CN108950051B

CN108950051B - 一种Ogura CMS萝卜保持系快速选育与创制方法

Info

Publication number: CN108950051B
Application number: CN201810936742.3A
Authority: CN
Inventors: 李晓梅; 杨峰; 冉茂林; 雍晓平; 冉科
Original assignee: Chengdu Pidu District Bureau Of Agriculture Rural Areas And Forestry; RICE AND SORGHUM INSTITUTE SICHUAN ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: Chengdu Pidu District Bureau Of Agriculture Rural Areas And Forestry; RICE AND SORGHUM INSTITUTE SICHUAN ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2018-08-16
Filing date: 2018-08-16
Publication date: 2021-10-08
Anticipated expiration: 2038-08-16
Also published as: CN108950051A

Abstract

本发明提供了一种Type A型Ogura CMS萝卜保持系的快速选育与创制方法。本发明根据萝卜Ogura‑CMS育性恢复基因Rfo/rfo序列具有HindⅢ酶切位点差异，设计了一种相比SspI限制性内切酶更经济实惠且酶切效率更高的分子标记技术，其完全匹配于Type A类型Ogura CMS萝卜保持系的选育与创制。该方法分子标记的准确性高，与田间育性验证结果达到100％吻合，且其酶切效率高、使用成本降低；相比传统选育方法节约了时间2‑3年，同时减少了大量的人工杂交及育性鉴定工作，显著提高了萝卜不育系、保持系的选育效率，实现了Type A型Ogura CMS萝卜保持系的快速选育与创制。

Description

一种Ogura CMS萝卜保持系快速选育与创制方法

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，涉及分子标记辅助作物育种技术，具体涉及一种分子标记辅助Type A型Ogura CMS萝卜保持系的快速选育与创制方法。

背景技术

萝卜(Raphanussativus L.)为十字花科萝卜属，是一种重要的根菜类蔬菜作物，不仅营养丰富，而且富含硫代葡萄糖苷和异硫氰酸脂等活性物质，具有较高的药用食疗价值，素有“小人参”的美誉，深受人们喜爱。我国是世界上萝卜生产第一大国，年平均种植面积在120万公顷以上。

萝卜为典型的异花授粉植物，自交衰退严重，其杂种优势明显。利用细胞质雄性不育系(cytoplasmic male sterility，CMS)及自交不亲和系(self-incompatibility，SI)进行杂交制种是当前萝卜杂种优势利用的两个主要途径。相比自交不亲和系制种，利用细胞质雄性不育系制种具有杂种一代纯度高、制种成本低、技术简单、亲本不易流失等优点。细胞质雄性不育是由细胞质基因和核基因共同作用的一种母性遗传，已被证实与线粒体基因有关，不育基因多为线粒体已知功能基因侧翼上的异常开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，在正常胞质线粒体基因组中并不存在，异常开放阅读框与侧翼功能基因共转录导致不育，这种不育性可由细胞核恢复基因(Restorer fertility，Rf)恢复育性。

利用细胞质雄性不育进行F1代杂交品种选育的一般原理是，具有不育细胞质(S)的个体S(rfrf)，其雄性器官不能产生正常功能的雄配子，而雌性可育，生产上可作为不育系；与具有正常可育细胞质的个体N(rfrf)杂交时，可产生全不育的后代，N(rfrf)可作为保持系；而与N(RfRf)或S(RfRf)基因型的单株杂交，后代全部为可育，N(RfRf)或S(RfRf)则可以作为恢复系。细胞质雄性不育系和保持系的杂交，繁殖不育系种子，不育系通过接受恢复系的花粉产生大量纯度高的F1代杂交种子。萝卜以营养器官为经济产品，仅需要不育系与父本系(恢复系或保持系)即可生产F1代杂交种。

