WO2021193865A1 - 温度感受性雄性不稔植物の製造方法 - Google Patents

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WO2021193865A1
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万紀子 川岸
健太郎 佐々木
布目　司
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    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a temperature-sensitive male sterile plant and the plant obtained thereby.
  • the present invention also relates to a method for producing a hybrid seed using the plant, and the seed obtained thereby.
  • heterosis which is more vigorous in growth and higher yield and quality than the parent varieties, can be obtained. Furthermore, the merit of hybrid breeding is great, such as the ability to accumulate useful traits from disease resistance genes and the like. In vegetables, flowers, corn, etc., almost all commonly used varieties are hybrid varieties. Hybrid varieties are also widespread in rice cultivation in China and the United States.
  • hybrid varieties are one-generation varieties
  • a large amount of mating work is required for each seed production, and at present, the labor, time, and cost required for mating are bottlenecks.
  • either manual removal of stamens (male removal work) or pre-cultivation of a special male sterile line is used to remove pollen. ..
  • manual sterilization and mating are carried out in hybrid seed production. If male sterile strains can be used, reduction of male removal work can be expected.
  • the main production method of hybrid seeds using the male sterile line is called the three-line method, and there are three lines: the fertility recovery line that is the father, the male sterile line that is the mother, and the maintenance line. It is necessary (see Fig. 1). It is complicated and time-consuming because it requires special breeding for the excellent varieties to be used in order to have male sterility and traits of fertility recovery commensurate with it. Beyond that, there are only a limited combination of available cytoplasmic male sterility factors and matching fertility recovery factors, which is laborious and time consuming due to the need to introduce those factors by cross breeding. As a result, it hinders the use of a wide range of genetic resources.
  • Patent Document 1 Non-Patent Document 1
  • the responsible gene involved in the phenotype of this mutant has not yet been identified. Therefore, it has been difficult to produce such a temperature-sensitive male sterile line in varieties other than "Reimei” and plant species other than rice, and to produce hybrid seeds by the two-line method.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and provides a method for producing a conditional male sterile plant that targets the gene responsible for identifying the responsible gene involved in the temperature-sensitive male sterile trait in "PL12".
  • the purpose is to do.
  • the present inventors first performed fine mapping in order to achieve the above object. However, the range could not be narrowed from about 1.8 Mb near 54 cM on chromosome 7. Therefore, whole genome sequence analysis of the original varieties "Reimei” and "PL12” was performed, and both were compared. As a result, it was found that there was a deletion of about 150 kb in the region of about 1.8 Mb of "PL12".
  • a deletion region of about 150 kb was divided into about three equal parts, and a strain in which each of these three regions was deleted was created by a genome editing method. As a result, it was found that one of these showed the same phenotype as "PL12", and the candidate area was narrowed down. Further, in the same manner, the candidate region was divided into three, a strain in which each of these three regions was deleted was created, and the range in which the responsible mutation exists was successfully narrowed down to about 10 kb.
  • the present invention provides the following.
  • the present invention relates to a method for producing a temperature-sensitive male sterile plant, and the plant obtained thereby. Further, the present invention provides, more specifically, the following with respect to the method for producing a hybrid seed using the plant and the seed obtained by the method.
  • a method for producing a temperature-sensitive male sterile plant which comprises a step of artificially suppressing the function of at least one gene selected from the group consisting of the following (a) to (d).
  • SEQ ID NO: A gene containing a DNA consisting of a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence according to any one of 1 to 22 and a DNA that hybridizes under stringent conditions.
  • ⁇ 3> A method for producing hybrid seeds. The step of cross-pollinating the temperature-sensitive male-sterile plant according to ⁇ 2>, which has been cultivated under a temperature limit and made male-sterile, with any plant, and collecting seeds from the temperature-sensitive male-sterile plant. The process, How to include.
  • ⁇ 4> A hybrid seed cultivated under a temperature limit and made male sterile, with the temperature-sensitive male sterile plant according to ⁇ 2> as the mother plant and any plant as the father plant.
  • a temperature-sensitive sterile plant it is possible to produce a temperature-sensitive sterile plant.
  • a temperature-sensitive sterile plant can be produced without requiring special breeding other than suppressing the function of the temperature-sensitive male sterile gene of the present invention.
  • the amino acid sequence of the protein encoded by the temperature-sensitive male sterile gene of the present invention is highly conserved. Since this gene is also present in the order Amborella, which is the most primitive angiosperm, it can be seen that it is at least a gene commonly present in angiosperms. Therefore, in principle, it is considered that this gene can be used in all crops. As described above, since the line used in the method of the present invention is not limited, it is possible to produce a male sterile line by suppressing the function of this gene in various varieties and lines of various plant species.
  • Strains lacking the gene in "Nihonbare” by genome editing show a temperature-sensitive male sterile phenotype similar to "PL12". It is a photograph which shows the appearance (typical example) of the genome editing line of rice. Strains lacking gene function by genome editing of rice variety "Nihonbare” were cultivated at 28 ° C (left) and 33 ° C (right). At 28 ° C, the ears were normally fertilized and the ears were dripping, whereas at 33 ° C, the ears were standing because they were not fertile. It is a photograph which shows the appearance (typical example) of the genome editing line, etc. of each of "Nihonbare” and "Hokuriku 193".
  • the genome editing line derived from “Hokuriku 193” Similar to the genome editing line derived from “Nihonbare", the genome editing line derived from “Hokuriku 193” also forms pollen and develops anthers under normal conditions, but becomes male sterile due to pollen hypoplasia under high temperature conditions.
  • TMS2 means the temperature-sensitive male sterile gene of the present invention (see SEQ ID NOs: 43 and 44).
  • SEQ ID NOs: 45 and 46 deletion of 2 amino acids at the relevant site occurs (see SEQ ID NOs: 45 and 46), but it is thought that functional proteins are still formed, which is different from the wild type in seed formation. Can not be seen.
  • SEQ ID NOs: 47 and 48 it was shown that seeds could not be produced under high temperature conditions in strains having a 5-base deletion mutation (see SEQ ID NOs: 47 and 48), which is presumed to be deficient in protein function due to frame shift.
  • FIG. 1 It is a schematic diagram showing the amino acid sequence encoded by the temperature-sensitive male sterile gene derived from each of rice, tomato and Arabidopsis thaliana, and the mutation site in the genome-edited individual prepared in the examples described later.
  • (i) and (ii) indicate the mutation introduction site in rice (position where double chain cleavage was introduced in CRISPR / Cas9)
  • (iii) indicate the mutation introduction site in Arabidopsis thaliana
  • (iv) and (V) shows the mutation introduction site in tomato.
  • the present inventors have clarified the responsible gene involved in the phenotype of the temperature-sensitive male sterile strain "Paddy rice intermediate mother Honno No. 12" (PL12). Furthermore, in wild-type rice, Arabidopsis thaliana and tomato, we succeeded in imparting a temperature-sensitive male sterility trait to these plants by suppressing the function of the gene by a genome editing method. Therefore, the method for producing a temperature-sensitive male sterile plant of the present invention is characterized by including a step of artificially suppressing the function of the gene (temperature-sensitive male sterile gene), and more specifically, the following is provided. do.
  • a method for producing a temperature-sensitive male sterile plant which comprises a step of artificially suppressing the function of at least one gene selected from the group consisting of the following (a) to (d) of the plant (a).
  • Gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 1 to 22 (b) One or more amino acids in the amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 1 to 22 Gene encoding a protein consisting of a substituted, deleted, added, and / or inserted amino acid sequence (c) SEQ ID NO:: 60% or more homology with the amino acid sequence according to any one of 1 to 22 Gene encoding an amino acid sequence having (d) SEQ ID NO:: A gene containing a DNA consisting of a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence according to any one of 1 to 22 and a DNA that hybridizes under stringent conditions.
  • temperature-sensitive male sterility means sterility normally when cultivated under the allowable temperature conditions described later, whereas male sterility when cultivated under the temperature limiting conditions described later. It means a fertile trait.
  • the "plant" to which the temperature-sensitive male sterility trait is imparted is not particularly limited as long as it is a plant having the temperature-sensitive male sterility gene described later.
  • Rice plants such as barley, wheat, sorghum, corn, Higanbana plants such as onion, onion) and dicotyledonous plants (eg, white inuna, hakusai, rapeseed), yaseikanran (cabbage, cauliflower, broccoli, etc.) ), Etc.
  • Examples thereof include family plants, basho family plants such as bananas, anthropogenic plants including ambolera family plants (ambolera tricopoda), nude plants, moss plants, and fern plants. Further, it may be a genetically modified organism or a genome editor of these plants (for example, a herbicide-resistant crop, a pest-resistant crop, a disease-resistant crop, a taste-improving crop, a preservation-improving crop, a yield-improving crop).
  • Table 1 shows examples of genes encoding typical amino acid sequences derived from each plant species as "temperature-sensitive male sterile genes" whose functions are suppressed in the present invention.
  • nucleotide sequence is mutated even in nature. And the amino acid encoded by it can be changed accordingly. Therefore, the amino acid according to any one of SEQ ID NOs: 1 to 22 can be imparted to the temperature-sensitive male sterility gene of the present invention by suppressing its function. Also included is a gene encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids have been substituted, deleted, added, and / or inserted in the sequence.
  • plural usually means 50 amino acids or less, preferably 45 amino acids or less, more preferably 40 amino acids or less, still more preferably 35 amino acids or less, more preferably 30 amino acids or less, still more preferably 25 amino acids or less, and more preferably.
  • Within 20 amino acids more preferably within 15 amino acids, more preferably within 10 amino acids (eg, within 9 amino acids, within 8 amino acids, within 7 amino acids, within 6 amino acids), particularly preferably within a few amino acids (eg, within 5 amino acids).
  • nucleotide sequence information of a specific gene can be used to identify the homologous gene from the same species or other plants when a specific gene is obtained. It is possible.
  • Methods for identifying homologous genes include, for example, hybridization techniques (Southern, EM, J. Mol. Biol., 98: 503, 1975) and polymerase chain reaction (PCR) techniques (Saiki, R. et al.). K., et al. Science, 230: 1350-1354, 1985, Saiki, RK et al. Science, 239: 487-491, 1988).
  • hybridization reactions are usually performed under stringent conditions.
  • 6M urea, 0.4% SDS, 0.5xSSC conditions or equivalent stringency hybridization conditions can be exemplified. Isolation of genes with higher homology can be expected by using conditions with higher stringency, such as 6M urea, 0.4% SDS, and 0.1xSSC.
  • the temperature-sensitive male sterility gene of the present invention can be imparted with the trait of temperature-sensitive male sterility by suppressing its function, the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 1 to 22 can be used.
  • a gene containing a DNA consisting of a encoding nucleotide sequence and a DNA that hybridizes under stringent conditions is included.
  • the protein encoded by the identified homologous gene usually has high homology (high similarity), preferably high identity with that encoded by the particular gene.
  • “high” means at least 40% or more, more preferably 50% or more, still more preferably 60% or more, more preferably 70% or more, still more preferably 80% or more, more preferably 85% or more (for example,). 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more).
  • the amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 1 to 22 can be used.
  • a gene encoding an amino acid sequence having 60% or more homology (similarity) or 40% or more identity is included.
  • the homology of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is 65% (identity is 45%) with respect to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14, and the sequence number for the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9 or 44. : 14 has a homology of 73% (identity is 55%).
  • Sequence homology can be determined using a BLAST program (Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990).
  • the program is based on the algorithm BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993) by Karlin and Altschul.
  • BLAST Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993
  • the amino acid sequence is analyzed using the Gapped BLAST program, it can be performed as described in Altschul et al. (Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997).
  • BLAST and Gapped BLAST programs use the default parameters of each program. Specific methods of these analysis
  • the "artificial suppression of the function of the temperature-sensitive male sterile gene" of the present invention includes both complete suppression (inhibition) and partial suppression of the function.
  • the artificial suppression of the activity of the protein encoded by the temperature-sensitive male sterility gene is included. Then, such artificial suppression can be performed, for example, by introducing a mutation into a coding region, a non-coding region, a transcription control region (promoter region), or the like of a temperature-sensitive male sterile gene.
