载LOC_Os02g12290的核苷酸序列（如SEQ NO.1），并利用Primer Premier5.0软件在⁺⁷⁰TAG区域附近设计PCR引物，碱基序列为：

上游引物（RNZ-F1）：

5’-ACCGCGCCGCCACCGGGTCGGCCGGAG-3’；

下游引物（RNZ-R1）：

5’-TGAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG-3’；

由于突变位点处没有任何限制性酶切位点可用，因此在引物RNZ-F1的3’末端引入了一个错配碱基从而形成一个限制性内切酶Hinf I的识别位点（如图1）。

在引入这一错配碱基后扩增的PCR产物，等位基因RNZ^TA不能被HinfI酶切，等位基因RNZ^TC含有Hinf I的识别位点，可以被Hinf I酶切成153bp和25bp二段，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，携带不同等位基因的水稻材料可以容易地加以区分，扩增片段经Hinf I酶切后，只携带RNZ^TA等位基因的纯合材料只显示178bp的条带；而只携带RNZ^TC等位基因的纯合材料显示153bp和25bp的条带；而同时携带RNZ^TA和RNZ^TC等位基因的杂合材料显示178bp、153bp和25bp三个条带（如图2a、图2b）。该dCAPS分子标记能将只携带RNZ^TA等位基因的纯合温敏材料和只携带RNZ^TC等位基因的纯合野生型材料以及携带2种等位基因的杂合（但雄性可育）材料加以区分。

（2）区分RNZ^TA和RNZ^GC等位基因的功能性dCAPS标记

采用相似的原理利用Primer Premier5.0软件在⁺⁷⁰TAG区域附近设计PCR引物，碱基序列为：

上游引物（RNZ-F2）：

5’-ACCGCGCCGCCACCGGGTCGGCCCAAG-3’；

下游引物（RNZ-R1）：

5’-TGAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG-3’；

引物RNZ-F2是根据突变位点设计的，同样由于突变位点处没有任何限制性酶切位点可用，因此在引物RNZ-F2的3’末端引入一个错配碱基从而形成一个限制性内切酶Sty I的识别位点（如图1）。

在引入这一错配碱基后扩增的PCR产物，等位基因RNZ^TA不能被Sty I酶切，而等位基因RNZ^GC含有Sty I的识别位点，可以被Sty I酶切成155bp和23bp二段，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，携带不同等位基因的水稻材料可以容易地加以区分，扩增片段经Sty I酶切后，只携带等位基因RNZ^TA的纯合材料只显示178bp的条带；而野生型可育等位基因RNZ^GC的纯合材料只显示155bp和23bp的条带；而同时携带两种等位基因的杂合材料显示178bp、155bp和23bp三个条带（如图3a、图3b）。因此，该dCAPS标记能将携带RNZ^TA等位基因的纯合温敏材料和只携带RNZ^GC等位基因的纯合野生型材料以及携带2种等位基因的杂合（但雄性可育）材料加以区分。

2、水稻温敏不育功能性HRM(高分辨率溶解曲线)分子标记的开发

采用相似的原理利用Primer Premier5.0软件在⁺⁷⁰TAG区域附近设计HRM引物，碱基序列为：

上游引物（RNZ-F3）：5’-ATGGCGAACAGCGGCAAGTCA-3’；

下游引物（RNZ-R1）：5’-TGAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG-3’；

引物位置如图1所示，根据HRM分析要求进行PCR扩增，将扩增产物在HRM分析仪（如LightScanner）分析，可以直观地将等位基因RNZTA与其他两种等位基因加以区别。

如图4a、图4b所示，不同基因型的溶解曲线在93～96℃区段释放的荧光信号明显不同，荧光染料特异的与DNA双链结合，随溶解温度的上升，与DNA双链相结合的荧光信号强度相对变化。由于，不同类型的基因型所形成的PCR产物有着不同的Tm值，有不同的荧光随温度上升的变化值，根据高分辨率溶解曲线基因分型的原理，如果两条曲线的ΔF值（相对荧光强度）大于0.05，则可以认为二者属于不同的基因型。如图4b所示，以只携带等位基因RNZ^TA的纯合温敏材料为基准线，只携带RNZ^TC等位基因的纯合野生型材料，只携带等位基因RNZ^GC的纯合野生型材料，携带RNZ^TA和RNZ^TC两种等位基因的杂合（但雄性可育）材料以及携带RNZ^TA和RNZ^GC2种等位基因的杂合（但雄性可育）材料，这五种基因型都能够被明显的相互区分开。