萝卜细胞质雄性不育系的选育是萝卜杂种优势利用和配制杂交种的关键，而不育系的选育关键是优良保持系的选育。保持系的选育主要是寻找同时含有正常胞质(N)和核保持基因(rfrf)材料的过程。萝卜保持系选育的传统方法是大量选择综合性状优良的可育材料做父本分别与不育源测交，鉴定测交后代及自交后代育性，淘汰使测交后代全可育(说明含RfRf)或自交育性分离的材料(说明含S胞质)，对于测交后代出现育性分离(说明含Rfrf)或全不育(说明含rfrf)且自交育性不分离的材料(说明含N胞质)，作为轮回亲本，测交后代中的不育株做母本，进行6-7代连续回交，最终获得遗传背景相似的不育系和相应的保持系。传统选育方法需要进行多年大量的测交工作，且具有一定盲目性(常常在前期大量的回交工作完成后发现父本为S胞质不能用于保持系的筛选)，严重限制了萝卜新型不育系培育与优良新品种选育进程。因此，准确快速鉴定出候选保持系是成功培育优良细胞质雄性不育系的关键因素。

1968年，日本学者小仓首次发现萝卜细胞质雄性不育类型Ogura CMS，现今已有Kosena、NWB及DCGMS四个胞质类型被发现，其中Ogura CMS具有不育性彻底、稳定、育性易于恢复等优点，现已成功转入油菜、大白菜、甘蓝等作物中，是十字花科作物研究最深入、应用最广泛的胞质类型。大量研究表明，线粒体基因orf138是Ogura CMS胞质不育的主控因子，依据orf138核苷酸碱基位点的差异，可将Ogura CMS分为9个类型(Type A→I)，其中KosenaCMS被归为Type F型，中国萝卜主要为Type A及Type H类型。2003年，萝卜Ogura CMS的恢复基因(Rfo)获得成功克隆，证明该基因编码687个氨基酸，是PPR基因家族的一个成员，含有16个重复的PPR基元序列。Ogura CMS不育系和保持系中含有恢复基因Rfo的等位基因rfo，与其只有几个碱基差异。

萝卜Ogura CMS不育基因及恢复基因的成功克隆为不育系的分子标记辅助选择提供了理论支撑。日本研究者Yasumoto等(2008)根据Rfo/rfo间SspⅠ酶切位点的差异开发了PCR-RFLP分子标记应用于检测萝卜恢复基因在日本野生萝卜中的分布频率。在此基础之上，Sun等(2012)利用该分子标记与orf138胞质鉴定标记相结合进行萝卜Ogura CMS保持系(rfrf)、恢复系(RfRf)、及杂合材料(Rfrf)的筛选，能够提高Ogura CMS细胞质雄性不育系的选育效率，PCR-RFLP标记技术简单，一般育种单位可实施性强，但是存在SspI限制性内切酶价格较贵，使用成本高，酶切效率仍有待提高的缺点。王庆彪等(2017)利用萝卜Rfo/rfo等位基因间碱基位点差异开发了基于KASP(Kompetitive Allele Specific PCR，竞争性等位基因特异性PCR)分型技术的萝卜Rfo基因SNP分子标记应用于萝卜细胞质雄性不育系的转育，该标记相对于PCR-RFLP标记具有精度高、通量大的优点，但该方法需要借住精密仪器及特定平台软件进行分析，一般育种单位由于实验仪器及软件的缺乏难以实施。

另一方面，申请人在利用上述PCR-RFLP分子标记与orf138胞质鉴定标记进行Ogura CMS候选保持系分子标记筛选时发现部分分子标记鉴定结果与田间育性鉴定结果不一致，3个Type A型保持材料与Type H型Ogura CMS测交后代出现1：1的育性分离，说明TypeH型Ogura CMS含有另外的恢复基因。同时前人也有关于同一材料对Ogura CMS具有不同恢保关系的报道，并且在日本野生萝卜及中国萝卜中均发现了另外的恢复基因。因此，上述分子标记方法存在不能完全适用于进行所有类型Ogura CMS保持系的分子标记辅助选择的问题。