  • the mutation introduced into the temperature-sensitive male sterile gene is not particularly limited as long as the function of the gene is suppressed, and examples thereof include nucleotide substitution, deletion, addition, and / or insertion. , Nonsense mutations, frame shift mutations, null mutations are preferred.
  • the number of mutations introduced into the temperature-sensitive male sterile gene is not particularly limited as long as the function of the gene is suppressed, and may be one, or a plurality (for example, two, three or less, 5). 10 or less, 20 or less, 30 or less, 40 or less, 50 or less) may be used.
  • Such mutations include, for example, as shown in Table 2 below, nucleotide mutations accompanied by alteration or deletion of amino acids (about 33% of the total) after the 53rd position of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. Can be mentioned.
  • nucleotide mutations accompanied by alterations or deletions of amino acids (about 76% of the total) after the 18th or 19th position shown in SEQ ID NO: 14 can be mentioned.
  • nucleotide mutations with alterations or deletions of amino acids (about 70% of the total) after the 24th position shown in SEQ ID NO: 9 or 44 can be mentioned. Then, such a deletion suppresses the function of the temperature-sensitive male sterile gene of the present invention, and a temperature-sensitive male sterile plant can be obtained.
  • a part of the protein expressed by a gene mutation When a part of the protein expressed by a gene mutation is deleted, usually 10% or more of the amino acids may be changed or deleted, preferably 20% or more, more preferably 25% or more, and more. It is preferably 30% or more, more preferably 35% or more, more preferably 40% or more, still more preferably 45% or more, more preferably 50% or more, still more preferably 55% or more, still more preferably 60% or more, still more preferable. Is 65% or more, more preferably 70% or more, still more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more (for example, 96). % Or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more) may be altered or deleted.
  • FIGS. 6 and 7 suggest a region highly conserved in the amino acid sequence encoded by the temperature-sensitive male sterile gene of the present invention, that is, a region important for exerting its function. Therefore, such a storage region is also suitable as a region in which the amino acid sequence is altered or deleted. Examples of the storage region include a region consisting of positions 10 to 75 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or a region corresponding thereto. As shown in FIGS.
  • the corresponding regions include nucleotide and amino acid sequence analysis software (GENETYX-MAC, Sequencer, etc.) and BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).
  • GENETYX-MAC nucleotide and amino acid sequence analysis software
  • BLAST http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/.
  • Introduction of a mutation into a temperature-sensitive male sterile gene can be achieved by a method known to those skilled in the art.
  • a genome editing method a physical mutagenesis method, a method using a chemical mutagen, a method of introducing a transposon or the like into genomic DNA, siRNA, antisense RNA, RNA having ribozyme activity, and the like were used.
  • a method of targeting transcripts but are not limited to methods of targeting transcripts.
  • the genome editing method, the method of targeting a transcript, and the TILLING method described later are preferable from the viewpoint that mutations can be artificially introduced by targeting a temperature-sensitive male sterile gene.
  • Genome editing methods utilize site-specific nucleases (eg, zinc finger nucleases (ZFNs), transcriptional activation-like effector nucleases (TALENs), DNA double-strand break enzymes such as CRISPR-Cas9) to target genes.
  • ZFNs zinc finger nucleases
  • TALENs transcriptional activation-like effector nucleases
  • CRISPR-Cas9 DNA double-strand break enzymes
  • ZFNs US Patent No. 6265196, 8524500, 7888121, European Patent No. 1720995
  • TALENs US Patent No. 8470973, US Patent No. 8586363
  • PPR penentatric protein protein
  • CRISPR-Cas9 US Patent No. 8697359, International Publication No.
  • CRISPR-Cpf1 Zetsche B. et al., Cell, 163 (Zetsche B. et al., Cell, 163) 3): 759-71, (2015)
  • Target-AID K. Nishida et al., Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate advanced CRISPR.
  • Etc. a method using a complex of a guide RNA and a protein can be mentioned.
  • Examples of the physical mutation introduction method include heavy ion beam (HIB) irradiation, fast neutron beam irradiation, gamma ray irradiation, and ultraviolet irradiation (Hayashi et al., Cyclotrons and Their Applications, 2007, 18th International Conference, 237). See pages 239 and Kazama et al., Plant Biotechnology, 2008, Vol. 25, pp. 113-117).
  • HEB heavy ion beam
  • Examples of the method using a chemical mutant include a method of treating seeds and the like with a chemical mutant (see Zwar and Chandler, Planta, 1995, Vol. 197, pp. 39-48, etc.).
  • the chemical mutagen is not particularly limited, but ethylmethane sulfate (EMS), N-ethyl-N-nitrosourea (ENU), N-methyl-N-nitrosourea (MNU), sodium azide, sodium hydrogen sulfite.
  • transposons such as T OS 17, and a method of the T-DNA or the like is inserted into the genomic DNA of a plant (Kumar et al., Trends Plant Sci., 2001 year, 6 Vol. 3, No. 3, pp. 127-134, and Tamara et al., Trends in Plant Science, 1999, Vol. 4, No. 3, pp. 90-96).
  • the mutation has been introduced into the temperature-sensitive male sterile gene by a known method.
  • known methods include a DNA sequencing method (next-generation sequencing method and the like), a PCR method, an analysis method using a microarray, a Southern blotting method, and a Northern blotting method.
  • a DNA sequencing method next-generation sequencing method and the like
  • a PCR method an analysis method using a microarray
  • a Southern blotting method a Northern blotting method.
  • whether or not a mutation has been introduced into a temperature-sensitive male sterile gene can be determined by comparing the sequence or length of the gene before and after the introduction of the mutation.
  • transcription of the temperature-sensitive male sterile gene is performed in plants in which mutations have been introduced into the transcription control region, etc. If a decrease in the expression level of the product or translation product is observed, it can be confirmed that the plant is a plant in which a mutation has been introduced into the temperature-sensitive male sterile gene.
  • TILLING Targeting Induced Local Lesions IN Genomes
  • a non-selective mutation is introduced into the plant genome by using the above-mentioned heavy ion beam irradiation, a chemical mutagen, etc.
  • the temperature-sensitive male sterile gene or a part thereof is amplified by PCR and then said.
  • Individuals having mutations in the amplification product can be selected by the TILLING or the like.
  • the mutation introduced into a gene other than the target gene can be removed.
  • a plant in which the function of the temperature-sensitive male sterility gene is suppressed by introducing a mutation into the temperature-sensitive male sterility gene may be a heterozygote of the temperature-sensitive male sterility gene.
  • a homozygote having a temperature-sensitive male sterile gene into which the mutation has been introduced can be obtained from the F1 plant.
  • the "plant that is a homozygote having the temperature-sensitive male sterility gene into which the mutation has been introduced” contains two alleles of the temperature-sensitive male sterility gene having mutations that are identical to each other.
  • the plant having the first mutation but also the first temperature-sensitive male sterile gene encoding the protein having the first mutation and the activity being suppressed, and the second gene encoding the protein having the second mutation and the activity being suppressed. Included are plants with a temperature-sensitive male sterility gene of 2.
  • dsRNA double-stranded RNA, which is complementary to the transcript of the temperature-sensitive male sterility gene
  • a method using DNA encoding siRNA a method using DNA encoding antisense RNA complementary to a transcript of a temperature-sensitive male sterile gene (antisense DNA), a transcript of a temperature-sensitive male sterile gene
  • antisense DNA a method using DNA encoding antisense RNA complementary to a transcript of a temperature-sensitive male sterile gene
  • a method of targeting a transcript of a temperature-sensitive male sterile gene such as a method using DNA encoding an RNA having ribozyme activity that specifically cleaves (ribozyme method), can also be mentioned.
  • the artificial suppression of the temperature-sensitive male sterile gene function can be performed on various plants, seeds or plant cells according to the above-mentioned methods and the like.
  • Plant cells include cultured cells derived from plants as well as cells in the plant body.
  • various forms of plant-derived cells such as suspension-cultured cells, protoplasts, leaf sections, callus, immature embryos, pollen and the like are included.
  • the above-mentioned site-specific nuclease, fusion protein or DNA encoding a complex of guide RNA and protein, DNA encoding transposon, DNA encoding double-stranded RNA, and antisense RNA are encoded.
  • DNA, DNA encoding RNA having ribozyme activity, or the like may be introduced into plant cells in the form of being inserted into a vector.
  • the vector into which the DNA for artificially suppressing the function of the temperature-sensitive male sterile gene is inserted is not particularly limited as long as the inserted gene can be expressed in plant cells. It may contain a promoter for constitutive or inducible expression of DNA. Examples of the promoter for constitutive expression include a rice ubiquitin promoter, a cauliflower mosaic virus 35S promoter, a rice actin promoter, and a corn ubiquitin promoter. In addition, it is known that promoters for inducible expression are expressed by external factors such as infection or invasion of filamentous fungi, bacteria, and viruses, low temperature, high temperature, drying, irradiation with ultraviolet rays, and spraying of specific compounds. Examples include promoters that have been used. Further, as a promoter for expressing a DNA encoding a short RNA such as a guide RNA or siRNA as the DNA according to the present invention, a U6 promoter or a polIII-based promoter is preferably used.
  • Examples of the method for introducing the DNA or the vector into which the DNA is inserted into a plant cell include a particle gun method, a particle bombardment method, an Agrobacterium-mediated method (Agrobacterium method), a polyethylene glycol method, and electroporation.
  • a perforation method electroporation
  • electroporation Various methods known to those skilled in the art, such as a perforation method (electroporation), can be used.
  • the above-mentioned site-specific nuclease, fusion protein, and transposon can be used as proteins, and the above-mentioned guide RNA, double-stranded RNA, antisense RNA, and RNA having ribozyme activity can be used as RNA.
  • RNA double-stranded RNA, antisense RNA, and RNA having ribozyme activity
  • a temperature-sensitive male sterile plant can be obtained by regenerating a plant from a plant cell in which the gene function is artificially suppressed by the above-mentioned method or the like.
  • a method for producing a transformed plant in rice a method for regenerating a plant by introducing a gene into a protoplast with polyethylene glycol (Datta, SK In Gene Transfer To Plants (Potrykus I and Spangenberg Eds). ) Pp66-74, 1995), a method of introducing a gene into a protoplast by an electric pulse to regenerate a plant (Toki et al. Plant Physiol. 100, 1503-1507, 1992), and a method of directly introducing a gene into a cell by a particle gun method. Then, a method of regenerating a plant (Christou et al.
  • a method for regenerating a sorghum plant for example, a method of regenerating a plant by introducing a gene into an immature embryo or callus by an agrobacterium method or a particle gun method, or polluting using a pollen gene-introduced by ultrasonic waves.
  • the method is preferably used (JA Able et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. 37: 341-348, 2001, AM Casas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 11212-11216, 1993, V.
  • transformation is performed using the method described in Tabei et al. (Edited by Yutaka Tabei, "Transformation Protocol [Plant Edition]", Kagaku Dojin Co., Ltd., published on September 20, 2012). And can be regenerated into plants.
  • thermosensitive male sterile plants and their use By the above-mentioned method or the like, a temperature-sensitive male sterile plant in which the function of the temperature-sensitive male sterile gene of the present invention is artificially suppressed can be obtained. Therefore, the present invention A temperature-sensitive male sterile plant in which the function of at least one gene selected from the group consisting of the following (a) to (d) is artificially suppressed (a) SEQ ID NO: 1 to 22 Gene encoding a protein consisting of the described amino acid sequence (b) SEQ ID NO:: One or more amino acids are substituted, deleted, added, and / or inserted in the amino acid sequence according to any one of 1 to 22.
  • SEQ ID NO: A gene encoding an amino acid sequence having 60% or more homology with the amino acid sequence according to any one of 1 to 22
  • SEQ ID NO: A gene comprising a DNA consisting of a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence according to any one of 1 to 22 and a DNA that hybridizes under stringent conditions is provided.
  • the temperature-sensitive male sterility gene, the artificial suppression of its function, and the plants to which the temperature-sensitive male sterility is imparted by the suppression are as described above, but as the temperature-sensitive male sterility plant of the present invention.