因此，可以将上述已知基因型的溶解曲线作为对照，将待检测水稻材料的溶解曲线与对照进行对比，如果两条曲线的ΔF值小于0.05，则认为基因型相同，由此确定待检测水稻材料的基因型。

实施例2利用dCAPS分子标记区分双亲基因型为RNZ^TA和RNZ^TC的杂交后代植株

利用温敏不育材料株1S和可育材料08EZ01配制其杂交组合F₂代，其中经测序验证，株1S和08EZ01在温敏不育候选基因突变位点基因型分别为RNZ^TA和RNZ^TC，因此针对该亲本所配制杂交后代作为试验材料，这些试验材料于2012年夏季种植于浙江大学实验农场，自田间开花期观察并镜检花粉育性，共取549株表现为完全不育的单株和27株可育单株。另外，采集这些试验材料的叶片，利用dCAPS分子标记对RNZ基因进行检测。

1、水稻基因组DNA的提取

（1）将水稻叶片剪碎后置于2.0mL离心管中，同时放入一粒钢珠，用组织碾磨仪磨碎；

（2）加入800μL CTAB提取缓冲液(Tris-HCl，100mM，pH8.0；EDTA，20mM，pH8.0；NaCl，500mM；CTAB，2%)，65℃水浴40min，期间摇动3-4次；

（3）加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1，v/v)混合液，上下颠倒混匀，10000r/min离心10min；

（4）转移上清至新的1.5mL离心管中，加入等体积-20℃预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，置-20℃下沉淀30min，10000r/min离心10min；

（5）弃上清液，70%乙醇洗涤1次，10000rpm离心10min；

（6）弃上清液，无水乙醇洗涤1次，自然风干，溶于适量(100-200μL)TE溶液中，-20℃保存。

2、包含突变位点DNA片段的PCR扩增、酶切和分析

以提取的水稻DNA为模板，采用实施例1中设计的特异性引物RNZ-F1和RNZ-R1，进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系见表1。

表1用于dCAPS分子标记的PCR反应体系

成分	体积（μL）
		2×PCR Master Mix	10
RNZ-F1(10μM）	0.4
		RNZ-R1(10μM）	0.4
DNA（25ng/μL）	1
		无菌水	8.2
总计	20

PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50-60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸7min。

用限制性内切酶Hinf I对PCR扩增产物进行酶切，酶切反应结束后，用8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳125min后，染色后拍照成像。

酶切反应体系为：10×H Buffer1μL，0.1%BSA1μL，限制性内切酶0.5μL，PCR扩增产物2μL，无菌水补足至10μL；

酶切反应条件为：37℃水浴4h或过夜反应。

产物经相应的酶切后，含温敏不育基因RNZ^TA的纯合不育材料均不能被这两种酶切开只产生178bp的条带；不含温敏不育基因RNZ^TA的纯合野生型材料则能被限制性内切酶Hinf I产生153bp和25bp的条带(短序列片段25bp因移动速度快已在凝胶之外)；含温敏不育基因RNZ^TA的杂合可育材料则能被Hinf I产生178bp、153bp和25bp的三条带(短序列片段25bp因移动速度快已在凝胶之外)。根据上述结果，可将待测水稻样品分为纯合温敏不育、杂合可育和纯合可育三种基因型。

采用本发明的dCAPS分子标记对RNZ基因进行检测。结果发现：549份表现完全不育的单株全部不能被Hinf I切开，表现为RNZ^TA基因纯合；27份可育单株中，21株表现为携带RNZ^TA的基因杂合；6份为野生型的RNZ^TC基因纯合（部分检测结果如图2a、图2b）。对表现含有RNZ^TA纯合基因的材料，在其生殖期于田间观察表现为花粉败育和不结实的不育特征，表明该分子标记检测结果是可靠的。

实施例3利用dCAPS分子标记区分双亲基因型为RNZ^TA和RNZ^GC的杂交后代植株

利用温敏不育材料Y58S和可育材料Z10配制其杂交组合F₂代，其中经测序验证，Y58S和Z10在温敏不育候选基因突变位点基因型分别为RNZ^TA和RNZ^GC，因此针对该亲本所配制杂交后代作为试验材料，这些材料于2012年夏季种植于浙江大学实验农场，自田间开花期观察并镜检花粉育性，共取203株表现为完全不育的单株和20株可育单株。另外，采集这些试验材料的叶片，利用dCAPS分子标记对RNZ基因进行检测。

