WO2023145948A1 - 短葯形質を有するムギ、及びその製造方法 - Google Patents

短葯形質を有するムギ、及びその製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2023145948A1
WO2023145948A1 PCT/JP2023/002935 JP2023002935W WO2023145948A1 WO 2023145948 A1 WO2023145948 A1 WO 2023145948A1 JP 2023002935 W JP2023002935 W JP 2023002935W WO 2023145948 A1 WO2023145948 A1 WO 2023145948A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
wheat
anther
short
seq
Prior art date
Application number
PCT/JP2023/002935
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
均 吉田
泰一 小川
剛 黒羽
史高 安倍
光子 加星
Original Assignee
国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 filed Critical 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
Publication of WO2023145948A1 publication Critical patent/WO2023145948A1/ja

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)

Definitions

  • the present invention relates to wheat having a short anther trait and a method for producing the same.
  • Fusarium fungi attach to the anthers extracted at the time of flowering and become the source of infection, so wheat with cleistogamy shows resistance to initial infection by such fungi.
  • Non-Patent Document 1 For wheat, wheat intermediate mother plant No. 9, which introduces clostridium derived from U24, has been developed (Non-Patent Document 1). This line exhibits resistance to infection with Fusarium spp., etc., because the glume is difficult to open during the fertilization period and the anther is not extracted. On the other hand, since it has a long culm and is poor in lodging resistance, it is necessary to be careful when selecting the progeny of crosses. Furthermore, since wheat is hexaploid, it does not undergo simple diploid inheritance like rice and barley. Therefore, even if useful genetic resources that confer resistance to infection with Fusarium spp. are found, efficient breeding will be difficult, and the application of mutants identified by genome editing technology, TILLING, etc. is expected. .
  • Non-Patent Document 2 Although closed flower cultivars are popular among barley, even in this cultivar, the anthers are extracted from the tips of the florets.
  • the trait that makes it difficult to extract the anther from the glume is useful from the viewpoint of resistance to infection with Fusarium spp.
  • the causative gene is useful in producing mutants by genome editing technology, TILLING, etc., as described above. However, no such causative gene has been identified in wheat.
  • san-1 short anther
  • san-1 is a mutant induced by a chemical mutagen from Taichung No. 65 (T65) as the original cultivar, and exhibits a short anther property in which the anther length is reduced by about 30% compared to the wild type (non Patent document 3).
  • the anthers due to the short length of the anthers, the anthers also exhibit a character that is difficult to extract from the glume.
  • the causative gene responsible for the phenotype of this mutant has not been identified. Therefore, it has been difficult to produce lines having such a short anther trait in rice cultivars other than T65 and in plant species other than rice.
  • Kenji Kubo et al. "Cultivation of 'Wheat Intermediate Mother Farmer No. 9' (Fusarium No. 3) with closed flowers and excellent resistance to Fusarium head blight," Kyushu Okinawa Agricultural Research Center Report, February 2012, No. 57 , pages 21-34 Yoshida et al. , Phytopathology, 2007, 97, 1054-1062 Grants-in-Aid for Scientific Research 2016 Research Results Report, Research Representative Hitoshi Yoshida, Research Project Title: Elucidation of the Control Mechanism of Flower Organ Size in Rice, Release Date: March 22, 2018
  • the present invention has been made in view of the problems of the prior art, and identifies the causative gene involved in the short anther trait in san-1, and also identifies the homologous gene of the causative gene in wheat. Another object of the present invention is to provide a method for producing wheat having a short anther trait targeting the gene.
  • the present inventors first crossed the rice mutant san-1, which has the short anther trait, with the rice cultivar Kasalath, and performed map-based cloning using the F2 population.
  • the causative gene was predicted to exist between markers RM18639 and RM6841 on chromosome 5.
  • the candidate region exists between the markers IRIC11 and RM18719.
  • gene sequences were compared, it was found that in san-1, an immature termination codon was generated by substituting adenine for guanine at position 236 counted from the translation start point of gene Os05g0421300.
  • the candidate gene the gene encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2
  • guide RNA is designed at two different locations, and genome editing by the CRISPR / Cas9 method is used to frameshift. caused mutations.