  • the present invention includes offspring and clones of temperature-sensitive male sterile plants, as well as their reproductive materials.
  • the breeding material include seeds, strains, callus, and protoplasts.
  • the temperature-sensitive male sterile plant of the present invention can be used in a method for producing hybrid seeds by a two-system method as shown in FIG. Therefore, the present invention
  • the temperature-sensitive male sterile plant of the present invention is cultivated under a temperature limit, and the plant in the male sterile state is used.
  • “Limited temperature” means a temperature higher than the cultivation temperature (allowable temperature) at which the temperature-sensitive male sterile plant of the present invention can form pollen. Such a limiting temperature and an allowable temperature can be appropriately adjusted by those skilled in the art according to the type of plant and the like.
  • Cultivation under the limit temperature may be carried out using a known cultivation method according to the type of plant and the like.
  • the cultivation period is not particularly limited as long as it includes the period from flower bud formation (flowering) to pollen formation.
  • flower bud means a growth point that has undergone vegetative growth and differentiated into a growth point that undergoes reproductive growth, that is, a primordium of a flower.
  • the formation period varies depending on the type of plant, its variety / lineage, cultivation conditions, etc., but can be determined by a person skilled in the art by a known method (for example, visual inspection).
  • the cultivation under the limit temperature during this period may be continuous (for example, cultivation under the limit temperature day or night), or intermittently (for example, only during the day under the limit temperature). Cultivation in).
  • the "arbitrary plant" to be crossed with the temperature-sensitive male sterile plant of the present invention is not particularly limited as long as it is a plant that maintains male fertility.
  • the temperature-sensitive male sterile plant of the present invention can be used. Are of the same species, but different strains or varieties can be mentioned.
  • the seed thus obtained is a seed of a F1 hybrid (F1), a so-called hybrid, in which the temperature-sensitive male sterile plant of the present invention is used as the mother (maternal line) and any plant is used as the paternal book (paternal line). It becomes a seed. Therefore, in the present invention A hybrid seed is also provided, which is cultivated under a temperature limit and has a male-sterile, temperature-sensitive male-sterile plant of the present invention as a mother plant and an arbitrary plant as a parent plant.
  • F1 hybrid F1 hybrid
  • a hybrid seed is also provided, which is cultivated under a temperature limit and has a male-sterile, temperature-sensitive male-sterile plant of the present invention as a mother plant and an arbitrary plant as a parent plant.
  • Plant cultivation method Rice was cultivated in pots under the normal cultivation conditions (28 ° C. daytime / 22 ° C. night). Flowering was induced under short-day conditions, and cultivation was continued at 28 ° C./22 ° C. at noon or 33 ° C./22 ° C. at night. Pollen formation was observed at the time of heading, and seed fertility was confirmed.
  • Arabidopsis was cultivated in a growth chamber set under continuous light conditions of 21 ° C. After the drawing table, cultivation was continued at 21 ° C. or 27 ° C., and pollen formation and fruiting were observed.
  • the CRISPR / Cas9 method commonly used in plants was used. More specifically, a guide RNA, Cas9, and a vector expressing a hygromycin resistance gene as a selection marker were introduced into the callus of the rice variety "Nihonbare" or the immature embryo of "Hokuriku 193" by the Agrobacterium method. ..
  • the vector is based on pPZP202 and can express guide RNA and Cas9 under the control of the U6 promoter of rice and the ubiquitin promoter of rice, respectively.
  • a regenerated plant was obtained from callus selected for hygromycin resistance, genomic DNA was prepared from the leaves, and the nucleotide sequence of the genome editing part was confirmed. Those with mutations such as single base insertion that shift the codon reading frame were selected. In these mutants, the protein in which this gene functions cannot be expressed, resulting in a gene-deficient state.
  • Geno editing of Arabidopsis thaliana Similar to the above rice, genome editing was performed using the CRISPR / Cas9 method. The gene transfer method is different from that of rice. The commonly used floral dip method was used for transformation of Arabidopsis thaliana.
  • the temperature-sensitive male sterile paddy rice "PL12" was selected and bred from a mutant population of the cultivar "Reimei” by gamma irradiation.
  • pollen is normally formed and bears fruit at a normal cultivation temperature (about 28 ° C.), but pollen hypoplasia occurs at a high temperature (about 33 ° C.) and no fruiting is observed (see FIG. 3).
  • no abnormalities were observed in the vegetative organs such as leaves and the pistil, and it is known that the susceptibility period is several days around 20 days before heading.
  • Example 1 Fine mapping was performed to identify the responsible mutation of the temperature-sensitive male sterile trait, but the range could not be narrowed from about 1.8 Mb near 54 cM. Therefore, whole genome sequence analysis of the original varieties "Reimei” and "PL12” was performed, and both were compared. As a result, it was found that there was a deletion of about 150 kb in the relevant part of chromosome 7 of "PL12".
  • a series of partial deletions was created by introducing double-strand breaks at two locations in the genomic DNA by the CRISPR / Cas9 method using two guide RNAs and removing the DNA fragment between them. More specifically, as shown in FIG. 4, (1) to (2), (2) to (3), (3) to (4) so as to divide the deletion region of about 150 kb into approximately three equal parts. A strain with a partial deletion in the range of) was created. In addition, in order to delete (1) to (2), (2) to (3), and (3) to (4), SEQ ID NOs: 23 and 24, 24 and 25, and 25 and 26 are targeted. Sequenced and CRISPR / Cas9 caused two double chain breaks, respectively.
  • # 592 showed the trait of temperature-sensitive male sterility, and it was considered that there was a responsible mutation in the range of about 10 kb from (3) to (5). From the information in the database, it was predicted that two genes (ORF1 and ORF2 shown in FIG. 4) were present in this region.
  • the amino acid sequence encoded by ORF1 is shown in SEQ ID NO: 1
  • the amino acid sequence encoded by ORF2 is shown in SEQ ID NO: 29.
  • the target sequence in the guide RNA for ORF1 is shown in SEQ ID NO: 30 or 31.
  • the target sequence in the guide RNA for ORF2 is shown in SEQ ID NO: 32. Examples of the obtained mutations are shown in Table 2 for ORF1.
  • the strain # 612 showed the trait of temperature-sensitive male sterility. Furthermore, although not shown in the figure, it is not limited to the representative example of the mutant strain shown in FIG. 5, and it was confirmed that if a frameshift mutation occurs, the trait of temperature-sensitive male sterility is exhibited, and the gene function of ORF1 is deficient. The loss was found to be the responsible mutation of "PL12".
  • This gene is predicted by the ID of LOC_Os07g26794 in the MSU database and by the ID of Os07g0482700 in the RAP-DB, but it is a novel gene of unknown function. This gene is widely conserved in living organisms, especially in plant species. A comparison of the expected amino acid sequences in higher plants is shown in FIG. The conservation of sequences is even higher among grass crops (see Fig. 7). In addition, the temperature-sensitive male sterile gene newly identified in this way was named TMS2.
  • Example 2 The gene-deficient genome editing line was cultivated at an allowable temperature and a limit temperature in comparison with the standard variety "Nihonbare” and the temperature-sensitive male sterile line "PL12" before genome editing, and the state of the flower was observed. As a result, as shown in FIG. 8, pollen was normally formed in the standard variety "Nihonbare” regardless of the temperature. On the other hand, in the temperature-sensitive male sterile line "PL12”, pollen is normally formed at 28 ° C and becomes yellow and full anther, whereas pollen does not develop at 33 ° C and the morphology and color of the anther are abnormal. became. Then, the strain lacking the gene in "Nihonbare” by genome editing showed the phenotype of temperature-sensitive male sterility like "PL12".
  • strains lacking gene function were cultivated at 28 ° C and 33 ° C by genome editing of the rice variety "Nihonbare". As a result, as shown in FIG. 9, the ears were normally fertilized at 28 ° C. and the ears were dripping, whereas at 33 ° C., the ears were standing because they were not fertile.
  • Example 3 Using the practical high-yielding variety of rice “Hokuriku 193" (Indian rice), genome editing was performed in the same manner as in Example 2 ("Nihonbare” (Japanese rice)) to delete the temperature-sensitive male sterile gene. ..
  • the transformation of "Hokuriku No. 193" was carried out with reference to the 2014 Nagoya University degree dissertation, "Study on Rice Transformation Method by Agrobacterium tumefaciens” by Yasuhiro Hiei. Then, the genome editing line derived from "Hokuriku 193" thus obtained was cultivated in a greenhouse set under normal conditions (28 ° C.) or high temperature conditions (35 ° C.), and the formed anthers were observed.
  • Example 4 For the dicotyledonous Arabidopsis thaliana, we also attempted to create a temperature-sensitive male sterile line by deleting the gene. More specifically, genome editing was performed by the CRISPR / Cas9 method to create a strain in which the gene stopped functioning.
  • the target sequence in Arabidopsis thaliana is shown in SEQ ID NO: 33.
  • Table 3 shows examples of the obtained mutations.
  • strains lacking gene function by genome editing of Arabidopsis thaliana were cultivated at 21 ° C and 27 ° C.
  • the pods fertilized normally at 21 ° C. and the length of the pods was the same as that of the wild type, whereas at 27 ° C., the pods did not fertilize and the pods did not grow.
  • the Arabidopsis thaliana also shows the trait related to the temperature-sensitive male sterility. Is confirmed.
  • Example 3 a mating experiment was conducted in Arabidopsis thaliana. As a result, although not shown in the figure, seeds could be obtained. Therefore, it is suggested that the genome editing line can be used for mating in Arabidopsis thaliana without affecting the function of the pistil by suppressing the function of the temperature-sensitive male sterile gene as in the case of the above-mentioned rice.
  • Example 5 In tomato, the genome of the temperature-sensitive male sterile gene was edited and a mutant line was established. Specifically, first, the genome sequence information of the temperature-sensitive male sterile gene of tomato was obtained from EnsenmblePlants. The cDNA (wild type) sequence of the gene is shown in SEQ ID NO: 43. The amino acid sequence of the protein encoded by the cDNA is shown in SEQ ID NO: 9 or 44 (SEQ ID NOs: 9 and 44 show the same amino acid sequence).
  • a vector for genome editing was prepared.
  • a genome editing vector for plant genome editing pEgP237-2A-GFP
  • pEgP237-2A-GFP was sold by a professor at the Department of Penalty, Tokushima University. For more information on the vector, see Ueta et al. (2017) Rapid breeding of parthenocarpic tomato plants using CRISPR / Cas9. Scientific Rep. 7: 507. See.
  • pEgP237-2A-GFP was digested with BsaI and then purified. Then, each of the following oligo DNAs chemically synthesized was mixed in equal amounts, and then subjected to a heat denaturation treatment for annealing. The obtained double-stranded oligo DNA was mixed with pEgP237-2A-GFP digested with BsaI, inserted into the vector, and ligated. Then, it was introduced into Escherichia coli and the vector for genome editing was amplified.
  • the genome editing vector constructed in this manner was transformed into Rhizobium radiobacter (Agrobacterium tumefaciens) GV2260, and further transformed with the tomato variety "Microtome” using the Agrobacterium method.
  • Rhizobium radiobacter Agrobacterium tumefaciens
  • GV2260 Rhizobium radiobacter
  • tomato variety "Microtome” For the transformation method of tomato, see Sun et al. (2006) A Highly Effective Transition Protocol for Micro-Tom, a Model Cultivar for Tomato Functional Genomics. Plant Cell Physiol. See 47: 426-431.
  • the target sequence of the transformant thus obtained was confirmed, and a genome-edited individual was obtained.
  • no individual having a homozygous mutation was obtained. Therefore, self-fertilized seeds were selected, and individuals with fixed mutations were selected from the progeny.
  • the obtained genome-edited individual was raised at room temperature of 23 ° C./18 ° C. (day / night) for 14 hours until before flowering.
  • the temperature was further increased to 30 ° C./28 ° C. (day / night) for 14 hours, and the first flowers were removed. After that, the presence or absence of fruit seeds was confirmed.
  • the obtained results are shown in FIG.