1、水稻基因组DNA的提取

方法同实施例2中水稻基因组DNA的提取。

2、包含突变位点DNA片段的PCR扩增、酶切和分析

包含突变位点DNA片段的PCR扩增、酶切方法同实施例2，除了PCR扩增引物替换为RNZ-F2和RNZ-R1，限制性内切酶替换为Sty I。

产物经相应的酶切后，含温敏不育候选基因RNZ的纯合不育材料（即RNZ^TA纯合）均不能被这两种酶切开只产生178bp的条带；不含温敏不育候选基因RNZ的纯合野生型材料（即RNZ^GC纯合）则能被限制性内切酶Sty I完全切开，产生155bp和23bp的条带(短序列片段23bp因移动速度快已在凝胶之外)；含温敏不育候选基因RNZ的杂合可育材料（即含有RNZ^TA和RNZ^GC等位基因）则能被Sty I不完全切开从而产生178bp、155bp和23bp的三条带(短序列片段23bp因移动速度快已在凝胶之外)。根据上述结果，可将待测水稻样品分为纯合温敏不育、杂合可育和纯合可育三种基因型。

采用本发明的dCAPS分子标记对RNZ基因进行检测。结果发现：203份表现完全不育的单株全部不能被Sty I切开，表现为RNZ^TA基因纯合；20份可育单株中，14株表现为杂合基因型；6份为野生型RNZ^GC等位基因（部分检测结果如图3a、图3b）。对表现含有温敏不育RNZ^TA纯合基因的材料，在其生殖期于田间观察表现为花粉败育和不结实的不育特征，表明该分子标记检测结果是可靠的。

实施例4利用dCAPS分子标记区分温敏不育和非温敏不育品种

2012年收集不同的水稻材料，包括纯合的温敏不育系和含温敏不育基因的杂合型材料以及非温敏不育的材料。这些材料于2012年夏季种植于浙江大学实验农场，自田间处于营养生长期的植株取叶片备用。

1、水稻基因组DNA的提取

方法同实施例2中水稻基因组DNA的提取。

2、包含突变位点DNA片段的PCR扩增、酶切和分析

以水稻DNA为模板，采用实施例1设计的引物组合RNZ-F1/RNZ-R1和RNZ-F2/RNZ-R1分别进行PCR扩增，除替换相应成分，PCR扩增体系和反应条件同实施例2。

以RNZ-F1/RNZ-R1为引物得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶Hinf I进行酶切；

以RNZ-F2/RNZ-R1为引物得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶StyI进行酶切；

除替换相应成分，酶切体系和酶切的反应条件同实施例2。

酶切反应结束后，用8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳125min后，染色后拍照成像。

产物经相应的酶切后，含温敏不育基因RNZ^TA的纯合不育材料均不能被这两种酶切开只产生178bp的条带；不含温敏不育基因RNZ^TA的纯合野生型材料则能被限制性内切酶Hinf I或Sty I完全切开，产生153bp和25bp，或者155bp和23bp的条带；含温敏不育基因RNZ^TA的杂合可育材料则能被Hinf I或Sty I不完全切开从而产生178bp，153bp和25bp或178bp，155bp和23bp的三条带。根据上述结果，可将待测水稻样品分为纯合温敏不育、杂合可育和纯合可育三种基因型。

观察时，注意由于短序列片段23bp或25bp因移动速度快已在凝胶之外，所以观测不到。

采用本发明的dCAPS分子标记对RNZ基因进行检测。共分析了454份水稻材料包括214份美国微核心种质（USDA minicore rice collection,Agrama et al.Crop science,2009,49:1336-1346;Li et al.Genetica,2010,138:1221-1230），234份中国生产上使用的杂交品种以及光温敏不育系和6份常规品种，结果发现：在31份两系不育系中有25份携带RNZ^TA等位基因；在203份两系法杂交水稻中148份带RNZ^TA等位基因；在6份常规水稻品种以及214份美国微核心种质中均未发现RNZ^TA等位基因（如表2、表3）。部分材料的酶切凝胶电泳结果见图5a、图5b。