  • the same short anther trait as san-1 was exhibited, revealing that this gene is the causative gene (SAN gene) involved in the short anther trait in san-1. bottom.
  • SAN gene causative gene
  • HvSAN and TaSAN-A/B/D genes of each subgenome of A, B, and D
  • gRNAs were designed at the position corresponding to the N-terminal side (target 1) and the position corresponding to the C-terminal side (target 2) of HvSAN, respectively, to produce genome-edited individuals of barley.
  • four gRNAs (targets 3, 4, 5, 6) consisting of sequences conserved between TaSAN-A/B/D were designed at positions corresponding to the N-terminal side of TaSAN-A/B/D. Then, we produced genome-edited wheat plants.
  • the present invention provides the following.
  • Method (a) comprising the step of artificially suppressing the function of at least one gene selected from the group consisting of the following (a) to (d) of wheat: SEQ ID NO: 10, 12, 14 or 16 (b) a gene encoding a protein consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, 12, 14 or 16, in which one or more amino acids are substituted, deleted, added, and/or inserted (c) a gene encoding a protein consisting of SEQ ID NO: 10, 12, 14 or 16 and a gene (d) encoding an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10, 12, A gene comprising a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence according to 14 or 16.
  • Wheat having a short anther trait in which the function of at least one gene selected from the group consisting of the following (a) to (d) is artificially suppressed (a) SEQ ID NO: 10, 12, 14 or (b) a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in 16, wherein one or more amino acids are substituted, deleted, added, and/or inserted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10, 12, 14, or 16; (c) a gene encoding a protein consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, 12, 14 or 16; , 12, 14 or 16.
  • the present invention it is possible to produce wheat with a short anther trait. Because of its short anthers, it is difficult to extract the anthers from the glume of the wheat, so it is useful for preventing diseases (such as Fusarium head blight) caused by infection with Fusarium spp. In addition, the short anthers are difficult to extract from the glume, and pollen is also less likely to scatter, so crossbreeding with other wheat or the like can be suppressed.
  • diseases such as Fusarium head blight
  • FIG. 1 shows that the rice mutant san-1 has a short anther trait.
  • (A) is a photograph showing the results of observation of spikelets from which the outer spikes were removed for the wild type (T65) and san-1.
  • (B) is a graph showing that san-1 shortens anther length by 30% compared to wild type.
  • (C) is a graph showing that there is no significant difference between wild-type and san-1 in inner glume length.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the mapping history of causative genes in san-1. The arrow indicates the gene region inferred from the RAP-DB database between markers IRIC11 and RM18719, which is a candidate region of the causative gene.
  • FIG. 2 is a diagram showing an overview of base substitutions observed in the causative gene of san-1.
  • A adenine
  • G guanine
  • W tryptophan
  • stop an immature termination codon
  • the rice SAN gene encodes 601 amino acids having an ARM (Armadillo repeat) domain on the N-terminal side and a TPR (tetratricopeptide repeat) domain on the C-terminal side.
  • ARM Armadillo repeat
  • TPR tetratricopeptide repeat
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing base insertion sites in the rice san-CR1 genome editor. A frameshift was generated by inserting thymine between the 392nd and 393rd bases counted from the translation initiation site of the rice SAN gene.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing base insertion sites in the rice san-CR2 genome editor.
  • FIG. 10 is a photograph showing the results of observation of anther shortening in the rice SAN genome edited. In both san-CR1 and san-CR2 genome editors, short anthers similar to san-1 were observed.
  • 1 is a schematic diagram showing the structure of a barley SAN homologous gene (HvSAN gene) and target sites for genome editing.
  • FIG. Guide RNA target 1 was designed upstream of the gene, and guide RNA target 2 was designed downstream, and genome editing was performed.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a barley guide RNA (target 1) expression vector.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a barley guide RNA (target 1) expression vector.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of a barley guide RNA (target 2) expression vector. Schematic of the SpCas9 expression vector. Schematic diagram showing the structure of the HvSAN gene. 1 is a gene phylogenetic tree showing the relationship between the rice SAN gene and SAN homologous genes of barley and wheat.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing base insertion sites in the barley HvSAN genome editor.