有鉴于此，针对于Type H型Ogura CMS萝卜存在另外的恢复基因，导致利用前人开发的分子标记进行Ogura CMS保持系分子标记筛选时会出现标记与实际测交鉴定结果不能达到100％准确的问题，如何开发针对特定类型Ogura CMS(如Type A型Ogura CMS)萝卜保持系的快速选育与创制的准确方法，以实现萝卜不育系的高效培育，并能够显著降低现有限制性内切酶SspI酶切方法的成本以及提高酶切效率的问题，成为亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的就是为了解决上述技术问题，而提供一种分子标记辅助Type A型Ogura CMS萝卜保持系的快速选育与创制方法。

本发明首先提供了一种分子标记辅助Type A型Ogura CMS萝卜保持系的快速选育与创制的引物对，所述引物对包括特异引物Ⅰ和特异引物Ⅱ，所述物异引物Ⅰ包含胞质不育基因orf138，用于对Type A型Ogura CMS萝卜进行鉴定，其正向引物orf138-F序列为：5’-AACGGGAAGTGACAATACC-3’，如SEQ ID NO.1所示，反向引物orf138-R序列为：5’-GTTGACCAACAAAAGCATG-3’，如SEQ ID NO.2所示；所述物异引物Ⅱ包含Rfo/rfo等位基因HindⅢ酶切差异位点，用于对Type A型Ogura CMS萝卜恢复基因Rfo/rfo进行分子标记快速筛选，从而实现其保持系的选育与创制工作，其正向引物Rf-F序列为：5’-ATCTCGTCCTTTACCTTCTGTG-3’，如SEQ IDNO.3所示，反向引物Rf-R序列为：5’-GATTCCTTTCTCTTGCATTTC-3’，如SEQ ID NO.4所示。

本发明提供的引物对，具有特异性高的特点，将其用于分子标记辅助Type A型Ogura CMS萝卜保持系的快速选育与创制工作具有很好的效果。特异引物Ⅰ只需通过测序比对，即可用于精准鉴定萝卜中的Type A型Ogura CMS不育材料，特异引物ⅡPCR产物借助常规的酶切处理即能实现对Type A型Ogura CMS萝卜恢复基因(Rfo/rfo)的快速筛选，显著提高该类型萝卜不育系、保持系的选育效率。所用的内切酶与SspⅠ酶相比具有显著的成本低和酶切效率高的优点。

本发明的目的之二是提供一种Type A型Ogura CMS萝卜保持系的快速选育与创制方法，所述方法包括以下步骤：

(1)采用如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的特异引物Ⅰ对萝卜不育材料DNA进行PCR扩增，扩增特异片段长度为544bp，测序对比筛选出Type A型Ogura CMS材料作为不育系转育的母本；

(2)提取萝卜优良自交系材料基因组DNA，以步骤(1)所述特异引物Ⅰ进行PCR扩增，选择不能扩增出544bp特异片段的优良自交系材料，采用如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的特异引物Ⅱ对该优良自交系材料DNA基因组进行PCR扩增，扩增特异片段长度为643bp，对扩增产物进行限制性内切酶HindⅢ-HF酶切，酶切产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳，筛选出酶切能产生3条带358bp、209bp和76bp的材料作为不育系选育的侯选保持材料；

(3)以现有待改良Type A型Ogura CMS保持系为母本，以优良自交系为父本，进行杂交获得F1代材料，然后F1代材料自交获得F2代材料，对F2代材料进行性状鉴定，筛选优良F2代材料，提取筛选的优良F2代材料基因组DNA，用步骤(2)所述方法进行恢复基因分子标记选择，即可快速从创制材料中筛选到候选保持材料；

(4)用步骤(2)所选候选保持材料为轮回亲本与步骤(1)所选Type A型Ogura CMS不育材料进行连续回交4-6代，同时轮回亲本自交，即可选育出优良Type A型Ogura CMS不育系与保持系；用步骤(3)所选候选保持材料为轮回亲本与步骤(1)所选Type A型OguraCMS不育材料进行连续回交4-6代，同时轮回亲本自交，即可实现Type A型Ogura CMS保持系的快速创制与不育系的改良。

