CN111286504A

CN111286504A - 调控油菜种子含油量的基因orf188

Info

Publication number: CN111286504A
Application number: CN201811394570.8A
Authority: CN
Inventors: 王汉中; 华玮; 刘静; 郝万军; 刘军; 范世航
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2018-11-21
Filing date: 2018-11-21
Publication date: 2020-06-16
Also published as: WO2020103475A1

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，具体公开了一种油菜含油量细胞质效应的调控基因orf188的分离克隆及应用。orf188基因位于油菜线粒体基因组中，为部分油菜线粒体基因组所特有。orf188基因具有调控油菜种子含油量的功能，通过基因工程技术提高orf188基因的表达量能够提高油菜种子的含油量，达到增加产油量的目的。

Description

调控油菜种子含油量的基因orf188

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种调控油菜种子含油量的细胞质效应基因orf188，通过基因工程技术提高orf188基因的表达量能够提高油菜种子的含油量，达到增加产油量的目的。

背景技术

细胞质遗传是由亲代细胞质基因型决定子代表型的遗传现象(Jones et al.,1986)。细胞质效应是不同亲代细胞质对后代所产生的不同遗传效应，其具有两大特点：第一，正交F1和反交F1的遗传表现不同，F1不遵循孟德尔遗传规律，不表现性状分离，通常只表现母本的性状；第二，同一细胞质在不同性状上的遗传效应不同，不同细胞质在同一性状上的遗传效应也不同。

目前，科研人员主要采用5种方法来评估细胞质效应。(1)正反交差异法，该方法主要针对成对的材料进行评估，利用正反交F1间的表型差异来评估胞质效应的有无、大小和优劣，受评估的两个材料必须都可育，因此这种方法不能用于评估雄性不育细胞质的细胞质效应(郑家奎等,1995)；(2)用恢复系分别给雄性不育系和其相应的保持系授粉，用杂交F1代的遗传差异来评价不育系细胞质和保持系细胞质的遗传效应。该方法仅限于研究不育系和保持系之间的细胞质效应，此外这种方法也无法估算核质互作效应(盛孝邦,1982)；(3)同核异质系差异比较法，即将不同的细胞质通过连续多代回交转育到同一核背景下，育成同核异质系，利用同核异质系间的表型差异来评估不同细胞质的细胞质效应(王文明，文宏灿，袁国良,1994)。(4)超亲优势估计，该方法利用超亲优势率来评估细胞质效应的大小，即超亲优势率(％)＝[(F1-高值亲本)/高值亲本]X 100％。此外，还可以采用双列杂交等来评估多个材料的细胞质效应(游年顺等,1997；游年顺等,1993)。