  • Fig. 10 shows photographs and graphs showing the results of analysis of short anther formation in HvSAN target 1 #11 T1 homozygotes. In the figure, “ ⁇ 5" indicates a homozygous individual with a 5 base deletion, and “1s ⁇ 3" indicates a homozygous individual with a single base substitution and a 3 base deletion.
  • FIG. 10 is a photograph showing the results of analysis of short anther formation in HvSAN target 1 #11 T1 heterozygotes (heterozygotes).
  • ⁇ 5/1S ⁇ 3 indicates a heterozygous individual with 5-base deletion and 1-base substitution and 3-base deletion.
  • Fig. 3 is a photograph and a graph showing the results of analysis of short anther formation in HvSAN target 2 #01 T1 homogenotype individuals.
  • “+G” indicates a homozygous individual with a single guanine base insertion
  • ⁇ TG indicates a homozygous individual with a deletion of thymine and 2 bases of guanine.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the structure of the wheat SAN homologous gene (TaSAN gene) and the target site for genome editing.
  • TaSAN gene the wheat SAN homologous gene
  • BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS It is a figure which shows the outline of the vector for expressing wheat guide RNA (target 3,4,5,6) and Cas9.
  • Schematic diagram showing mutations introduced in a wheat genome editor (TaSAN#3).
  • TTaSAN#46 Schematic diagram showing mutations introduced in a wheat genome editor (TTaSAN#46).
  • FIG. 10 is a photograph showing the results of analyzing short anther formation in the T0 generation of TaSAN#3.
  • FIG. Fig. 10 is a photograph and a graph showing the results of analyzing short anther formation in the T0 generation of TaSAN#34 and #46.
  • the present inventors have found that causative genes (SAN gene) were identified. Furthermore, by identifying the homologous gene of the SAN gene in wheat and suppressing the function of the gene by genome editing, we succeeded in imparting short anther traits to wild-type barley and wheat. Therefore, the method for producing wheat having the short anther trait of the present invention is characterized by including a step of artificially suppressing the function of the gene (short anther gene), and more specifically provides the following.
  • a method for producing wheat having a short anther trait comprising: Method (a), comprising the step of artificially suppressing the function of at least one gene selected from the group consisting of the following (a) to (d) of wheat: SEQ ID NO: 10, 12, 14 or 16 (b) a gene encoding a protein consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, 12, 14 or 16, in which one or more amino acids are substituted, deleted, added, and/or inserted (c) a gene encoding a protein consisting of SEQ ID NO: 10, 12, 14 or 16 and a gene (d) encoding an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10, 12, A gene comprising a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence according to 14 or 16.
  • short anther trait means a trait in which the length of the anther of the stamen (anther length) is shortened.
  • anther length means the vertical length (major axis) of the substantially elliptical anther.
  • shortening refers to, for example, 10% or more (preferably 20% or more, more preferably 30% or more).
  • the "wheat" to which the short anther trait is to be imparted means a plant of the wheat family belonging to the Poaceae, Poaceae subfamily, and includes, for example, wheat, barley, rye, triticale, and oat. Moreover, it may be a wild species or a cultivated species. Furthermore, genetically modified or genome edited forms of these wheat (eg, disease-resistant crops, herbicide-resistant crops, pest-resistant crops, crops with improved taste, crops with improved shelf life, and crops with improved yield) may be used.
  • the wheat to be imparted with the short anther trait is not particularly limited, but from the viewpoint of producing wheat with higher resistance to Fusarium spp. is preferred.
  • such wheat includes barley, U24, and U56, which have a closed flower AP2 gene (cly1.b type or cly1.c type gene) that exhibits cleavage resistance to miR172, which is a kind of microRNA. , IL416 or Corringin, which tend to close flowers.
  • miR172 which is a kind of microRNA.
  • IL416 or Corringin which tend to close flowers.
  • not only wheat having resistance to initial infection with Fusarium spp. Wheat with resistance to mycotoxin accumulation may be endowed with a short anther trait.
  • Table 1 shows examples of genes encoding typical amino acid sequences as "short anther genes" whose function is to be suppressed in the present invention.
  • the short anther gene of the present invention contains one or more amino acids in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10, 12, 14 or 16, as long as it can confer the short anther trait by suppressing its function.