进一步的是，上述方法中，特异引物Ⅰ的PCR扩增程序为：

1)94℃，4min；

2)94℃30s，56℃30s，72℃45s，35个循环；

3)72℃延伸10min。

进一步的是，步骤(1)中是对扩增出的特异片段PCR产物送样测序，根据Ogura CMS胞质分类依据比对测序结果，筛选出Type A型Ogura CMS材料作为不育系转育的母本。具体的Ogura CMS胞质分类依据可参考文献“Yamagishi H,Terachi T.2001.Intra-and inter-specific variations in the mitochondrial gene orf138 of Ogura-type male-sterile cytoplasm from Raphanus sativus and Raphaus raphanistrum.Thero ApplGenet,103:725-732.”。

进一步的是，特异引物Ⅱ的PCR扩增程序为：

1)94℃，4min；

2)94℃30s，55℃30s，72℃40s，35个循环；

3)72℃延伸10min。

进一步的是，步骤(2)中所述酶切采用25μL酶切体系，包括：5μL PCR产物，0.75μL内切酶HindⅢ-HF，酶浓度为20000U/ml，2.5μL 10*buffer，16.75μL ddH₂O，37℃水浴3h。

进一步的是，步骤(2)中采用特异引物Ⅰ能扩增出544bp特异片段的自交系由于携带Ogura CMS不育基因，不能用作候选保持系材料，将其淘汰。

进一步的是，步骤(2)的酶切产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳，全恢复材料基因型为RfRf，含1个HindⅢ酶切位点，产生2条带434bp和209bp；全保持材料基因型为rfrf，含2个HindⅢ酶切位点，产生3条带358bp、209bp和76bp；杂合材料基因型为Rfrf，产生4条带434bp、358bp、209bp和76bp；淘汰酶切产生2条带的全恢复材料，选择酶切能产生3条带的全保持材料用于不育系的选育，产生4条带的材料若性状优良可自交一代，对其后代再按步骤(2)进行一次分子标记筛选，以筛选出酶切能产生3条带的候选保持材料。

进一步的是，步骤(3)中所述优良自交系包括耐抽薹材料、耐糠心材料或抗逆材料等。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)由于Type A与Type H型Ogura CMS不育材料具有不同的恢保关系，且经申请人实验发现，前人有关萝卜Ogura CMS保持系分子标记辅助选育技术并不完全适用于所有类型Ogura CMS保持系的选育。本发明根据萝卜Ogura-CMS育性恢复基因Rfo/rfo序列具有HindⅢ酶切位点差异，设计了一个相比SspI限制性内切酶更经济实惠且酶切效率更高的分子标记技术，用于辅助萝卜保持系的快速选育与创制，本发明的方法适用于Type A类型Ogura CMS保持系的选育，其分子标记的准确性高，与田间育性验证结果达到100％吻合，且其酶切效率高、使用成本降低；

(2)本发明相比传统选育方法节约了时间2-3年，同时减少了大量的人工杂交及育性鉴定工作，显著提高了萝卜不育系、保持系的选育效率，实现了Type A型Ogura CMS萝卜保持系的快速选育与创制。

附图说明

图1为4个自育不育系及5个引进材料F2分离不育单株orf138-F/R PCR特异扩增产物1.2％琼脂糖电泳图(第1泳道Marker：DL2000；第2-10泳道：1-9号材料)；

图2为4个自育不育系及5个引进材料F2分离不育单株orf138-F/R PCR特异扩增产物测序结果DANMAN软件序列比对图；

图3为4份保持系及20份优良自交系orf138-F/R PCR特异扩增产物1.2％琼脂糖电泳图(第1泳道Marker：DL2000；第2-25泳道：10-33号材料)；