  • FIG. 14 summarizes the amino acid sequences encoded by the temperature-sensitive male sterile genes derived from various plants used in this example and the mutation sites observed in the prepared genome-edited individuals.
  • a temperature-sensitive sterile plant it is possible to produce a temperature-sensitive sterile plant.
  • a temperature-sensitive sterile plant can be produced without requiring special breeding other than suppressing the function of the temperature-sensitive male sterile gene of the present invention.
  • the amino acid sequence of the protein encoded by the temperature-sensitive male sterile gene of the present invention is highly conserved. Therefore, since the line used in the method of the present invention is not limited, it is possible to produce a male sterile line by suppressing the function of this gene in various varieties and lines of various plant species. For example, it can be immediately used for hybrid production simply by suppressing the function of the temperature-sensitive male sterile gene of a useful variety.
  • the present invention is expected to have a great impact on agricultural production, and is an extremely useful technique in the field.

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Abstract

「ＰＬ１２」における温度感受性雄性不稔形質に関与する責任遺伝子を同定し、該遺伝子を標的とする条件雄性不稔植物の製造方法を提供することを目的とし、「ＰＬ１２」とその原品種の全ゲノムシーケンス解析を行い、両者を比較した。その結果、「ＰＬ１２」第７染色体に約１５０ｋｂの欠失があることを明らかにした。そして、この領域に関し、ゲノム編集により６種類の部分欠失系統を作出し、各系統における温度感受性雄性不稔形質の有無を指標として、責任変異が存在する範囲を約１０ｋｂ迄に絞り込むことに成功した。さらに、この領域に座乗する２つの遺伝子の機能をゲノム編集法によって各々破壊した系統を作出した結果、温度感受性雄性不稔形質に関与する責任遺伝子を同定することができた。また、該遺伝子の機能を抑制し、前記イネ同様、シロイヌナズナ及びトマトに前記形質を付与できることを確認した。

Description

温度感受性雄性不稔植物の製造方法
　本発明は、温度感受性雄性不稔植物の製造方法、及びそれによって得られる当該植物に関する。また、本発明は、前記植物を用いたハイブリッド種子の製造方法、及びそれによって得られる当該種子に関する。
　交雑種（ハイブリッド）では、親品種に比較して生育が旺盛で収量や品質が高いといった雑種強勢（ヘテロシス）が得られる。さらに、病害抵抗性遺伝子群等による有用な形質を集積できる点等、ハイブリッド育種のメリットは大きい。野菜や花き類、トウモロコシ等においては、一般に利用されているほぼすべてがハイブリッド品種である。また、中国や米国の稲作でもハイブリッド品種がひろく普及している。
　しかし、ハイブリッド品種は一代限りの品種であるが故に、種子生産のつどに大量の交配作業が必要となり、現状では交配のためにかかる労力と時間・コストがボトルネックとなっている。一般に作物の品種間の交配には、一方の品種の花粉を欠損した状態にして、他方の品種の花粉を付着させることが必要である。現状では、花粉を欠損させるために、手作業でおしべを取り除く（除雄作業）、または、特殊な雄性不稔系統を事前育成する、のいずれかの方法がとられている場合がほとんどである。例えば、トマトやナス等においては雄性不稔系統がないために、ハイブリット種子生産にて手作業での除雄交配が行われている。雄性不稔系統が利用できれば、除雄作業の削減が期待できる。
　雄性不稔系統を利用したハイブリッド種子の主な生産法は、三系法と呼ばれ、父本とする稔性回復系統、母本となる雄性不稔系統、及びその維持系統の３つの系統が必要である（図１　参照）。用いる優良品種に対して、雄性不稔やそれに見合う稔性回復の形質をもたせるための特別な育種が必要となり煩雑であるうえに時間もかかる。それ以上に、利用できる細胞質雄性不稔因子とそれに合致する稔性回復因子が限られた組み合わせしかなく、それらの因子を交配育種によって導入する必要性のために、労力と時間がかかる。ひいては、幅広い遺伝資源を利用することの妨げとなっている。
　そこで、２つの系統だけでハイブリッド種子を作るために（二系法を行なうために）、図２に示すような、条件雄性不稔系統の利用やトランスジェニック系統の利用等が主に検討されている（特許文献１～３、非特許文献１～３）。
　例えば、特定の環境条件下でのみ雄性不稔となるものに、温度感受性雄性不稔がある。これは、温度条件によって、正常な花粉が形成されて稔実する状態と花粉形成不全のため雄性不稔となる状態とを制御できる。このことから、温度条件のみにより自殖と他殖を簡便に切り替えることができ、系統の維持と交雑種の育成との両方がひとつの系統で行えるという大きな利点がある。さらに、花粉形成を高精度に制御できれば蜂等の訪花昆虫を用いた交配等の可能も広がり、採種のさらなる効率化も期待される。よって、広い作物種で温度感受性雄性不稔系統を樹立し、簡便に短期間にハイブリッド育種ができる手法が求められている。
　このような温度感受性雄性不稔系統として、イネにおいては、図３に示す、「レイメイ」を原品種とする「水稲中間母本農１２号」（ＰＬ１２）が報告され、また利用されている（特許文献１、非特許文献１）。しかしながら、この変異体の表現型に関与する責任遺伝子は未だ同定されていない。そのため、「レイメイ」以外の品種や、イネ以外の植物種において、かかる温度感受性雄性不稔系統を作出すること、ひいては二系法を行なってハイブリッド種子を作ることは困難であった。
特開平０２－２０７７２２号公報 特表２０１７－５３５２９４号公報 特表２０１８－５３５６７２号公報
Ｙａｍａｇｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ．１９９７、Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｖｏｌ．４７、３７１－３７３ Ｃｈｕｅａｓｉｒｉ　ｅｔ　ａｌ．２０１４、ＰＬＯＳ　ＯＮＥ、ｖｏｌ．９（９）、ｅ１０６３８６ Ｐｉｔｎｊａｍ　ｅｔ　ａｌ．２００８、Ｐｌａｎｔａ、ｖｏｌ．２２８、８１３－８２２
　本発明は、前記課題に鑑みてなされたものであり、「ＰＬ１２」における温度感受性雄性不稔形質に関与する責任遺伝子を同定し、当該遺伝子を標的とする条件雄性不稔植物の製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、前記目的を達成すべく、先ずファインマッピングを行った。しかし、第７染色体の５４ｃＭ付近の約１．８Ｍｂより範囲を狭めることができなかった。そこで、原品種の「レイメイ」と「ＰＬ１２」の全ゲノムシーケンス解析を行い、両者を比較した。その結果、「ＰＬ１２」の前記約１．８Ｍｂの領域において約１５０ｋｂの欠失があることが判明した。
　次に、図４に示すように、約１５０ｋｂの欠失領域をおよそ３等分し、これら３領域を各々欠失させる系統を、ゲノム編集法により作出した。その結果、これらのうちの１つが、「ＰＬ１２」と同様の表現型を示すことがわかり、候補領域が絞られた。さらに同様にして、前記候補領域を３分割し、これら３領域を各々欠失させる系統を作出し、責任変異が存在する範囲をおよそ１０ｋｂに絞り込むことに成功した。
　そして、データベースの情報から、この１０ｋｂの領域には２つの遺伝子（図４に示す、ＯＲＦ１とＯＲＦ２）が存在すると予想されたため、ゲノム編集により、各々の遺伝子機能を破壊した。その結果、ＯＲＦ１の欠失によって、温度感受性雄性不稔の形質が発揮されたため、当該遺伝子が「ＰＬ１２」における温度感受性雄性不稔形質に関与する責任遺伝子（以下「温度感受性雄性不稔遺伝子」とも称する）であることが遂に明らかとなった。
　さらに、当該遺伝子の機能をゲノム編集により抑制した結果、双子葉植物のシロイヌナズナ及びトマトでも同様の温度感受性雄性不稔の形質が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。したがって、本発明は以下を提供するものである。
　すなわち、本発明は、温度感受性雄性不稔植物の製造方法、及びそれによって得られる当該植物に関する。また、本発明は、前記植物を用いたハイブリッド種子の製造方法、及びそれによって得られる当該種子に関し、より具体的には以下を提供する。
＜１＞　温度感受性雄性不稔植物の製造方法であって、植物の、下記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子の機能を人為的に抑制する工程を含む、方法
（ａ）配列番号：１～２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｂ）配列番号：：１～２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｃ）配列番号：：１～２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子
（ｄ）配列番号：１～２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子。
＜２＞　下記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子の機能が人為的に抑制された、温度感受性雄性不稔植物
（ａ）配列番号：１～２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｂ）配列番号：：１～２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｃ）配列番号：：１～２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子
（ｄ）配列番号：１～２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子。
＜３＞　ハイブリッド種子の製造方法であって、
　制限温度下で栽培し、雄性不稔とした、＜２＞に記載の温度感受性雄性不稔植物を、任意の植物と他家受粉させる工程、及び
　前記温度感受性雄性不稔植物から種子を回収する工程を、
含む方法。
＜４＞　制限温度下で栽培し、雄性不稔とした、＜２＞に記載の温度感受性雄性不稔植物を母本とし、任意の植物を父本とする、ハイブリッド種子。
　本発明によれば、温度感受性不稔植物を製造することが可能となる。特に、本発明の温度感受性雄性不稔遺伝子の機能を抑制すること以外に、特別な育種を必要とせず、温度感受性不稔植物を製造することができる。
　また、図６及び７に示すとおり、本発明の温度感受性雄性不稔遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は高度に保存されている。この遺伝子は、最も原始的な被子植物であるアムボレラ目にも存在することから、少なくとも被子植物に共通に存在する遺伝子であることがわかる。したがって、原則的にあらゆる農作物で本遺伝子を利用できると考えられる。このように、本発明の方法において、用いる系統は限定されないため、様々な植物種の様々な品種・系統で、この遺伝子の機能を抑制させることにより雄性不稔系統の作出が可能となる。
　そして、得られた温度感受性雄性不稔植物を母本として、父本とする他の系統とともに、制限温度下で栽培することにより、これら２系統が交雑したハイブリッド種子を簡便に得ることができる。