  • Genes encoding proteins consisting of substituted, deleted, added and/or inserted amino acid sequences are also included.
  • plural usually means within 120 amino acids, preferably within 90 amino acids, more preferably within 60 amino acids, still more preferably within 55 amino acids, more preferably within 50 amino acids, more preferably within 45 amino acids, more preferably within 45 amino acids. 40 amino acids or less, more preferably 35 amino acids or less, more preferably 30 amino acids or less (e.g., 25 amino acids or less, 20 amino acids or less, 15 amino acids or less), particularly preferably 10 amino acids or less (e.g., 9 amino acids or less, 8 amino acids or less, 7 amino acids or less, 6 amino acids or less, 5 amino acids or less, 4 amino acids or less, 3 amino acids or less, 2 amino acids).
  • a person skilled in the art can use the nucleotide sequence information of that gene to identify its homologous genes from the same species or other plants. It is possible. Methods for identifying homologous genes include, for example, hybridization technology (Southern, EM, J. Mol. Biol., 98:503, 1975) and polymerase chain reaction (PCR) technology (Saiki, R.; K., et al. Science, 230: 1350-1354, 1985, Saiki, RK et al. Science, 239: 487-491, 1988). Hybridization reactions are typically performed under stringent conditions to identify homologous genes.
  • stringent hybridization conditions include 6M urea, 0.4% SDS, 0.5xSSC conditions, or equivalent stringency hybridization conditions. Higher stringency conditions, for example, 6M urea, 0.4% SDS, 0.1xSSC, are expected to isolate genes with higher homology.
  • the short anther gene of the present invention includes a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10, 12, 14 or 16 (e.g., sequence Nos.: 9, 11, 13, or 15)) that hybridize under stringent conditions to the DNA.
  • the protein encoded by the identified homologous gene usually has high homology (high similarity), preferably high identity, with that encoded by the specific gene.
  • “high” means at least 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more (e.g., 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more ).
  • the short anther gene of the present invention has 80% or more homology (similarity) to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10, 12, 14 or 16, as long as it can confer the short anther trait by suppressing its function. gender) or genes encoding amino acid sequences with greater than 80% identity.
  • Sequence homology can be determined using the BLAST program (Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990).
  • the program is based on the algorithm BLAST by Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877, 1993).
  • the Gapped BLAST program it can be performed as described in Altschul et al. (Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997).
  • BLAST and Gapped BLAST programs use the default parameters of each program. Specific methods of these analysis methods are known.
  • “Artificial suppression of the function of the short anther gene” of the present invention includes both complete suppression (inhibition) and partial suppression of the function.
  • artificial suppression of the expression of the short anther gene artificial suppression of the activity of the protein encoded by the short anther gene is also included. Such artificial suppression can be performed, for example, by introducing mutations into the coding region, non-coding region, transcription control region (promoter region), etc. of the short anther gene.
  • the mutation introduced into the short anther gene is not particularly limited as long as it suppresses the function of the gene, and examples thereof include nucleotide substitution, deletion, addition, and/or insertion. Mutations, nonsense mutations, null mutations, in-frame mutations, inversions, translocations are preferred. Further, in the present invention, mutations introduced into the short anther gene may be mutations in epigenetic regulation that are not accompanied by such nucleotide mutations. Epigenetic regulation includes, for example, DNA methylation and histone chemical modification (acetylation, methylation, phosphorylation, ubiquitination, etc.). Also, the number of mutations to be introduced into the short anther gene is not particularly limited as long as it suppresses the function of the gene. 10 or less, 20 or less, 30 or less, 40 or less, 50 or less).
  • Such mutations include, for example, alteration or deletion of amino acids after position 130 or 131 (about 78% of the total) of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16, as shown in Examples below.
  • Nucleotide mutations including nucleotide mutations involving alteration or deletion of amino acids after position 555 or 556 (about 9% of the total) of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:16.
  • Such deletion or the like suppresses the function of the short anther gene of the present invention, making it possible to obtain wheat having the short anther trait.
  • the mutation introduced into the short anther gene does not have to eliminate the entire amino acid sequence of the protein encoded by the gene, and may be introduced into the gene so that a part thereof is lost or changed. .