图4为4份保持系及17份优良自交系Rf-F/R PCR特异扩增产物1.2％琼脂糖电泳图(第1泳道Marker：DL2000；第2-7泳道：10-15号材料；第8-18泳道：17-27号材料；第19-20泳道：29-30号材料；第21-22泳道：32-33号材料)；

图5为21份不含orf138特异片段材料的恢复基因Rfo/rfo HindⅢ限制性内切酶酶切图(第1泳道Marker：DL2000；第2-7泳道：10-15号材料；第8-18泳道：17-27号材料；第19-20泳道：29-30号材料；第21-22泳道：32-33号材料)；

图6为耐糠心保持材料创制31个单株Rfo/rfo HindⅢ限制性内切酶酶切图(第一道Marker：50bp Ladder；第2-3、4-5、6-7道分别是Type A型Ogura CMS保持系、杂合材料及恢复系对照，9-39道为耐糠心创制材料F2代单株)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。

实施例

(一)供试材料

选取四川省农业科学院水稻高粱研究所本课题组4个不育系及5个新引进材料F2分离不育单株进行Type A型萝卜Ogura CMS胞质鉴定，选取4份保持系及20份优良自交系进行Type A型Ogura CMS萝卜恢复基因(Rfo/rfo)分子标记快速筛选与保持材料创制，材料详情如表1。

表1 Type A型Ogura CMS萝卜材料表

(二)材料基因组DNA提取

选取萝卜幼嫩叶片，采用改良CTAB法进行基因组DNA提取。主要步骤为：称取0.2g萝卜幼嫩叶片，放入研钵中，加入液氮研磨，迅速将研磨粉转入2ml EP管中，加入1ml CTAB(含2.5％巯基乙醇)，65℃水浴40min，10000rpm离心5min，转移上清液至新的EP管中，先加入500μl tris-酚，震荡均匀，再加入500μl氯仿：异戊醇(24：1)，震荡均匀，12000rpm离心10min，将上清液移入新的EP管中，加入1ml氯仿：异戊醇(24：1)，震荡均匀，12000rpm离心5min，转移上清入新的EP管中，加入预冷的异丙醇600μl，摇匀，-20℃放置30min，12000rpm离心5min，弃上清，加入75％乙醇洗涤，12000rpm离心5min，去掉上清液，加入1ml无水乙醇，12000rpm离心5min，去掉上清，沉淀在室温晾10min，加入ddH₂O溶解，-20℃保存备用。

(三)Type A型萝卜Ogura CMS的鉴定

根据NCBI网站上已公布的萝卜Ogura CMS线粒体基因组(Genebank ID:AB694744.1)设计包含胞质不育基因orf138的特异引物Ⅰ，正向引物orf138-F序列：AACGGGAAGTGACAATACC(5’→3’)，反向引物orf138-R序列：GTTGACCAACAAAAGCATG(5’→3’)，产物长度为544bp。利用4个不育系及5个不育单株基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增体系为50ul，包含80ng DNA，5.0μL 10×Taq Plus Buffer(含Mg²⁺)，4μL 2.5mM Super puredNTPs，1.0μL 10μM正向引物，1.0μL 10μM反向引物，1.0μL 2.5U/μL Taq Plus，用ddH₂O补齐50μL。PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，35次循环；最后72℃延伸10min。PCR产物于1.2％琼脂糖凝胶上电泳检测，如图1所示，所有材料均能扩增出特异片段，说明这9份不育材料均为Ogura CMS，然后对琼脂糖凝胶切胶、回收，送至上海生工测序，对测序结果用DNAMAN软件进行比对，参照前人有关Ogura CMS分类依据(Yamagishi H,Terachi T.2001.Intra-and inter-specific variations in themitochondrial gene orf138 of Ogura-type male-sterile cytoplasm from Raphanussativus and Raphaus raphanistrum.Thero Appl Genet,103:725-732.)，所有材料可分为两种类型，前一类和后一类核酸序列相比，有2个碱基差异，分别是61A→C，99A→G，1-4、7、8号材料为Type A，5、6、9号材料为Type H型(图2)。