细胞质效应导致作物杂交育种时出现正反交差异，有可能阻止杂交育种的潜力的挖掘。因此，细胞质效应研究受到育种家的广泛关注。据研究报道，在很多作物、很多性状上都存在细胞质效应，如小麦、大豆、水稻和玉米等。Ekiz等(1998)对小麦研究发现，细胞质效应可以对很多数量性状产生影响，其可以影响千粒重的7％、蛋白质含量的10％、蛋白质质量的4％、谷物硬度的5％。还有研究表明，不同细胞质对小孢子培养响应不同(Becraft etal.,1989；Mathias et al.,1986)，不同的细胞质释放铁载体的速率也不同(Zhang etal.,2003)。Ning等(2007)对5个大豆品系进行完全双列杂交，利用双子叶二倍体种子遗传模型研究各种油脂组成的遗传，发现大豆油酸含量和亚麻酸含量以细胞质主效应为主。Liang等(2007)对6个大豆品系不完全双列杂交，利用二倍体种子数量性状遗传模型分析了种子异黄酮含量的遗传，发现其8.39％受细胞质遗传控制。Singh等(1972)研究表明，细胞质效应对大豆蛋白质含量的影响为3-4个百分点。此外，大豆种子油酸和亚油酸含量(Miller et al.,1996)也受细胞质效应的影响。ChunHai等(1998)研究发现，水稻的糙米重量、精米重量和完整米率都受细胞质的影响，效应值为4.1-37.3％。Qin等(2013)研究表明，水稻GMS突变系h2s细胞质对结实率、每穗产量和产量都具有显著的正效应。Shi等(1999)对9个细胞质雄性不育系和5个恢复系的研究表明，细胞质效应对水稻蛋白质和赖氨酸含量非常重要。Tao等(2004)对日本稻研究表明，细胞质效应和核质互作效应对产量、旗叶宽度和低温抗性具有重要作用。此外，Xu等(2013)研究了细胞质对DNA甲基化的影响，发现WA型、Yinshui型细胞质可以产生比G型和D型细胞质更高的甲基化水平。Hunter等(1968)利用11个杂交组合2个年份2个地点的实验，发现植株高度、谷物产量等调查的11个性状都具有显著的细胞质效应。Tang等(2013)的研究表明，细胞质效应可以解释玉米株高和叶耳高度表型变异的9％和40％，QTL×细胞质互作效应可以解释玉米株高和叶耳高度表型变异的18％和9％。Khehra等(1976)的研究也表明玉米株高、叶耳高度和周长、吐丝时间都具有细胞质效应。此外，玉米谷物性状也具有细胞质效应(Seka et al.,1995)，大刍草细胞质可以对玉米生长、发育、形态、功能等相关的56个形状产生影响(Allen,2005)。此外，还有很多作物的很多性状存在细胞质效应，如棉花产量及其构成因子(Zhu et al.,1998)，高粱的株高、花期、谷物产量(Moran et al.,2003)，花生的种子皱缩(Jakkula et al.,1997)，甜菜中的叶酸含量(Wang et al.,1997)，向日葵种子含油量、产量、组培重建(Fick,1975；Jan et al.,2014；Nestares et al.,1998)，亚麻植株高度(Tyson,1973)，马铃薯DNA甲基化(Sanetomoet al.,2011)。

油菜是世界上最重要的油料作物之一，在油菜育种研究的过程中，细胞质效应很早便得到了育种家们的重视(Abbadi et al.,2011；王文明等,1994；王贵春等,2007；李殿荣等,2011)。Ramsay等(1994)的研究表明，油菜的生物产量(鲜重和干重)具有很大的细胞质效应；Shiva(2012)对8个油菜品系进行完全双列杂交，发现产量和产量构成因子均具有显著的细胞质效应。Wu等(2005)对8个油菜品系进行完全双列杂交，并利用二倍体植物种子数量性状遗传模型研究表明，细胞质效应能影响蛋白质含量的17.62％；Chen G.(2011)对油菜种子发育的五个时期进行研究，发现细胞质效应对苏氨酸含量具有重要作用。Shi等(2003)也利用8个油菜品系的完全双列杂交数据分析发现，种子芥酸含量也受细胞质效应的影响；研究人员利用条件和非条件遗传模型对五个发育时期的油菜种子研究表明，油酸、亚油酸和千粒重也都具有巨大的细胞质效应(Variath et al.,2010)。Zou等(2012)利用10个油菜同核异质系对hau胞质的细胞质效应进行了研究，发现hau胞质对单株重具有较明显的负效应，对株高、株幅、叶长、叶柄长、莲座叶数、可溶性糖含量等有较弱的负效应。Chang等(2007)利用具有甘蓝型油菜细胞质和芥菜细胞质的埃塞俄比亚芥菜异质系研究表明，甘蓝型油菜细胞质对埃塞俄比亚芥菜具有更大的细胞质负效应(Chang et al.,2009)。此外，Campbell等(1978)的研究表明，叶片发生速率和开花速率都受细胞质效应的影响；Zhang等(2002)利用人工合成油菜研究表明，花瓣颜色受到不同的来源细胞质的影响。