  • amino acids when part of the expressed protein is deleted due to gene mutation, usually 5% or more of the whole (for example, 6% or more, 7% or more, 8% or more, 9% or more) amino acids are changed or deleted preferably 10% or more, more preferably 20% or more, still more preferably 25% or more, more preferably 30% or more, still more preferably 35% or more, more preferably 40% or more, still more preferably 45% % or more, more preferably 50% or more, still more preferably 55% or more, more preferably 60% or more, still more preferably 65% or more, more preferably 70% or more, still more preferably 75% or more, more preferably 80% above, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more (e.g., 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more) is altered or deleted good.
  • 5% or more of the whole (for example, 6% or more, 7% or more, 8% or more, 9% or more) amino acids are changed
  • the region whose amino acid sequence is altered or deleted in this way is not particularly limited, but includes, for example, the C-terminal region, as shown in the Examples below.
  • a region ARM (armadillo repeat) domain and/or TPR (tetra Tricopeptide repeats) are also examples of regions where the amino acid sequence is altered or deleted.
  • the site of introduction of mutation by adjusting the site of introduction of mutation, the type of mutation to be introduced, or the region where the amino acid sequence is changed or deleted along with them, in the short anther gene , it is also possible to control the degree of anther length shortening.
  • introduction of mutation upstream of the short anther gene results in strong short anther formation, while downstream (from position 401 onward in the encoding amino acid sequence)
  • the introduction of mutations in the corresponding regions results in weak anther formation.
  • by weakening the activity of the encoded protein by in-frame mutation or the like, it is possible to bring about weak anther formation.
  • a person skilled in the art can introduce a mutation into the short anther gene by a known mutation introduction method.
  • Such known methods include genome editing, physical mutagenesis, methods using chemical mutagens, methods of introducing transposons into genomic DNA, methods using siRNA, antisense RNA, RNA having ribozyme activity, and the like. , including but not limited to methods that target transcripts.
  • the genome editing method, the method targeting transcripts, and the TILLING method described later are preferable from the viewpoint that mutations can be artificially introduced by targeting the short anther gene.
  • Genome editing methods utilize site-specific nucleases (e.g., zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activation-like effector nucleases (TALENs), DNA double-strand cleavage enzymes such as CRISPR-Cas enzymes) to target genes.
  • ZFNs zinc finger nucleases
  • TALENs transcription activation-like effector nucleases
  • DNA double-strand cleavage enzymes such as CRISPR-Cas enzymes
  • nuclease domain-fused PPR penentatricopeptiderepeat
  • CRISPR-Cas9 US Patent No. 8697359, International Publication 2013/176772
  • CRISPR-Cpf1 Zetsche B. et al., Cell, 163 ( 3): 759-71, (2015)
  • Target-AID K. Nishida et al., Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems, Science, DOI: 10. 1126/science.aaf8729, (2016) ), or a method using a complex of guide RNA and protein, or a complex of protein.
  • Cas enzyme is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
  • Cas9 which is an enzyme, is preferred.
  • “Cas9” is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose. Cas9 of Thermophilus (Streptococcus thermophilus), Cas9 of Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus) and the like can be mentioned, but Cas9 (SpCas9) of Streptococcus pyogenes is preferred.
  • a Cas9 mutant derived from these organisms may be a Cas9 mutant derived from these organisms, a D10A mutant of Cas9 known to function as a nickase (a DNA-cleaving enzyme that nicks only one DNA strand) may be a Cas9 homologue, or an ortholog.
  • Examples of physical mutagenesis include heavy ion beam (HIB) irradiation, fast neutron beam irradiation, gamma ray irradiation, and ultraviolet irradiation (Hayashi et al., Cyclotrons and Their Applications, 2007, 18th International Conference, 237 239 and Kazama et al., Plant Biotechnology, 2008, 25, 113-117).
  • HAB heavy ion beam
  • Methods using chemical mutagenesis include, for example, methods of treating seeds with chemical mutagenesis (see Zwar and Chandler, Planta, 1995, Vol. 197, pp. 39-48, etc.).