(四)Type A型Ogura CMS萝卜恢复基因(Rfo/rfo)分子标记快速筛选及田间育性验证分析

利用NCBI网上公布的萝卜Ogura CMS一对等位育性恢复基因序列(Rfo：AJ535623.1和rfo:AJ535624.1)，经DNAMN软件比对发现Rfo/rfo存在限制性内酶HindⅢ酶切位点差异，由此设计特异引物Ⅱ，正向引物为Rf-F：ATCTCGTCCTTTACCTTCTGTG(5’→3’)，反向引物为Rf-R：GATTCCTTTCTCTTGCATTTC(5’→3’)，特异扩增片段长643bp。Rfo在209bp处有一个酶切位点，PCR产物酶切片后产生434bp、209bp两条片段，rfo分别在209bp、285bp处有一个酶切位点，PCR产物酶切后产生358bp、209bp、76bp三条片段。以4份保持系(10-13)及20份优良自交系(14-33)基因组DNA为模板，用Ogura CMS不育胞质鉴定特异引物orf138F/R进行PCR扩增，16、28、31号材料能扩增出特异片段说明其含Ogura CMS不育基因orf138，不能用做保持系的筛选，将其淘汰(图3)。其余材料不能扩增出特异片段材料，再利用特异引物Ⅱ进行PCR特异扩增，扩增体系为25ul，包含40ng DNA，2.5μL 10×Taq Plus Buffer(含Mg²⁺)，2μL 2.5mM Super pure dNTPs，0.50μL 10μM正向引物，0.5μL 10μM反向引物，0.5μL2.5U/μL Taq Plus，用ddH₂O补齐25μL。PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，35次循环；最后72℃延伸10min。结果见图4，所有材料均能扩增出特异条带，再将获得的PCR产物利用限制性内切酶HindⅢ酶切，25μL酶切体系包含5μL PCR产物(约500ng)，0.75μL内切酶HindⅢ-HF(20000U/ml)，2.5μL 10*buffer，16.75μL ddH₂O，酶切条件为37℃水浴3h。酶切结果如图5所示，材料15、18、23、25、27、33共6份含有2条带，基因型为RfRf；材料10-14、19、21、22、24、29、30共11份材料含有3条带，基因型为rfrf；材料17、20、26、32含有4条带，基因型为Rfrf。

为了验证分子标记的准确性，将上述材料与Type A、Type H型Ogura CMS不育株分别进行测交，收获测交种子，浸种发芽，待胚根露出2cm左右，将其移入含有湿润砂砾的培养皿中，于4℃人工春化处理30d，再播种于穴盘中(蛭石：草炭＝1:1)，于光照培养室培养(25℃，光照16h，光强8000lx)，花期调查育性，结果如表2所示，证明分子标记与田间Type A型Ogura CMS育性验证结果100％吻合。

表2分子标记与田间育性验证结果

(五)耐糠心Type A型Ogura CMS萝卜保持系的创制及候选保持系的分子标记筛选

材料13为Type A型Ogura CMS保持材料，叶量少，产量较高，根为圆形，适合加工，但该材料不耐糠心，采收期较短，限制了其推广应用。材料20来源于成都地方品种“春不老”，白圆根，特耐糠心，具有部分保持能力。利用13号材料为母本，20号材料为父本，进行杂交获得F1代材料，然后再进行自交获得F2代材料，于采收期延后20d调查材料糠心情况。从主根上端沿下斜剖1/3肉质根(不要伤到短缩茎及心叶)，选择未糠心材料31株，提取未糠心材料DNA为模板，利用Rfo-F/R引物进行PCR特异扩增，PCR产物进行HindⅢ酶切，筛选到酶切产生3条带的材料16份(图6)，将这些材料作为轮回亲本，用于后续耐糠心保持系及不育系的选育。