ハイブリッド種子の製造方法として用いられる、三系法の概要を示す、図である。 ハイブリッド種子の製造方法として用いられる、二系法の概要を示す、図である。「α」は温度等の環境条件によって雄性不稔となる系統を示し、「β」は任意の品種・系統を示す。 「ＰＬ１２」の表現型を示す、写真である。許容温度（２８℃）と制限温度（３３℃）における開花期の穎花の実体像（上）と葯の染色像（下）を示す。 「ＰＬ１２」の責任因子同定の経緯を示す、概要図である。先ず、（１）～（６）の部位にガイドＲＮＡを設計した。温度感受性雄性不稔系統「ＰＬ１２」のゲノムの欠失領域をスタートとして、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により２ヶ所の二重鎖切断の間を欠失させる方法で、部分欠失を持つ系統を作出した。その表現型が「ＰＬ１２」と同様になるような候補領域を順次狭めた。（３）から（４）の間を欠失する＃５７１の系統が温度感受性雄性不稔の形質をもつことがわかったので、その内部を細分化して解析を進め、（３）から（５）の間に候補が絞られた。この領域内には、ＯＲＦ１とＯＲＦ２の２つがあり、それぞれのＯＲＦを欠損するような変異を導入した。なお、図中、系統名に下線が付してあるものは、温度感受性雄性不稔の形質を有する系統である。 図４に示した、部分欠失を持つ各系統の、許容温度（２８℃）と制限温度（３３℃）における開花期の穎花の実体像（各代表例）を示す、写真である。図中、下線を付した＃５７１、＃５９２、＃６１２の系統が温度感受性雄性不稔の形質を示した。 本発明の温度感受性雄性不稔遺伝子がコードするアミノ酸配列を、各植物種間で比較したアライメントを示す。高等植物のデータベースの情報を元に、ＯＲＦを予測してアミノ酸配列に翻訳し比較した。ＱＩＡＧＥＮ社ＣＬＣソフトウェアを用いて配列解析を行った。 本発明の温度感受性雄性不稔遺伝子がコードするアミノ酸配列を、イネ科作物間で比較したアライメントを示す。イネ科作物のデータベースの情報を元に、ＯＲＦを予測してアミノ酸配列に翻訳し比較した。ＱＩＡＧＥＮ社ＣＬＣソフトウェアを用いて配列解析を行った。 イネのゲノム編集系統等の表現型(代表例）を示す写真である。「ＰＬ１２」は、２８℃では正常に花粉が形成されて黄色く充実した葯となるのに対し、３３℃では花粉が発達せず、葯の形態や色が異常となる。標準品種「日本晴」では、温度によらず正常に花粉が形成される。ゲノム編集により「日本晴」において当該遺伝子を欠損した系統は、「ＰＬ１２」と同様に温度感受性雄性不稔の表現型を示す。 イネのゲノム編集系統等の外観(代表例）を示す写真である。イネ品種「日本晴」のゲノム編集により遺伝子機能が欠失した系統を２８℃（左）と３３℃（右）で栽培した。２８℃では正常に稔実して穂が垂れているのに対し、３３℃では稔らないために穂が立った状態になっている。 「日本晴」及び「北陸１９３号」各々のゲノム編集系統等の外観（代表例）を示す写真である。「北陸１９３号」由来ゲノム編集系統においても、「日本晴」由来ゲノム編集系統と同様に、通常条件では花粉が形成され葯が発達するが、高温条件では花粉形成不全のため雄性不稔となる。 （１）「オオナリ」、（２）「北陸１９３号」由来ゲノム編集系統、（３）高温で栽培した「北陸１９３号」由来ゲノム編集系統に「オオナリ」の花粉をかけて得られた個体、のそれぞれからゲノムＤＮＡを精製し、本発明の温度感受性雄性不稔遺伝子の変異挿入部位の塩基配列を解析した結果を示す図である。下記に示すとおり、（３）では、（１）と（２）のゲノム配列のヘテロ対合体になっており、（１）と（２）の交配によりハイブリッドが得られたことを示す。（１）ＡＣＧＣＴＣＴＴＧＣＧＧＡＡＧＡ　（配列番号：３４）　野生型、（２）ＡＣＧＣＴＣＴＴＴＧＣＧＧＡＡＧＡ　（配列番号：３５）　１塩基Ｔ挿入、（３）ＡＣＧＣＴＣＴＴ（Ｔ／Ｇ）（Ｇ／Ｃ）（Ｃ／Ｇ）Ｇ（Ｇ／Ａ）Ａ（Ａ／Ｇ）（Ｇ／Ａ）　（配列番号：３６）　１塩基Ｔ挿入／野生型。 シロイヌナズナのゲノム編集系統の外観(代表例）を示す写真である。シロイヌナズナのゲノム編集により遺伝子機能が欠失した系統を２１℃（上）と２７℃（下）で栽培した。２１℃では正常に稔実して莢の長さも野生型と変わらないのに対し、２７℃では稔実せず莢が伸長しない。 トマトのゲノム編集系統を野生型と共に高温条件（昼３０℃/夜２８℃）で栽培し、得られた果実内に種子が形成されているかを判定した結果を示す写真である。図中、上段は植物個体に果実がなっている様子、下段は果実を半分に割った状態の写真である。種子がある果実を点線で、種子のない果実を実線で囲んで示している。図中「ＴＭＳ２」は本発明の温度感受性雄性不稔遺伝子を意味する（配列番号：４３及び４４　参照）。６塩基欠失変異をもつ系統では該当部位の２アミノ酸の欠失が起こるものの（配列番号：４５及び４６　参照）、なお機能を有するタンパク質が形成されると考えられ、種子形成において野生型と差が見られない。対して、フレームシフトによりタンパク質機能が欠損すると推定される５塩基欠失変異（配列番号：４７及び４８　参照）をもつ系統では、高温条件では種子ができないことが示された。 イネ、トマト及びシロイヌナズナの各々に由来する温度感受性雄性不稔遺伝子がコードするアミノ酸配列と、後述の実施例にて作製したゲノム編集個体における変異箇所と示す、概略図である。図中（ｉ）及び（ii）はイネでの変異導入部位（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で二重鎖切断を導入した位置）を示し、（iii)はシロイヌナズナでの変異導入部位を示し、（iv）及び（ｖ）はトマトでの変異導入部位を示す。
　（温度感受性雄性不稔植物の製造方法）
　後述の実施例に示すとおり、本発明者らは、温度感受性雄性不稔系統である「水稲中間母本農１２号」（ＰＬ１２）の表現型に関与する責任遺伝子を明らかにした。さらに、野生型のイネ、シロイヌナズナ及びトマトにおいて、当該遺伝子の機能をゲノム編集法により抑制することにより、これら植物に温度感受性雄性不稔形質を付与することにも成功した。したがって、本発明の温度感受性雄性不稔植物の製造方法は、前記遺伝子（温度感受性雄性不稔遺伝子）の機能を人為的に抑制する工程を含むことを特徴とし、より具体的には以下を提供する。
　温度感受性雄性不稔植物の製造方法であって、植物の、下記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子の機能を人為的に抑制する工程を含む、方法
（ａ）配列番号：１～２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｂ）配列番号：：１～２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｃ）配列番号：：１～２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子
（ｄ）配列番号：１～２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子。
　本発明において、「温度感受性雄性不稔」とは、後述の許容温度条件下で栽培した場合には正常に稔実するのに対し、後述の制限温度条件下にて栽培した際に、雄性不稔となる形質を意味する。
　本発明において、温度感受性雄性不稔形質を付与の対象となる「植物」としては、後述の温度感受性雄性不稔遺伝子を有する植物であれば特に制限はなく、例えば、単子葉植物（例えば、イネ、オオムギ、コムギ、ソルガム、トウモロコシ等のイネ科植物、タマネギ、ネギ等のヒガンバナ科植物）及び双子葉植物（例えば、シロイヌナズナ、ハクサイ、セイヨウアブラナ（ナタネ）、ヤセイカンラン（キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー等の原種）等のアブラナ科植物、トマト、バレイショ等のナス科植物、レタス、ヒマワリ等のキク科植物、ダイズ等のマメ科植物、キュウリ等のウリ科植物、ニンジン等のセリ科植物、リンゴ等のバラ科植物、バナナ等のバショウ科植物、アムボレラ科植物（アムボレラ・トリコポダ））を含む被子植物、裸子植物、コケ植物、シダ植物が挙げられる。さらに、これら植物の遺伝子組み換え体やゲノム編集体（例えば、除草剤耐性作物、害虫耐性作物、病害耐性作物、食味向上作物、保存性向上作物、収量向上作物）であっても良い。
　本発明において機能抑制の対象となる「温度感受性雄性不稔遺伝子」として、各植物種由来の、典型的なアミノ酸配列をコードする遺伝子の例は、下記表１に示すとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　なお、自然界においてもヌクレオチド配列が変異することは起こり得ることである。そして、それに伴いコードするアミノ酸も変化し得る。したがって、本発明の温度感受性雄性不稔遺伝子には、その機能が抑制されることによって温度感受性雄性不稔の形質を付与し得る限り、配列番号：1～２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。
　ここで「複数」とは、通常５０アミノ酸以内、好ましくは４５アミノ酸以内、より好ましくは４０アミノ酸以内、さらに好ましくは３５アミノ酸以内、より好ましくは３０アミノ酸以内、さらに好ましくは２５アミノ酸以内、より好ましくは２０アミノ酸以内、さらに好ましくは１５アミノ酸以内、より好ましくは１０アミノ酸以内（例えば、９アミノ酸以内、８アミノ酸以内、７アミノ酸以内、６アミノ酸以内）、特に好ましくは数個のアミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、４アミノ酸以内、３アミノ酸以内、２アミノ酸以内）である。
　さらに、現在の技術水準においては、当業者であれば、特定の遺伝子が得られた場合、その遺伝子のヌクレオチド配列情報を利用して、同種若しくは他の植物から、その相同遺伝子を同定することが可能である。相同遺伝子を同定するための方法としては、例えば、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３，１９７５）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３５０－１３５４，１９８５、Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７－４９１，１９８８）が挙げられる。相同遺伝子を同定するためには、通常、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件としては、６Ｍ　尿素、０．４％　ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣの条件又はこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を例示できる。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ　尿素、０．４％ＳＤＳ、０．１ｘＳＳＣの条件を用いれば、より相同性の高い遺伝子の単離を期待することができる。本発明の温度感受性雄性不稔遺伝子には、その機能が抑制されることによって温度感受性雄性不稔の形質を付与し得る限り、配列番号：１～２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子が含まれる。
　同定された相同遺伝子がコードするタンパク質は、通常、前記特定の遺伝子がコードするそれと高い相同性（高い類似性）、好ましくは高い同一性を有する。ここで「高い」とは、少なくとも４０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上（例えば、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）のことである。本発明の温度感受性雄性不稔遺伝子には、その機能が抑制されることによって温度感受性雄性不稔の形質を付与し得る限り、配列番号：1～２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性（類似性）又は４０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子が含まれる。なお、配列番号：１に記載のアミノ酸配列に対する配列番号：１４に記載のそれの相同性は６５％（同一性は４５％）であり、配列番号：９又は４４に記載のアミノ酸配列に対する配列番号：１４に記載のそれの相同性は７３％（同一性は５５％）である。
　配列の相同性は、ＢＬＡＳＴのプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３－４１０，１９９０）を利用して決定することができる。該プログラムは、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２６４－２２６８，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３－５８７７，１９９３）に基づいている。例えば、ＢＬＡＳＴによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。また、Ｇａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９９７）に記載されているように行うことができる。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
　本発明の「温度感受性雄性不稔遺伝子の機能の人為的抑制」には、該機能の完全な抑制（阻害）及び部分的な抑制の双方が含まれる。また、温度感受性雄性不稔遺伝子の発現の人為的抑制の他、温度感受性雄性不稔遺伝子がコードするタンパク質の活性の人為的抑制が含まれる。そして、かかる人為的抑制は、例えば、温度感受性雄性不稔遺伝子のコード領域、非コード領域、転写制御領域（プロモーター領域）等に変異を導入することによって行なうことができる。
　本発明において、温度感受性雄性不稔遺伝子に導入される変異としては、該遺伝子の機能を抑制する限り特に制限はなく、例えば、ヌクレオチドの置換、欠失、付加、及び／又は挿入が挙げられるが、ナンセンス変異、フレームシフト変異、ヌル変異が好ましい。また、温度感受性雄性不稔遺伝子に導入される変異の個数としても、該遺伝子の機能を抑制する限り特に制限はなく、１個でもよく、また複数個（例えば、２個、３個以下、５個以下、１０個以下、２０個以下、３０個以下、４０個以下、５０個以下）でもよい。
　このような変異としては、例えば、後述の表２に示すように、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の５３位以降のアミノ酸（全体の約３３％）の変更又は欠失を伴うヌクレオチド変異が挙げられる。また、後述の表３に示すように、配列番号：１４に記載の１８位又は１９位以降のアミノ酸（全体の約７６％）の変更又は欠失を伴うヌクレオチド変異が挙げられる。さらに、配列番号：９又は４４に記載の２４位以降のアミノ酸（全体の約７０％）の変更又は欠失を伴うヌクレオチド変異が挙げられる。そして、このような欠失により、本発明の温度感受性雄性不稔遺伝子の機能は抑制され、温度感受性雄性不稔植物を得ることができる。
　したがって、温度感受性雄性不稔遺伝子に導入される変異としては、当該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列全部を失わせる必要はなく、その一部が失われるか変化するように当該遺伝子内に導入されてもよい。
　なお、遺伝子の変異により発現するタンパク質の一部が欠失する場合、通常、全体の１０％以上のアミノ酸が変更又は欠失すればよく、好ましくは２０％以上、さらに好ましくは２５％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは３５％以上、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは４５％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは５５％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）が変更又は欠失していればよい。