含油量是油菜最重要的农艺性状之一，油菜籽含油量提高1％，相当于菜籽增产2.3至2.5个百分点(王汉中,2004)，因此高含油量育种一直是国内外油菜育种的重要目标之一。研究表明，油菜籽含油量的遗传受到细胞质效应的影响，并得到了广泛证实。Rajcan等(2002)对两个油菜DH群体研究表明，种子含油量受到细胞质效应的影响，利用RFLP和RAPD对材料的细胞质基因组(cpDNA和mtDNA)进行比较，发现在分子水平存在差异。Wu等(2006)对8个油菜品系进行完全双列杂交，利用二倍体植物种子数量性状遗传模型2年的含油量数据进行遗传解析，发现细胞质效应对含油量起重要作用，最大能使含油量提高3.26个百分点，最小能使含油量降低1.91个百分点。Variath等(2010)利用条件、非条件二倍体植物种子数量性状遗传模型对五个发育时期的油菜种子进行遗传分析，发现含油量同时受合子胚核基因型、母体植株核基因型和细胞质基因型控制。Shiva(2012)对8个油菜品系进行完全双列杂交，也发现种子含油量具有显著的细胞质效应。本课题组Wang等(2010)等利用一套完整的解决方案，对油菜种子含油量遗传进行了全面解析。发现细胞质效应在其中起着关键作用，研究的8个油菜品系中有4个具有细胞质正效应，其中油菜51218最高，效应值达到3.27个百分点，4个品系具有细胞质负效应，其中油菜56366最高，效应值为-3.73个百分点，两者相比，效应值高达7个百分点。如果这被成功用于油菜育种，将可能带来髙油育种新的突破。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种调控油菜种子含油量的细胞质效应基因orf188，核苷酸序列如SEQ.ID.No.1所示，其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ.ID.No.2所示。

本发明的另一个目的在于提供基因orf188在转基因油菜中的应用，通过提高orf188基因在油菜中的表达量来提高油菜种子含油量，达到增加产油量的目的。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

调控油菜种子含油量的细胞质效应基因orf188通过下述方法开发获得：

1.细胞质效应材料的筛选

本研究在Wang等(2010)实验的基础上，选择含油量遗传具有极显著细胞质正效应的甘蓝型油菜品系51218(效应值3.27％)和具有极显著细胞质负效应的甘蓝型油菜品系56366(效应值-3.73％)进行比较基因组研究。首先，对两个油菜品系进行进一步的正反交，对获得的F1和F2种子考察含油量，鉴定细胞质效应。两个油菜品系的细胞质效应得到了很好的重复，效应值相差将近5个百分点。

2.关联分析群体的构建及表型考察

选用国内外甘蓝型油菜品系近200余份，苗期提取叶片DNA对基因型多态性、群体内亲缘关系和遗传距离进行详细的分析，进一步根据亲缘关系和遗传距离筛选出46份材料构成关联群体。利用46个材料与56366正反交F1鉴定了46个材料相对于56366的细胞质效应。

3.线粒体基因组的测序

将提取的2个油菜品系的DNA样品进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，由测序公司(华大基因公司)进行线粒体基因组测序，油菜品系51218的线粒体基因组序列长221867bp，油菜品系56366的线粒体基因组序列长223412bp。

4.分子标记引物的设计

利用Dotter plot软件对51218和56366线粒体基因组序列进行共线性分析，两个线粒体基因组序列结构不完全相同，曾经出现过多次基因组重组，导致出现了一些基因组序列的缺失和插入。按照序列相似性，将线粒体基因组划分成12个片段，然后在每个片段中利用Crossmatch软件分析序列变异发现包括SNP、MNP、InDel、CV在内的遗传变异位点。根据油菜品系51218和56366的线粒体基因组比较研究，本研究共开发了14个分子标记，所有标记引物序列如表1。

5.关联分析获得候选位点

利用设计的14个分子标记，对46个油菜品系进行基因分型。利用tassel软件(Bradbury et al.,2007)的一般线性模型(Q+K)分别对表型数据和基因型数据进行关联分析，结果如表2。从表中可以清楚的看到，2013年的结果中有两个标记达到了极显著相关，其中Mtgene2显著性最高，p值为3.20E-04，贡献率为18.89％。经过Mtgene2位点分析，我们获得了位点所在基因orf188。

orf188基因位于油菜线粒体基因组中，为部分油菜线粒体基因组所特有，具有SEQ.ID.No.1所示的核苷酸序列，其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ.ID.No.2所示。

orf188基因具有调控油菜种子含油量的功能：通过基因工程技术提高orf188基因的表达量能够提高油菜种子的含油量，达到增加产油量的目的，经实验证实，含orf188的转基因油菜含油量与受体对照(非转基因植株)相比均有所增高，增幅最大株系为13％左右。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