(六)Type A型Ogura CMS不育系的回交转育

将上述筛选到的候选保持材料与Type A型Ogura CMS不育株分别杂交，再进行4-6代自交与回交，获得7份优良不育系，可用于萝卜杂交种子生产，其中保持系来源为白地球、扬州圆白、早雪50、重庆独根FZ的4份材料肉质根白皮圆形，干物质含量高，可用于加工萝卜品种选育；保持系来源短叶十三的材料肉质根白长柱，耐热，可用于夏季高山耐热品种的选育；保持系来源为南充胭脂萝卜的材料肉质根红皮红心，花青素含量高，可用于色素提取专用萝卜品种的选育；保持系来源为绵阳红圆萝卜的材料肉质根红皮圆形，是西南地区泡菜常用品种。

将上述创制耐糠心候选保持材料与Type A型Ogura CMS不育株分别杂交，再进行4-6代自交、回交及耐糠心性状筛选，获得耐糠心优良不育系5份。

对比例1

采用专利文献CN 101956007 A中提供的分子标记方法辅助萝卜CMS雄性不育系的培育，发现其特异性引物不能完全适用于进行所有类型Ogura CMS保持系的分子标记辅助选择，其中部分分子标记鉴定结果与田间育性鉴定结果不一致，有3个Type A型保持材料与Type H型Ogura CMS测交后代出现1：1的育性分离，与田间Type A型Ogura CMS育性结果仅94％吻合(共试验70株)。

对比例2

采用专利文献CN106967803 A中的专用引物按照本发明的方法进行分子标记辅助检测萝卜Ogura-CMS育性恢复基因，发现部分分子标记鉴定结果与田间育性鉴定结果不一致，有5个Type A型保持材料与Type H型Ogura CMS测交后代出现1：1的育性分离，与田间Type A型Ogura CMS育性结果仅93％吻合(共试验70株)。

序列表

<110> 四川省农业科学院水稻高粱研究所

<120> 一种Ogura CMS萝卜保持系快速选育与创制方法

<130> 2018

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

aacgggaagt gacaatacc 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 2

gttgaccaac aaaagcatg 19

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

atctcgtcct ttaccttctg tg 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 4

gattcctttc tcttgcattt c 21

Claims

1.一种分子标记辅助Type A型Ogura CMS萝卜保持系的快速选育与创制的引物对，其特征在于，所述引物对包括特异引物Ⅰ和特异引物Ⅱ，所述特异引物Ⅰ用于检测胞质不育基因orf138，用于对Type A型Ogura CMS萝卜进行鉴定，其正向引物orf138-F序列为：5’-AACGGGAAGTGACAATACC-3’，如SEQ ID NO .1所示，反向引物orf138-R序列为：5’-GTTGACCAACAAAAGCATG-3’，如SEQ ID NO .2所示；所述特异引物Ⅱ用于检测Rfo/rfo等位基因HindⅢ酶切差异位点，用于对Type A型Ogura CMS萝卜恢复基因Rfo/rfo进行分子标记快速筛选，其正向引物Rf-F序列为：5’-ATCTCGTCCTTTACCTTCTGTG-3’，如SEQ ID NO .3所示，反向引物Rf-R序列为：5’-GATTCCTTTCTCTTGCATTTC-3’，如SEQ ID NO .4所示。

2.一种Type A型Ogura CMS萝卜保持系的快速选育与创制方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）采用如SEQ ID NO .1和SEQ ID NO .2所示的特异引物Ⅰ对萝卜不育材料DNA进行PCR扩增，扩增特异片段长度为544bp，经测序比对筛选出Type A型Ogura CMS材料作为不育系转育的母本；