　このようにアミノ酸配列が変更又は欠失する領域としては、後述の実施例に示すとおり、Ｃ末領域が好ましい。また、図６及び７において、本発明の温度感受性雄性不稔遺伝子がコードするアミノ酸配列において高度に保存されている領域、すなわちその機能を発揮する上で重要な領域が示唆される。したがって、かかる保存領域も、アミノ酸配列が変更又は欠失する領域として好適である。保存領域としては、例えば、配列番号：１に記載のアミノ酸配列における１０～７５位からなる領域、又はそれに対応する領域が挙げられる。なお、対応する領域とは、図６、７及び１４に示すように、ヌクレオチド及びアミノ酸配列解析ソフトウェア（ＧＥＮＥＴＹＸ－ＭＡＣ、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ等）やＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を利用し、配列番号：１に記載のアミノ酸配列と、他の植物に由来するアミノ酸配列（例えば、配列番号：２～２１）とを整列させた際に、配列番号：１に記載のアミノ酸配列における前記領域と同列になる領域のことである。
　温度感受性雄性不稔遺伝子への変異の導入は、当業者であれば公知の変異導入方法により達成することができる。かかる公知の方法としては、ゲノム編集法、物理的変異導入法、化学的変異剤を用いる方法、トランスポゾン等をゲノムＤＮＡに導入する方法、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ及びリボザイム活性を有するＲＮＡ等を用いた、転写産物を標的とする方法が挙げられるが、これらに限定はされない。
　これらの中で、温度感受性雄性不稔遺伝子を標的として人為的に変異を導入できるという観点から、ゲノム編集法、転写産物を標的とする方法、後述のＴＩＬＬＩＮＧ法が好ましい。
　ゲノム編集法は、部位特異的なヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９等のＤＮＡ二本鎖切断酵素）を利用して、標的遺伝子を改変する方法である。例えば、ＺＦＮｓ（米国特許６２６５１９６号、８５２４５００号、７８８８１２１号、欧州特許１７２０９９５号）、ＴＡＬＥＮｓ（米国特許８４７０９７３号、米国特許８５８６３６３号）、ヌクレアーゼドメインが融合されたＰＰＲ（ｐｅｎｔａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅｒｅｐｅａｔ）（Ｎａｋａｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　５３：１１７１－１１７９（２０１２））等の融合タンパク質や、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９（米国特許８６９７３５９号、国際公開２０１３／１７６７７２号）、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１（Ｚｅｔｓｃｈｅ　Ｂ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６３（３）：７５９－７１，（２０１５））やＴａｒｇｅｔ－ＡＩＤ（Ｋ．Ｎｉｓｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｕｓｉｎｇ　ｈｙｂｒｉｄ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ａｎｄ　ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　ａｄａｐｔｉｖｅ　ｉｍｍｕｎｅ　ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｆ８７２９，（２０１６））等のガイドＲＮＡとタンパク質の複合体を用いる方法が挙げられる。
　物理的変異導入法としては、例えば、重イオンビーム（ＨＩＢ）照射、速中性子線照射、ガンマ線照射、紫外線照射が挙げられる（Ｈａｙａｓｈｉら、Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅｉｒ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２００７年、第１８回国際会議、２３７～２３９ページ、及び、Ｋａｚａｍａら、Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００８年、２５巻、１１３～１１７ページ　参照）。
　化学的変異剤を用いる方法としては、例えば、化学変異剤によって種子等を処理する方法（Ｚｗａｒ及びＣｈａｎｄｌｅｒ、Ｐｌａｎｔａ、１９９５年、１９７巻、３９～４８ページ等　参照）が挙げられる。化学変異剤としては特に制限はないが、エチルメタンスルホート（ＥＭＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－ニトロソウレア（ＥＮＵ）、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソウレア（ＭＮＵ）、アジ化ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、ヒドリキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトログアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、Ｏ－メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、蟻酸及びヌクレオチド類似体が挙げられる。
　トランスポゾン等をゲノムＤＮＡに導入する方法としては、例えば、ＴＯＳ１７等のトランスポゾン、Ｔ－ＤＮＡ等を植物のゲノムＤＮＡに挿入する方法が挙げられる（Ｋｕｍａｒら、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ．、２００１年、６巻、３号、１２７～１３４ページ、及び、Ｔａｍａｒａら、Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９年、４巻、３号、９０～９６ページ　参照）。
　以上の方法により変異が導入された植物については、公知の方法により、温度感受性雄性不稔遺伝子に変異が導入されていることを確認することができる。かかる公知の方法としては、例えば、ＤＮＡシークエンス法（次世代シークエンシング法等）、ＰＣＲ法、マイクロアレイを用いた解析法、サザンブロット法、ノーザンブロット法が挙げられる。かかる方法によれば、温度感受性雄性不稔遺伝子に変異が導入されているか否かを、変異導入前後の当該遺伝子の配列又は長さを比較することによって判断することができる。また、ノーザンブロット法、ＲＴ－ＰＣＲ法、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、マイクロアレイによる解析法等を利用することにより、転写制御領域等に変異が導入された植物において、温度感受性雄性不稔遺伝子の転写産物又は翻訳産物の発現量の低下が認められれば、該植物は温度感受性雄性不稔遺伝子に変異が導入された植物であると確認することもできる。
　また、温度感受性雄性不稔遺伝子に変異が導入されていることを確認する他の方法として、ＴＩＬＬＩＮＧ（標的誘導型ゲノム特定位傷害、Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　Ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｌｏｃａｌ　Ｌｅｓｉｏｎｓ　ＩＮ　Ｇｅｎｏｍｅｓ）が挙げられる（Ｓｌａｄｅら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｒｅｓ．、２００５年、１４巻、１０９～１１５ページ、及び、Ｃｏｍａｉら、Ｐｌａｎｔ　Ｊ．、２００４年、３７巻、７７８～７８６ページ　参照）。特に、前述の重イオンビーム照射や化学的変異剤等を用いて植物ゲノム中に非選択的変異を導入した場合には、温度感受性雄性不稔遺伝子又はその一部をＰＣＲで増幅した後に、該増幅産物に変異を有する個体を、前記ＴＩＬＬＩＮＧ等により選抜することができる。
　また、上述の方法により変異が導入された植物と野生型の植物とを交配させ、戻し交配を行うことにより、目的とする遺伝子以外の遺伝子に導入された変異を除去することもできる。
　温度感受性雄性不稔遺伝子に変異を導入することにより当該遺伝子の機能が抑制された植物が、温度感受性雄性不稔遺伝子のヘテロ接合体（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅ）である場合がある。そのような場合、例えば、かかるヘテロ接合体同士を交配してＦ１植物体を得ることにより、当該Ｆ１植物体から当該変異が導入された温度感受性雄性不稔遺伝子を有するホモ接合体（ｈｏｍｏｚｙｇｏｔｅ）を選抜する。この場合、「当該変異が導入された温度感受性雄性不稔遺伝子を有するホモ接合体である植物」には、互いに同一である変異を有する温度感受性雄性不稔遺伝子の対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）を２つ有する植物だけでなく、第１の変異を有し活性が抑制されたタンパク質をコードする第１の温度感受性雄性不稔遺伝子と、第２の変異を有し活性が抑制されたタンパク質をコードする第２の温度感受性雄性不稔遺伝子とを有する植物が含まれる。
　本発明において、温度感受性雄性不稔遺伝子の機能を人為的に抑制するための方法として、上述の変異導入の他、温度感受性雄性不稔遺伝子の転写産物と相補的なｄｓＲＮＡ（二重鎖ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡ）をコードするＤＮＡを用いる方法、温度感受性雄性不稔遺伝子の転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ（アンチセンスＤＮＡ）を用いる方法、温度感受性雄性不稔遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ用いる方法（リボザイム法）といった、温度感受性雄性不稔遺伝子の転写産物を標的とする方法も挙げられる。
　本発明において、温度感受性雄性不稔遺伝子機能の人為的な抑制は、上述の方法等に応じ、種々の植物体、種子又は植物細胞に対して行うことができる。植物細胞には、植物由来の培養細胞の他、植物体中の細胞も含まれる。さらに、種々の形態の植物由来の細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルス、未熟胚、花粉等が含まれる。
　また、本発明において、上述の、部位特異的ヌクレアーゼ、融合タンパク質又はガイドＲＮＡとタンパク質の複合体をコードするＤＮＡ、トランスポゾンをコードするＤＮＡ、二重鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ、リボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ等を、ベクターに挿入した形態にて植物の細胞に導入してもよい。
　温度感受性雄性不稔遺伝子の機能を人為的に抑制するための前記ＤＮＡが挿入されるベクターとしては、植物細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はないが、前記ＤＮＡを恒常的又は誘導的に発現させるためのプロモーターを含有しうる。恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、イネのユビキチンプロモーター、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター、イネのアクチンプロモーター、トウモロコシのユビキチンプロモーター等が挙げられる。また、誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布等の外因によって発現することが知られているプロモーター等が挙げられる。さらに、本発明にかかるＤＮＡとしてガイドＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等の短いＲＮＡをコードするＤＮＡを発現させるためのプロモーターとしては、Ｕ６プロモーター、ｐｏｌIII系のプロモーターが好適に用いられる。
　植物細胞へ前記ＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されたベクター等を導入する方法としては、例えば、パーティクルガン法、パーティクルボンバードメント法、アグロバクテリウムを介する方法（アグロバクテリウム法）、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）等、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。
　なお、ＤＮＡの形態をとらずとも、上述の、部位特異的ヌクレアーゼ、融合タンパク質、トランスポゾンは、タンパク質として、上述の、ガイドＲＮＡ、二重鎖ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム活性を有するＲＮＡは、ＲＮＡとして、植物細胞に導入しても、変異を導入することはできる。
　また、上述の方法等により遺伝子の機能が人為的に抑制された植物細胞から植物体を再生することにより、温度感受性雄性不稔植物を得ることができる。
　例えば、イネにおいて、形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｋ．Ｉｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｔｏ　Ｐｌａｎｔｓ（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ　Ｉ　ａｎｄ　Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ　Ｅｄｓ．）ｐｐ６６－７４，１９９５）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Ｔｏｋｉ　ｅｔ　ａｌ．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００，１５０３－１５０７，１９９２）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ　ｅｔ　ａｌ．Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９５７－９６２，１９９１）及びアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Ｈｉｅｉ　ｅｔ　ａｌ．Ｐｌａｎｔ　Ｊ．６：２７１－２８２，１９９４）等、いくつかの技術が既に確立し、本発明の技術分野において広く用いられている。