本发明是国内首次公开orf188基因在提高油菜含油量中的作用。本发明首次利用线粒体基因组的基因型数据及油菜正反交材料含油量数据进行关联分析，获得影响油菜种子含油量的细胞质效应基因。本发明实验结果表明转基因油菜含油量与受体对照(非转基因植株)相比均有所增高，增幅最大株系为13％左右。该基因为油菜高油育种提供了新的基因源。

附图说明

图1.线粒体DNA样品的琼脂糖凝胶电泳图

图2.载体构建示意图

图3.转基因油菜阳性株系鉴定结果

具体实施方式

实施例1:油菜含油量细胞质效应的材料筛选、关联分析群体的构建及表型鉴定

首先，选择含油量遗传具有极显著细胞质正效应的甘蓝型油菜品系51218(效应值3.27％)和具有极显著细胞质负效应的甘蓝型油菜品系56366(效应值-3.73％)进行正反交，对获得的F1和F2种子考察含油量，鉴定细胞质效应。两个油菜品系的细胞质效应得到了很好的重复，效应值相差将近5个百分点。

选用国内外甘蓝型油菜品系近200余份，苗期提取叶片DNA对基因型多态性、群体内亲缘关系和遗传距离进行详细的分析，进一步根据亲缘关系和遗传距离筛选出46份材料构成关联群体。2011年9月，将47份材料种植于中国农业科学院武昌实验基地，用56366与其余46份材料进行正反交。成熟后收获正反交F1种子，2012年9月种植于中国农业科学院阳逻实验基地，采用随机区组实验设计，每小区2行，株行距均为15厘米，正反交组合相邻种植，每个正反交组合种3次重复。2013年5月每个小区收获10株考种，测定主花序种子含油量。

2013年9月种植剩余的正反交F1种子，于2014年收获考种，测定含油量。利用46个材料与56366正反交F1鉴定了46个材料相对于56366的细胞质效应。当56366作为父本时，我们称其为正交；当56366做母本时，我们称其为反交。假定56366的细胞质效应为0，那么其他材料的细胞质效应表示为：细胞质效应＝正交种子含油量-反交种子含油量。最终，2013年获得了全部46个品系的胞质效应值。

实施例2：油菜线粒体DNA提取及测序分析

线粒体DNA提取：挑选饱满的油菜种子，用70％的酒精消毒1分钟，再用0.1％的升汞消毒15分钟，期间不断振荡，随后无菌水清洗4-5次，将己经消毒的种子置入MS/2培养基中。在培养箱中25℃暗培养7天，得到黄化苗用于线粒体DNA的提取。

(1)取5克油菜黄花苗用剪刀剪碎，加入50ml预冷的研磨液，倒入Dounce组织研磨器，匀浆80次左右(没有肉眼可见的组织)；

(2)将匀浆液倒入50ml离心管，500×g离心10分钟，去掉细胞核和细胞碎片；

(3)转移上清液至新的50ml离心管，1000×g离心5分钟，去掉残留的细胞核和细胞碎片；

(4)转移上清液至新的50ml离心管，12000×g离心20分钟，沉淀质体和线粒体；

(5)弃上清，加入1.5ml提取缓冲液，等量分装入2个2ml的离心管，37℃水浴1小时溶解细胞器；

(6)室温冷却5分钟，加入85ul 2M醋酸钠溶液，850μl水饱和酚，上下混匀，12000g离心10分钟；

(7)取上清至1.5ml离心管，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)混合液，上下混匀，12000×g离心10分钟；

(8)取上清至1.5ml离心管，加入2倍体积的预冷的无水乙醇，12000×g离心5分钟；

(9)弃上清，用70％的乙醇清洗2遍沉淀，室温干燥，重悬于50ul TE缓冲液。

将提取的2个油菜品系51218和56366的DNA样品进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。提取的2个油菜DNA样品都比较完整，基本无降解，可以用于建库测序。