表2

表3

完全切开：√；切不开：x。

实施例5利用HRM分子标记区分温敏不育和非温敏不育品种

1、水稻基因组DNA的提取

同实施例2中水稻基因组DNA的提取。

2、PCR扩增

以水稻DNA为模板，采用实施例1设计的引物RNZ-F3和RNZ-R1为引物，进行PCR扩增。

用于发展HRM标记时，PCR扩增一般在10μl体积中进行，反应液除包括PCR buffer，MgCl₂，dNTP，Taq DNA聚合酶，正反向引物，水稻样品总DNA，无菌水等常规成分外，还需要在PCR之前加饱和荧光染料（如LC Green），并用矿物油（Sigma）覆盖反应混合物，另外，为避免影响PCR扩增，也可以在得到扩增产物之后再加饱和荧光染料，PCR的反应体系具体参见表4。

PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50-60℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环；72℃延伸7min。

将PCR扩增的产物直接在HRM分析仪（LightScanner）上进行分析，获取温度为93～96℃区段溶解曲线。

表4用于HRM分子标记的PCR反应体系

成分	体积（μL）
		2×PCR Master Mix	5
RNZ-F3(10μM）	0.2
		RNZ-R1(10μM）	0.2
DNA（25ng/μL）	1
		无菌水	2.6
10×LC green-Plus	1
		矿物油	10-20

由于纯合温敏不育类型RNZ^TA，纯合可育类型RNZ^TC，纯合可育类型RNZ^GC以及杂合可育类型均可以明显的分开，因此，试验时，以已知基因型扩增产物的溶解曲线作为对照，将待检测水稻材料的溶解曲线与对照进行对比，如果两条曲线的ΔF值小于0.05，则认为基因型相同，由此确定待检测水稻材料的基因型。

对实施例4的所有材料，采用本发明的HRM分子标记对RNZ基因进行检测。共分析了454份水稻材料包括214份美国微核心种质（USDAminicore rice collection,Agrama et al.Crop science,2009,49:1336-1346;Liet al.Genetica,2010,138:1221-1230），234份中国生产上使用的杂交品种以及光温敏不育系和6份常规品种，结果发现：在31份两系不育系中有25份携带RNZ^TA等位基因；在203份两系法杂交水稻中148份带RNZ^TA等位基因；在6份常规水稻品种以及214份美国微核心种质中均未发现RNZ^TA等位基因，得到的结果与dCAPS分子标记完全一致，表明本发明的HRM分子标记同样有效。

Claims (9)

1.一种水稻温敏雄性核不育基因RNaseZ分型的方法，包括：

（1）提取水稻样品DNA；

（2）根据RNaseZ基因的第70～71位核苷酸的多态性，设计引物，进行PCR扩增；

（3）对PCR扩增产物进行特性分析，确定水稻样品的基因型。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特性分析为高分辨率溶解曲线分析或扩增产物酶切片段多态性分析。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，若进行高分辨率溶解曲线分析，步骤（2）中，所述引物的碱基序列为：

上游引物RNZ-F3：5’-ATGGCGAACAGCGGCAAGTCA-3’；

下游引物RNZ-R1：5’-TGAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG-3’。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述PCR扩增的体系为：2×PCR Master Mix，5μL；10μM的上游引物RNZ-F3，0.2μL；10μM的下游引物RNZ-R1，0.2μL；10×LC green-Plus，1μL；25ng/μL的DNA，1μL；无菌水2.6μL；矿物油10-20μL。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50-60℃退火30s，72℃延伸30s，共35-40个循环；72℃延伸7min。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，若进行扩增产物酶切片段多态性分析，步骤（2）中，所述引物为两对，其中，

第一对引物的碱基序列为：

上游引物RNZ-F1：5’-ACCGCGCCGCCACCGGGTCGGCCGGAG-3’；

下游引物RNZ-R1：5’-TGAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG-3’；

第二对引物的碱基序列为：

上游引物RNZ-F2：5’-ACCGCGCCGCCACCGGGTCGGCCCAAG-3’；

下游引物RNZ-R1：5’-TGAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG-3’。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述PCR扩增的体系为：2×PCR Master Mix，10μL；10μM的上游引物，0.4μL；10μM的下游引物，0.4μL；25ng/μL的DNA，1μL；补充无菌水至20μL。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50-60℃退火30s，72℃延伸30s，共35-40个循环；72℃延伸7min。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，第一对引物的扩增产物采用Hinf I进行酶切，第二对引物的扩增产物采用Sty I进行酶切。

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