　シロイヌナズナであれば、フローラルディップ法（Ｃｌｏｕｇｈ　ＳＪ　＆　Ｂｅｎｔ　ＡＦ，Ｐｌａｎｔ　Ｊ　１６：７３５－７４３，１９９８）、Ａｋａｍａら（Ａｋａｍａ　ｅｔ　ａｌ．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　１２：７－１１，１９９２）の方法が挙げられ、本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
　また、ムギに関する形質転換植物体を作出する手法としては、Ｔｉｎｇａｙら（Ｔｉｎｇａｙ　Ｓ．ｅｔ　ａｌ．Ｐｌａｎｔ　Ｊ．１１：１３６９－１３７６，１９９７）、Ｍｕｒｒａｙら（Ｍｕｒｒａｙ　Ｆ　ｅｔ　ａｌ．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔ　２２：３９７－４０２，２００４）、及びＴｒａｖａｌｌａら（Ｔｒａｖａｌｌａ　Ｓ　ｅｔ　ａｌ．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔ　２３：７８０－７８９，２００５）に記載された方法を挙げることができる。
　ソルガム植物体を再生させる方法としては、例えば、アグロバクテリウム法やパーティクルガン法により、未熟胚やカルスに遺伝子導入して植物体を再生させる方法、超音波によって遺伝子導入した花粉を用いて受粉する方法が好適に用いられる（Ｊ．Ａ．Ａｂｌｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３７：３４１－３４８，２００１、Ａ．Ｍ．Ｃａｓａｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：１１２１２－１１２１６，１９９３、Ｖ．Ｇｉｒｉｊａｓｈａｎｋａｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ　２４：５１３－５２２，２００５、Ｊ．Ｍ．ＪＥＯＵＮＧ　ｅｔ　ａｌ．，Ｈｅｒｅｄｉｔａｓ　１３７：２０－２８，２００２、Ｖ　Ｇｉｒｉｊａｓｈａｎｋａｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ　２４（９）：５１３－５２２，２００５、Ｚｕｏ－ｙｕ　Ｚｈａｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　４４：７８９－７９８，２０００、Ｓ．Ｇｕｒｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ　２８（３）：４２９－４４４，２００９、ＺＹ　Ｚｈａｏ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，　３４３：２３３－２４４，２００６、ＡＫ　Ｓｈｒａｗａｔ　ａｎｄ　Ｈ　Ｌｏｒｚ，Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｊ，４（６）：５７５－６０３，２００６、Ｄ　Ｓｙａｍａｌａ　ａｎｄ　Ｐ　Ｄｅｖｉ　Ｉｎｄｉａｎ　Ｊ　Ｅｘｐ　Ｂｉｏｌ，４１（１２）：１４８２－１４８６，２００３、Ｚ　Ｇａｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｊ，３（６）：５９１－５９９，２００５）。
　トウモロコシであればＳｈｉｌｌｉｔｏら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　７：５８１，１９８９）に記載された方法やＧｏｒｄｅｎ－Ｋａｍｍら（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　２：６０３，１９９０）に記載された方法が挙げられる。
　トマトであればＭａｔｓｕｋｕｒａら（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．，４４：１８３７－１８４５，１９９３）に記載された方法が挙げられる。
　ダイズであれば、特許公報（米国特許第５，４１６，０１１号）に記載された方法が挙げられる。
　バレイショであればＶｉｓｓｅｒら（Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ，７８：５９４，１９８９）に記載された方法が挙げられる。
　また、その他の植物であっても、Ｔａｂｅｉら（田部井豊　編、「形質転換プロトコール［植物編］」、株式会社化学同人、２０１２年９月２０日出版）に記載に方法等を用い、形質転換及び植物体への再生を行なうことができる。
　（温度感受性雄性不稔植物、及びその利用）
　上述の方法等により、本発明の温度感受性雄性不稔遺伝子の機能が人為的に抑制された、温度感受性雄性不稔植物を得ることができる。したがって、本発明は、
　下記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子の機能が人為的に抑制された、温度感受性雄性不稔植物
（ａ）配列番号：１～２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｂ）配列番号：：１～２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｃ）配列番号：：１～２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子
（ｄ）配列番号：１～２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子
を提供する。
　なお、温度感受性雄性不稔遺伝子、その機能の人為的抑制、該抑制によって温度感受性雄性不稔が付与される植物等については、上述のとおりであるが、本発明の温度感受性雄性不稔植物としては、「ＰＬ１２」（水稲中間母本農１２号）を除いた植物であることが好ましく、本発明の温度感受性雄性不稔遺伝子の機能が人為的に抑制された「レイメイ」を、除いた植物であることがより好ましい。
　また、一旦、温度感受性雄性不稔遺伝子の機能が人為的に抑制されている植物体が得られれば、該植物体から有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることが可能である。さらに、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、切穂、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。したがって本発明には、温度感受性雄性不稔植物の子孫及びクローン、並びに、それらの繁殖材料が含まれる。なお、繁殖材料としては、例えば、種子、株、カルス、プロトプラストが挙げられる。
　また、本発明の温度感受性雄性不稔植物は、図２に示すような、２系法によるハイブリッド種子の製造法に利用し得る。したがって、本発明は、
　制限温度下で栽培し、雄性不稔とした、請求項２に記載の温度感受性雄性不稔植物を、任意の植物と他家受粉させる工程、及び
　前記温度感受性雄性不稔植物から種子を回収する工程を、
含む、ハイブリッド種子の製造方法も提供する。
　本発明のハイブリッド種子の製造においては、本発明の温度感受性雄性不稔植物を、制限温度下にて栽培し、雄性不稔状態にある植物を用いる。
　「制限温度」とは、本発明の温度感受性雄性不稔植物が花粉を形成することのできる栽培温度（許容温度）よりも高い温度を意味する。かかる、制限温度及び許容温度は、植物の種類等に応じ、当業者であれば適宜調整することができる。
　また、制限温度下での栽培は、植物の種類等に応じた公知の栽培方法を用いて行なえばよい。また、その栽培期間としては花芽形成（花成）から花粉形成の期間を含んでいれば特に制限はない。なお、「花芽」とは栄養生長を行なってきた成長点が生殖生長を行なう成長点に分化したもの、つまり花の原基を意味する。前記形成期間は、植物の種類、その品種・系統、栽培条件等によって異なるが、当業者であれば公知の手法（例えば、目視）にて判断することができる。また、かかる期間における制限温度下での栽培は連続的なもの（例えば、昼夜を問わず、制限温度下での栽培）であってもよく、また間欠的なもの（例えば、昼のみ制限温度下での栽培）であってもよい。
　本発明の温度感受性雄性不稔植物と交配させる「任意の植物」としては、雄性の稔性を維持している植物であれば特に制限はなく、例えば、本発明の温度感受性雄性不稔植物とは同種であって、異なる系統又は品種が挙げられる。
　本発明の温度感受性雄性不稔植物と任意の植物との「他家受粉」、及びそれによって形成される「種子の回収」は、当業者であれば、植物の種類等に応じた公知の方法を用い、適宜行なうことができる。
　また、このようにして得られる種子は、本発明の温度感受性雄性不稔植物を母本（母系）とし、任意の植物を父本（父系）とする、一代雑種（Ｆ１）の種子、所謂ハイブリッド種子となる。したがって、本発明においては、
　制限温度下で栽培し、雄性不稔とした、本発明の温度感受性雄性不稔植物を母本とし、任意の植物を父本とする、ハイブリッド種子
も提供する。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、本実施例は、後述のトマトに関する実施例５を除き、以下に示す材料及び方法を用いて行なった。
　（品種、系統）
　イネについては、標準品種「日本晴」、温度感受性雄性不稔系統水稲「中間母本農１２号」（ＰＬ１２）とその原品種「レイメイ」を使用した。また、イネの実用多収品種「北陸１９３号」（インド型イネ）も使用した。シロイヌナズナについては、標準エコタイプＣｏｌｕｍｂｉａを用いた。
　（植物の栽培方法）
　イネは、その通常の栽培条件（昼２８℃／夜２２℃）でポット栽培した。短日条件下で花成を誘導し、昼２８℃／夜２２℃又は昼３３℃／夜２２℃において栽培を続けた。出穂時に花粉の形成を観察するとともに、種子稔性を確認した。
　シロイヌナズナは２１℃連続光の条件に設定したグロースチャンバーで栽培した。抽台後に２１℃又は２７℃で栽培を続け、花粉形成や結実の様子を観察した。
　（イネのゲノム編集）
　植物で一般的に用いられているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法を利用した。より具体的には、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓ９、及び選抜マーカーとしてハイグロマイシン抵抗性遺伝子を発現するベクターをアグロバクテリウム法により、イネ品種「日本晴」のカルス又は「北陸１９３号」の未熟胚に導入した。なお、当該ベクターは、ｐＰＺＰ２０２を基にし、ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９を、各々イネのＵ６プロモーター及びイネのユビキチンプロモーターの制御下にて発現し得る。次いで、ハイグロマイシン抵抗性で選抜したカルスから再分化植物を得、その葉からゲノムＤＮＡを調製し、ゲノム編集部分の塩基配列を確認した。１塩基挿入等、コドンの読み枠がずれる変異をもつものを選定した。これらの変異体では、この遺伝子が機能するタンパク質を発現することができないため、遺伝子欠損の状態となる。
　そして、イネ品種「ＰＬ１２」、並びに「日本晴」、「北陸１９３号」及びそれらのゲノム編集系統を、温室内で通常の栽培条件（昼２８℃／夜２２℃）でポット栽培した。短日条件下で花成を誘導し、昼２８℃／夜２２℃あるいは高温条件（「日本晴」については昼３３℃／夜２２℃、「北陸１９３号」については昼３５℃／夜２５℃）において栽培を続け、出穂時に花粉の形成を観察した。
　（シロイヌナズナのゲノム編集）
　前記イネ同様、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法を用いてゲノム編集を行なった。前記イネとは遺伝子導入方法が異なる。シロイヌナズナの形質転換には、一般に用いられているフローラルディップ法を用いた。
　温度感受性雄性不稔系統水稲「ＰＬ１２」は、品種「レイメイ」のガンマ線照射による突然変異集団より選抜育成された。この系統は、通常の栽培温度（２８℃程度）では正常に花粉が形成され結実するが、高温（３３℃程度）では花粉形成不全となり結実が見られない（図３　参照）。また、葉等の栄養器官や雌蕊には異常は認められず、感受性期は出穂前２０日前後の数日間であることがわかっている。遺伝学的解析から、この温度感受性雄性不稔の形質は劣性の単因子によることが示され、責任変異が第７染色体上に座乗することが報告されている（非特許文献１　参照）。そこで、下記のとおり、温度感受性雄性不稔形質の責任変異の同定を試みた。
　（実施例１）
　温度感受性雄性不稔形質の責任変異を同定するため、ファインマッピングを行ったが、５４ｃＭ付近の約１．８Ｍｂより範囲を狭めることができなかった。そこで、原品種の「レイメイ」と「ＰＬ１２」の全ゲノムシーケンス解析を行い、両者を比較した。その結果、「ＰＬ１２」第７染色体の当該部分に約１５０ｋｂの欠失があることが判明した。
　次に、２つのガイドＲＮＡを用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法で、ゲノムＤＮＡの２カ所に二重鎖切断を導入し、その間のＤＮＡ断片を欠落させる方法で、部分欠失のシリーズを作出した。より具体的には、図４に示すように、約１５０ｋｂの欠失領域をおよそ３等分するように、（１）～（２）、（２）～（３）、（３）～（４）の範囲の部分欠失をもつ系統を作出した。なお、（１）～（２）、（２）～（３）、及び（３）～（４）を欠失させるために、配列番号：２３及び２４、２４及び２５、並びに２５及び２６をターゲット配列とし、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により２ヶ所の二重鎖切断を、各々生じさせた。
　その結果、図５に示すとおり、これらのうちの１つ（＃５７１）が、「ＰＬ１２」と同様の表現型を示すことがわかり、（３）～（４）の範囲に候補領域が絞られた。