DNA测序：总DNA经电泳、NanoDrop 1000检测合格后，构建插入片段为500bp的测序文库。基本操作步骤如下：利用超声波将DNA随机打断成短片段，在末端加上index序列和测序接头，经琼脂糖凝胶电泳，回收大小在500±25bp的DNA片段，回收片段经PCR扩增完成文库的构建。构建好的文库先使用Qubit2.0初步定量，将浓度稀释至1.5ng/ul，然后利用Agilent 2100Bioanalyzer评估文库的insert size，获得的文库insert size符合要求后，利用qPCR准确定量文库的有效浓度(有效浓度必须大于2nM)，来保证测序文库的质量。将构建好的2个测序文库在Illumina/Solexa Genome Analyzer测序平台上进行双末端75bp测序。本部分工作由深圳华大基因科技有限公司负责完成。

组装注释：1)利用blat软件将获得的scaffold比对到参考线粒体基因组序列上，过滤获得线粒体scaffold；4)按scaffold在参考基因组上的位置，将scaffold连接起来构成线粒体基因组草图；5)使用GapCloser软件采取步移的办法进行补洞，具体做法是把一端比对到gap两边，一端比对不上的reads抽出来补洞，每次延伸一段，循环几次，gap被补上或缩小；6)利用PCR测序完成步移法不能完成的Gap，并进行准确性验证。获得2个材料的线粒体基因组后，利用已经测序了的线粒体基因组注释信息(Genbank accession number:GQ861354,KJ872515,FR715249,AP006444)，通过同源比较对线粒体基因组进行基因注释。利用Dotter plot软件对两个材料的线粒体基因组序列进行共线性分析(Gibbs et al.,1970)，利用Crossmatch软件(http://www.phrap.org/)分析两个材料之间的SNP、MNP、InDel等，利用已知的注释信息应用snpEff软件对变异位点进行功能注释分析(Cingolaniet al.,2012)。

实施例3：油菜线粒体基因组的标记引物设计及关联分析

根据油菜品系51218和56366的线粒体基因组比较研究，本研究共开发了14个分子标记，其中针对14个材料特异的线粒体基因设计了11个标记，针对4个具有非同义SNP线粒体基因设计了3个SNP标记，所有标记对应的基因和引物序列如表1。利用设计的14个分子标记，对46个油菜品系进行基因分型。经过PCR扩增，11个特异基因标记的PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳分离，3个snp标记8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离，染色后统计基因型多态性。

表1.51218和56366线粒体基因组开发的特异基因引物列表

利用tassel软件(Bradbury et al.,2007)的一般线性模型(Q+K)分别对表型数据和基因型数据进行关联分析，结果如表2。从表中可以清楚的看到，分析结果中有两个标记达到了极显著相关，其中Mtgene2显著性最高，p值为3.20E-04，贡献率为18.89％。经过关联分析，我们获得了一个相关性较高的位点MTgene2，位点所在基因为orf188，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

表2.分子标记与细胞质效应关联分析

实施例4：油菜候选基因orf188的克隆、载体构建

本研究选择被广泛使用的烟草ATP合成酶β亚基基因的线粒体转运信号肽将ORF188蛋白转运进线粒体。提取烟草幼嫩叶片的RNA，反转录成cDNA，以此为模板，用引物TP-F和相应的下游引物扩增转运肽序列；50μL PCR反应体系：10×pfu PCR buffer 5μL，pfu ase(5U/μL)0.5μL，dNTP(2.5mmol/L)8μL，引物TP-F[5’-ATGGCTTCTCGGAGGCTTCTCG-3’](10μmol/L)1μL，下游引物[5’-TGCCGCTGCGGAGGTAGCGTAC-3’](10μmol/L)1μL，cDNA(100ng/μL)1μL，ddH2O 34μL；PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸45sec，循环5次，94℃变性30sec，65℃退火30sec，72℃延伸45sec，循环30次，72℃延伸10min，4℃保存；用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，用DNA胶回收试剂盒回收目的片段备用。