（2）提取萝卜优良自交系材料基因组DNA，以步骤（1）所述特异引物Ⅰ进行PCR扩增，选择不能扩增出544bp特异片段的优良自交系材料，采用如SEQ ID NO .3和SEQ ID NO .4所示的特异引物Ⅱ对该优良自交系材料DNA基因组进行PCR扩增，扩增特异片段长度为643bp，对扩增产物进行限制性内切酶HindⅢ-HF酶切，酶切产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳，筛选出酶切能产生3条带358bp、209bp和76bp的材料作为不育系选育的侯选保持材料；

（3）以现有待改良Type A型Ogura CMS保持系为母本，以优良自交系为父本，进行杂交获得F1代材料，然后F1代材料自交获得F2代材料，对F2代材料进行性状鉴定，筛选优良F2代材料，提取筛选的优良F2代材料基因组DNA，用步骤（2）所述方法进行恢复基因分子标记选择，即可快速从创制材料中筛选到候选保持材料；

（4）用步骤（2）所选候选保持材料为轮回亲本与步骤（1）所选Type A型Ogura CMS不育材料进行连续回交4-6代，同时轮回亲本自交，即可选育出优良Type A型Ogura CMS不育系与保持系；用步骤（3）所选候选保持材料为轮回亲本与步骤（1）所选Type A型Ogura CMS不育材料进行连续回交4-6代，同时轮回亲本自交，即可实现Type A型Ogura CMS保持系的快速创制与不育系的改良。

3.根据权利要求2所述的Type A型Ogura CMS萝卜保持系的快速选育与创制方法，其特征在于，特异引物Ⅰ的PCR扩增程序为：

1）94℃，4 min；

2）94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 45s，35个循环；

3）72℃延伸10 min。

4.根据权利要求2所述的Type A型Ogura CMS萝卜保持系的快速选育与创制方法，其特征在于，步骤（1）中对扩增出的特异片段PCR产物进行测序，根据Ogura CMS胞质分类依据比对测序结果，筛选出Type A型Ogura CMS材料作为不育系转育的母本。

5.根据权利要求2所述的Type A型Ogura CMS萝卜保持系的快速选育与创制方法，其特征在于，特异引物Ⅱ的PCR扩增程序为：

1）94℃，4 min；

2）94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 40s，35个循环；

3）72℃延伸10 min。

6.根据权利要求2所述的Type A型Ogura CMS萝卜保持系的快速选育与创制方法，其特征在于，步骤（2）中所述酶切采用25 µL酶切体系，包括：5 µL PCR产物，0.75 µL内切酶HindⅢ-HF，酶浓度为20000U/ml，2.5 µL 10*buffer，16.75 µL ddH₂O ，37 ℃水浴3 h。

7.根据权利要求2所述的Type A型Ogura CMS萝卜保持系的快速选育与创制方法，其特征在于，步骤（2）中采用特异引物Ⅰ能扩增出544bp特异片段的自交系由于携带Ogura CMS不育基因，不能用作候选保持系材料，将其淘汰。

8.根据权利要求2所述的Type A型Ogura CMS萝卜保持系的快速选育与创制方法，其特征在于，步骤（2）酶切后的筛选操作为：淘汰酶切产生2条带的全恢复材料，选择酶切能产生3条带的全保持材料用于不育系的选育，将产生4条带的性状优良材料进行自交一代，对其后代再按步骤（2）进行一次分子标记筛选，以筛选出酶切能产生3条带的候选保持材料。

9.根据权利要求8所述的Type A型Ogura CMS萝卜保持系的快速选育与创制方法，其特征在于，所述的全恢复材料基因型为RfRf，含1个HindⅢ酶切位点，产生2条带434bp和209bp；全保持材料基因型为rfrf，含2个HindⅢ酶切位点，产生3条带358bp、209bp和76bp；杂合材料基因型为Rfrf，产生4条带434bp、358bp、209bp和76bp。

10.根据权利要求2所述的Type A型Ogura CMS萝卜保持系的快速选育与创制方法，其特征在于，步骤（3）中所述优良自交系包括耐抽薹材料、耐糠心材料或抗逆材料。