　さらに同様にして、＃５７１の欠失領域の内部に、３つの部分欠失を設計した。より具体的には、図４に示すように、（３）～（４）の領域をおよそ３分割するように、（３）～（５）、（５）～（６）、（６）～（４）の範囲の部分欠失をもつ系統を作出した。なお、（３）～（５）、（５）～（６）、及び（６）～（４）を欠失させるために、配列番号：２５及び２７、２７及び２８、並びに２８及び２６をターゲット配列とし、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により２ヶ所の二重鎖切断を、各々生じさせた。
　その結果、図５に示すとおり、＃５９２が温度感受性雄性不稔の形質を示したことから、（３）から（５）のおよそ１０ｋｂの範囲に責任変異があると考えられた。データベースの情報から、この領域には２つの遺伝子（図４に示す、ＯＲＦ１とＯＲＦ２）が存在すると予想された。
　そこで、それぞれのコード領域内にガイドＲＮＡを設計し、フレームシフト変異を導入することにより遺伝子機能の破壊を試みた。なお、ＯＲＦ１がコードするアミノ酸配列を、配列番号：１に示し、ＯＲＦ２がコードするアミノ酸配列を、配列番号：２９に示す。ＯＲＦ１に対するガイドＲＮＡにおけるターゲット配列を、配列番号：３０又は３１に示す。ＯＲＦ２に対するガイドＲＮＡにおけるターゲット配列を、配列番号：３２に示す。また、得られた変異の例を、ＯＲＦ１については表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　その結果、図５に示すとおり、＃６１２の系統が温度感受性雄性不稔の形質を示した。さらに、図には示さないが、図５に示した変異株の代表例に限らず、フレームシフト変異が生じれば、温度感受性雄性不稔の形質を示すことを確認し、ＯＲＦ１の遺伝子機能欠失が「ＰＬ１２」の責任変異であることが判明した。
　この遺伝子はＭＳＵデータベースではＬＯＣ＿Ｏｓ０７ｇ２６７９４、ＲＡＰ－ＤＢではＯｓ０７ｇ０４８２７００のＩＤで遺伝子が予測されているが、機能未知の新規遺伝子である。この遺伝子は生物に広く保存されており、特に植物種では保存性が高い。予想されるアミノ酸配列の高等植物での比較を図６に示す。イネ科作物間では配列の保存性はさらに高い（図７　参照）。また、このようにして新規に同定した温度感受性雄性不稔遺伝子をＴＭＳ２と名付けた。
　（実施例２）
　前記遺伝子を欠損したゲノム編集系統を、ゲノム編集前の標準品種「日本晴」、温度感受性雄性不稔系統「ＰＬ１２」と比較して許容温度と制限温度で栽培し、穎花の様子を観察した。その結果、図８に示すとおり、標準品種「日本晴」では、温度によらず正常に花粉が形成された。一方、温度感受性雄性不稔系統「ＰＬ１２」は、２８℃では正常に花粉が形成されて黄色く充実した葯となるのに対し、３３℃では花粉が発達せず、葯の形態や色が異常となった。そして、ゲノム編集により「日本晴」において前記遺伝子を欠損した系統は、「ＰＬ１２」と同様に温度感受性雄性不稔の表現型を示した。
　さらに、イネ品種「日本晴」のゲノム編集により遺伝子機能が欠失した系統を２８℃と３３℃で栽培した。その結果、図９に示すとおり、２８℃では正常に稔実して穂が垂れているのに対し、３３℃では稔らないために穂が立った状態となった。
　（実施例３）
　イネの実用多収品種「北陸１９３号」（インド型イネ）を用いて、実施例２（「日本晴」（日本型イネ））同様にゲノム編集を行い、温度感受性雄性不稔遺伝子を欠損させた。なお、「北陸１９３号」の形質転換は、樋江井祐弘「Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　によるイネ形質転換方法に関する研究」２０１４年名古屋大学学位論文を参照して行った。そして、このようにして得られた「北陸１９３号」由来ゲノム編集系統を、通常条件（２８℃）又は高温条件（３５℃）に設定した温室で栽培し、形成された葯を観察した。
　その結果、図１０に示すとおり、「北陸１９３号」由来ゲノム編集系統においても、「日本晴」由来ゲノム編集系統と同様に、通常条件では花粉が形成され葯が発達するが、高温条件では花粉形成不全のため雄性不稔となることが確認された。
　また開花期に、「北陸１９３号」由来ゲノム編集系統に、別の多収品種「オオナリ」の花粉をかけて、稔った種子を発芽させて栽培した。そして、（１）「オオナリ」、（２）「北陸１９３号」由来ゲノム編集系統、及び（３）高温で栽培した「北陸１９３号」由来ゲノム編集系統に「オオナリ」の花粉をかけて得られた個体のそれぞれの葉からゲノムＤＮＡを精製し、温度感受性雄性不稔遺伝子のゲノム編集部位（変異挿入部位）の塩基配列を解析した。
　その結果、図１１に示すとおり、（３）の個体では、（１）と（２）のゲノム配列のヘテロ対合体になっており、（１）と（２）の交配によりハイブリッドが得られたことが示された。よって、ゲノム編集系統を高温で栽培した場合にもめしべは正常に機能すること、ゲノム編集系統が実際に交配に利用できることが確認された。
　（実施例４）
　双子葉植物のシロイヌナズナについても、前記遺伝子を欠損させることで、温度感受性雄性不稔系統を作出することを試みた。より具体的には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法によりゲノム編集を行い、前記遺伝子が機能しなくなった系統を作出した。
　なお、シロイヌナズナにおけるターゲット配列を、配列番号：３３に示す。また、得られた変異の例を、表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　そして、シロイヌナズナのゲノム編集により遺伝子機能が欠失した系統を２１℃と２７℃で栽培した。その結果、図１２に示すとおり、２１℃では正常に稔実して莢の長さも野生型と変わらないのに対し、２７℃では稔実せず莢が伸長しなかった。
　なお、図には示さないが、上述のイネ同様、図１２に示した変異株の代表例に限らず、フレームシフト変異が生じれば、シロイヌナズナにおいても前記温度感受性雄性不稔に関する形質を示すことを確認している。
　また、実施例３同様に、シロイヌナズナにおいても交配実験を行なった。その結果、図には示さないが、種子を得ることが出来た。したがって、上記イネと同様に、温度感受性雄性不稔遺伝子の機能抑制はめしべの機能に影響を与えることなく、シロイヌナズナにおいてもゲノム編集系統が交配に利用できることが示唆される。
　（実施例５）
　トマトにおいて、温度感受性雄性不稔遺伝子のゲノム編集を行い、変異系統を樹立した。具体的には先ず、トマトの温度感受性雄性不稔遺伝子のゲノム配列情報をＥｎｓｅｎｍｂｌｅＰｌａｎｔｓから取得した。なお、当該遺伝子のｃＤＮＡ（野生型）の配列を配列番号：４３に示す。また、当該ｃＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号：９又は４４に示す（配列番号：９と４４とでは同一のアミノ酸配列を示している）。
　そして、得られたゲノム配列情報を対象とし、ＣＲＩＳＰＲｄｉｒｅｃｔ（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｄｂｃｌｓ．ｊｐ／）にて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓのターゲット配列を検索した。結果、エクソン内にあり、トマトゲノム上に類似配列がない下記２つの配列をゲノム編集ターゲット配列として選定した。
ＧＥ５１　（第３エクソン内）
５’－ＡＣＣＡＴＡＧＧＴＧＡＧＡＡＧＴＣＡＣＧＡＧＧ－３’（配列番号：３７）
ＧＥ５２　（第４エクソン内）
５’－ＣＣＡＧＧＣＴＧＴＣＴＡＣＣＡＧＡＧＡＡＡＴＧ－３’　（配列番号：３８）。
　次に、ゲノム編集用ベクターを作製した。該ベクターには、植物ゲノム編集用ゲノム編集ベクター　ｐＥｇＰ２３７－２Ａ－ＧＦＰを使用した。ｐＥｇＰ２３７－２Ａ－ＧＦＰは徳島大学　刑部教授から分譲を受けた。ベクターの詳細については、Ｕｅｔａ　ｅｔ　ａｌ．（２０１７）　Ｒａｐｉｄ　ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｐａｒｔｈｅｎｏｃａｒｐｉｃ　ｔｏｍａｔｏ　ｐｌａｎｔｓ　ｕｓｉｎｇ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９．Ｓｃｉ　Ｒｅｐ．７：５０７．を参照のほど。
　ｐＥｇＰ２３７－２Ａ－ＧＦＰをＢｓａＩで消化した後、精製した。次いで、化学合成した下記各オリゴＤＮＡを等量混合した後、熱変性処理に供しアニーリングした。得られた２本鎖オリゴＤＮＡを、ＢｓａＩで消化したｐＥｇＰ２３７－２Ａ－ＧＦＰと混合し、該ベクターに挿入し、ライゲーションした。そして、大腸菌に導入し、ゲノム編集用ベクターを増幅した。
＃５１
Ｓｌ＿ｔｍｓ２＿ｇＲＮＡ０１Ｆ
５’－ＧＡＴＴＧＡＣＣＡＴＡＧＧＴＧＡＧＡＡＧＴＣＡＣＧ－３’　（配列番号：３９）
Ｓｌ＿ｔｍｓ２＿ｇＲＮＡ０１Ｒ
５’－ＡＡＡＣＣＧＴＧＡＣＴＴＣＴＣＡＣＧＡＴＡＣＣＡ－３’　（配列番号：４０）
＃５２
Ｓｌ＿ｔｍｓ２＿ｇＲＮＡ０２Ｆ
５’－ＧＡＴＴＧＣＡＴＴＴＣＴＣＴＧＧＴＡＧＡＣＡＧＣＧ－３’　（配列番号：４１）
Ｓｌ＿ｔｍｓ２＿ｇＲＮＡ０２Ｒ
５’－ＡＡＡＣＧＧＣＴＧＴＣＴＡＣＣＡＧＡＧＡＡＡＴＧ－３’　（配列番号：４２）。
　そして、このようにして構築したゲノム編集用ベクターを、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＧＶ２２６０に形質転換し、更にアグロバクテリウム法を用い、トマト品種「Ｍｉｃｒｏｔｏｍ」の形質転換を行った。なお、トマトの形質転換法については、Ｓｕｎ　ｅｔ　ａｌ．（２００６）Ａ　Ｈｉｇｈｌｙ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ，　ａ　Ｍｏｄｅｌ　Ｃｕｌｔｉｖａｒ　ｆｏｒ　Ｔｏｍａｔｏ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．４７：４２６－４３１を参照のほど。
　このようにして取得した形質転換体のターゲット配列を確認して、ゲノム編集個体を取得した。形質転換当代では、変異をホモにもつ個体が得られなかった。そこで、自殖採種し、後代から変異が固定された個体を選定した。
　次に、得られたゲノム編集個体を、室温２３℃／１８℃（昼／夜）１４時間日長で開花前まで育苗した。さらに高温３０℃／２８℃（昼・夜）１４時間日長に移し、最初の花は除去した。その後、着果した果実の種子の有無を確認した。得られた結果を図１３に示す。
　図１３に示すとおり、トマトにおいても、温度感受性雄性不稔遺伝子の欠損によって、通常条件では種子が稔るのに対し、高温条件では種子が形成されず、イネの場合と同様に温度感受性の表現型が観察された。トマトはイネと同様に自家受粉植物であり、自己の花粉がめしべに付着して種子が形成される。これにより、野菜等の作物への適用可能性が示された。
　最後に、本実施例において用いた各種植物由来の温度感受性雄性不稔遺伝子がコードするアミノ酸配列と、作製したゲノム編集個体において認められた変異箇所とを、図１４にまとめて示す。
　以上説明したように、本発明によれば、温度感受性不稔植物を製造することが可能となる。特に、本発明の温度感受性雄性不稔遺伝子の機能を抑制すること以外に、特別な育種を必要とせず、温度感受性不稔植物を製造することができる。
　また、図６及び７に示すとおり、本発明の温度感受性雄性不稔遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は高度に保存されている。したがって、本発明の方法において、用いる系統は限定されないため、様々な植物種の様々な品種・系統で、この遺伝子の機能を抑制させることにより雄性不稔系統の作出が可能となる。例えば、有用な品種の温度感受性雄性不稔遺伝子の機能を抑制するだけで、直ちにハイブリッド産生に用いることができる。
　そして、得られた温度感受性雄性不稔植物を母本として、父本とする他の系統とともに、制限温度下で栽培することにより、これら２系統が交雑したハイブリッド種子を簡便に得ることができる。
　このように、本発明は、農業生産に大きなインパクトを与えることが期待されるものであり、当該分野において極めて有用な技術である。

Claims (4)

  1. 　温度感受性雄性不稔植物の製造方法であって、
    　植物の、下記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子の機能を人為的に抑制する工程を含む、方法
    （ａ）配列番号：１～２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
    （ｂ）配列番号：：１～２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
    （ｃ）配列番号：：１～２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子
    （ｄ）配列番号：１～２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子。
  2. 　下記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子の機能が人為的に抑制された、温度感受性雄性不稔植物
    （ａ）配列番号：１～２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
    （ｂ）配列番号：：１～２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
    （ｃ）配列番号：：１～２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子
    （ｄ）配列番号：１～２２のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子。
  3. 　ハイブリッド種子の製造方法であって、
    　制限温度下で栽培し、雄性不稔とした、請求項２に記載の温度感受性雄性不稔植物を、任意の植物と他家受粉させる工程、及び
    　前記温度感受性雄性不稔植物から種子を回収する工程を、
    含む方法。
  4. 　制限温度下で栽培し、雄性不稔とした、請求項２に記載の温度感受性雄性不稔植物を母本とし、任意の植物を父本とする、ハイブリッド種子。
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