油菜幼嫩叶片的RNA，反转绿成cDNA，以此为模板，用基因克隆的上下游引物orf188F：[5’-GTACGCTACCTCCGCAGCGGCAATGTTTCCTAATACGTCATTAG-3’]和orf188R[5’-TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTATGAGACTTCTGTCGGAGTGCTP-3’]扩增候选基因，反应体系与反应条件同线粒体转运肽扩增。以回收得到的基因片段和相应的转运肽片段为模板，扩增转运肽和基因构成的融合基因，50μL PCR反应体系：10×LA PCR buffer 5μL，LA Taq(5U/μL)0.5μL，dNTP(2.5mmol/L)8μL，引物TP-F：[5’-FATGGCTTCTCGGAGGCTTCTCG-3’](10μmol/L)1μL，引物His-R：[5’-RTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTG-3’](10μmol/L)1μL，回收得到的基因片段(30ng/μL)1μL，转运肽片段(30ng/μL)1μL，ddH2O 32.5μL；PCR反应：94℃预变性5min，94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸90sec，循环35次，72℃延伸10min；用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，用DNA胶回收试剂盒回收目的片段备用。

将得到的融合基因片段，与克隆载体

8/GW/

连接并转化大肠杆菌感受态DH5α，具体操作按说明进行。将菌液涂布于含有50μg/ml壮观霉素的LB固体培养基上倒置培养过夜，挑长势均匀的菌斑划线并进行PCR检测。阳性菌落于37℃扩繁后进行测序鉴定，用BioEdit软件对测序结果进行分析。挑选测序正确的单一菌落37℃振荡培养12h后提取重组质粒，采用Gateway重组技术将其与表达载体pEarleyGate-100进行LR重组(操作参考LR Clonase^TMII酶说明)，将LR反应产物转化DH5α感受态，将菌液涂布于含有50μg/ml卡那霉素LB固体培养基上倒置培养过夜，挑选单一菌落进行PCR鉴定，提取阳性克隆37℃振荡培养12h后提取质粒，用冻溶法转化农杆菌GV3101感受态。

实施例5：油菜候选基因orf188的油菜转化及鉴定筛选

油菜的农杆菌LBA4404转化：

A.无菌苗的准备：种子经70％乙醇浸泡消毒1min，氯化汞(HgCl₂)浸泡13-15min，ddH₂O洗5次后，平铺于MS培养基(PH 5.8)中，琼脂浓度0.8％。油菜无菌苗备用。

B.油菜子叶柄转化：接种根癌农杆菌LBA4404于固体培养基LB上，两天后挑取单菌落于50ml YEP液体培养基(胰蛋白胨10g+酵母提取物10g+NaCl5g+MgSO₄ 0.5g)中培养。取4-5天无菌苗子叶柄，于菌液中浸泡5-8min，其间轻摇，而后倒去菌液，以无菌滤纸吸去外植体上残留菌液。置于共培养基(MS+0.2mg/L 6-苄基腺嘌呤(6-BA)+1mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2、4-D)+200um乙酰丁香酮(AS)，PH5.8)，培养2-3天。

C.将共培养后的外植体转入只含青霉素(Car)不含Kan的分化培养基中，黑暗条件的温室中进行脱菌与分化培养5-7天。再继代在添加Kan筛选压的选择培养基(MS+3mg/L6-BA+0.1mg/Lα-萘乙酸(NAA)+5mg/L硝酸银(AgNO3)+400mg/L Car+15mg/L Kan；pH5.8)中，进行筛选，待分化出再生绿芽。

D.待再生芽长至1cm时切取小芽移至生根培养基(MS+0.2mg/L NAA+10mg/L Kan+400mg/L Car；pH5.8)上，用加Car与Kan的固体MS培养基筛选。

E.苗生根后，移栽入室外。10天后移栽下土钵。

转化植株的核酸分析-PCR鉴定：

(1)用于PCR的转化植株总DNA的提取

A.70％乙醇擦洗叶片，称取大约100mg；

B.加入600ul抽提缓冲液(0.2M Tris－Cl，0.25NaCl，25mM EDTA，0.5％SDS，pH7.5)，室温快速研磨；

C.1.5ml Ependorff管中涡旋混匀5-10s；

D.12000rpm，25min，室温；取上清，加等体积异丙醇，－20摄氏度沉淀过夜；

E.12000rpm，15min，室温；加入70％乙醇200ul泡洗DNA沉淀；

F.12000rpm，15min，室温，去乙醇，倒置于纸巾上，待乙醇挥发干净；

G.加无菌水100ul溶解粗提DNA沉淀，用分光光度计测定或电泳估测其浓度；

H.以总DNA为模板，进行PCR；

(2)PCR程序

依据植物表达载体中目的基因，设计并合成PCR引物，正向引物：5’-AGGCGTTCCTGGCCCTGCTAAT-3’和反向引物5’-TCCATTCTTCCAGCGGTGTGGGA-3’，反应的时间和温度作如下：94℃3min，94℃45s，59℃45s，72℃2min 30s，30cycles，72℃5min。检测结果显示，阳性对照和大多数转化植株均能够扩增出预期大小的电泳条带，而阴性对照则没有，表明转基因油菜基因组中已经含有外源基因DNA片段。

实施例6：orf188转基因油菜的含油量分析

选取油菜转基因纯合株系，利用核磁共振仪测定种子含油量。结果表明(如表3所示)，与非转基因对照相比，转基因株系的种子含油量升高，增加幅度约在8％-13％左右。

表3.油菜转基因株系含油量分析

序列表

<110> 中国农业科学院油料作物研究所

<120> 调控油菜种子含油量的基因orf188

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 567

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtttccta atacgtcatt agacgccata acggaacacc ctttatactg ttcaggtaca 60

gtcgctctaa aagaggaatt agtggataat cccattatta tggggagttt aacccggttg 120

aatcacttct taattaacat gcgctgggat tttcaaaagg gagttattca gtccgaatat 180

attctaaacc ttcagcgaga attggaccac actcctgcag aactcctcag cgataagctg 240

aactttattt attttcggga atccctcaat ttatggacta gagtgaatga gtggtatctg 300

cagaatttag gcgttcctgg ccctgctaat tttcttcaag aatatgaaga aaaatgttat 360

tcgaactatg ttaaagttat ggaaattccc acaccgctgg aagaatggaa ttttaaattt 420

ttatttagta ttctagctat cggtattttc tgcctattcc tattctgttg gatgaaacct 480

tacttgccta ccagtcttga gcagcaatca tctttgctta tgcggacgaa agtctttcca 540

cagcactccg acagaagtct catatga 567

<210> 2

<211> 188

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Phe Pro Asn Thr Ser Leu Asp Ala Ile Thr Glu His Pro Leu Tyr

1 5 10 15

Cys Ser Gly Thr Val Ala Leu Lys Glu Glu Leu Val Asp Asn Pro Ile

20 25 30

Ile Met Gly Ser Leu Thr Arg Leu Asn His Phe Leu Ile Asn Met Arg

35 40 45

Trp Asp Phe Gln Lys Gly Val Ile Gln Ser Glu Tyr Ile Leu Asn Leu

50 55 60

Gln Arg Glu Leu Asp His Thr Pro Ala Glu Leu Leu Ser Asp Lys Leu

65 70 75 80

Asn Phe Ile Tyr Phe Arg Glu Ser Leu Asn Leu Trp Thr Arg Val Asn

85 90 95

Glu Trp Tyr Leu Gln Asn Leu Gly Val Pro Gly Pro Ala Asn Phe Leu

100 105 110

Gln Glu Tyr Glu Glu Lys Cys Tyr Ser Asn Tyr Val Lys Val Met Glu

115 120 125

Ile Pro Thr Pro Leu Glu Glu Trp Asn Phe Lys Phe Leu Phe Ser Ile

130 135 140

Leu Ala Ile Gly Ile Phe Cys Leu Phe Leu Phe Cys Trp Met Lys Pro

145 150 155 160

Tyr Leu Pro Thr Ser Leu Glu Gln Gln Ser Ser Leu Leu Met Arg Thr

165 170 175

Lys Val Phe Pro Gln His Ser Asp Arg Ser Leu Ile

180 185

Claims

1.一种调控油菜种子含油量的细胞质效应基因orf188，它具有SEQ. ID. No.1 所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求2所述的细胞质效应基因orf188，其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

3.权利要求1或2所述的基因orf188在提高油菜种子含油量中的应用。