  • the chemical mutagen is not particularly limited, but N-methyl-N-nitrosourea (MNU), ethyl methanesulfate (EMS), N-ethyl-N-nitrosourea (ENU), sodium azide, sodium bisulfite , hydroxylamine, N-methyl-N'-nitro-N-nitroguanidine (MNNG), N-methyl-N'-nitrosoguanidine (NTG), O-methylhydroxylamine, nitrous acid, formic acid and nucleotide analogues. mentioned.
  • Methods of introducing transposons into genomic DNA include, for example, methods of inserting transposons such as TOS 17, T-DNA, etc. into plant genomic DNA (Kumar et al., Trends Plant Sci., 2001, 6 3, 127-134 and Tamara et al., Trends in Plant Science, 1999, 4, 3, 90-96).
  • TILLING Targeting Induced Local Lesions IN Genomes
  • Slade et al., Transgenic Res., 2005). 14, 109-115 and Comai et al., Plant J., 2004, 37, 778-786 a non-selective mutation is introduced into the genome of wheat using the aforementioned heavy ion beam irradiation, chemical mutagen, etc.
  • the amplified product Individuals having a mutation in can be selected by TILLING or the like.
  • mutations introduced into genes other than the target gene can be removed by crossing the wheat into which the mutation has been introduced by the above method and the wild-type wheat and performing backcrossing.
  • Wheat in which the function of the gene is suppressed by introducing a mutation into the short anther gene may be heterozygous for the short anther gene.
  • homozygotes having the short anther gene into which the mutation has been introduced are selected from the F1 plants.
  • the "wheat homozygous having the short anther gene introduced with the mutation" includes not only wheat having two alleles of the short anther gene having the same mutation, Wheat having a first short anther gene encoding a protein having a first mutation and having suppressed activity and a second short anther gene encoding a protein having a second mutation and having suppressed activity is included.
  • a dsRNA double-stranded RNA, for example, siRNA
  • a method using DNA a method using DNA encoding an antisense RNA complementary to the transcription product of the short anther gene (antisense DNA), and encoding an RNA having ribozyme activity that specifically cleaves the transcription product of the short anther gene
  • methods that target transcription products of the short anther gene such as methods that use DNA to target (ribozyme method).
  • the artificial suppression of the function of the short anther gene can be performed on wheat plants, seeds, or plant cells according to the methods described above.
  • Plant cells include wheat-derived cultured cells as well as cells in plants. Further, various forms of wheat-derived cells, such as suspension culture cells, protoplasts, leaf segments, callus, immature embryos, pollen, etc., are included.
  • DNA encoding the above-described site-specific nuclease, fusion protein or guide RNA-protein complex, DNA encoding a transposon, DNA encoding a double-stranded RNA, and antisense RNA DNA, DNA encoding RNA having ribozyme activity, etc. may be introduced into wheat cells in the form of being inserted into a vector.
  • the vector into which the DNA for artificially suppressing the function of the short anther gene is inserted is not particularly limited as long as it is capable of expressing the inserted gene in wheat cells. It may contain a promoter for constitutive or inducible expression. Examples of promoters for constant expression include rice ubiquitin promoter, cauliflower mosaic virus 35S promoter, rice actin promoter, maize ubiquitin promoter and the like. In addition, promoters for inducible expression are known to be expressed by exogenous factors such as infection or invasion of filamentous fungi, bacteria, viruses, low temperature, high temperature, dryness, ultraviolet irradiation, spraying of specific compounds, etc. promoters, etc. Furthermore, a pol III promoter such as the U6 promoter is preferably used as a promoter for expressing a DNA encoding a short RNA such as a guide RNA or siRNA as the DNA according to the present invention.
  • Examples of methods for introducing the DNA or a vector into which the DNA is inserted into wheat cells include, for example, particle bombardment, a method via Agrobacterium (Agrobacterium method), a polyethylene glycol method, an electroporation method ( Various methods known to those skilled in the art can be used, such as electroporation).
  • the above-mentioned site-specific nuclease, fusion protein, and transposon are proteins
  • the above-mentioned guide RNA, double-stranded RNA, antisense RNA, and RNA having ribozyme activity are RNA As such, even if it is introduced into wheat cells, it is possible to introduce mutations.
  • the short anther trait can be imparted to wheat by using a substance targeting the short anther gene, such as the DNA, the vector into which the DNA is inserted, the protein, or the RNA.
  • a substance targeting the short anther gene such as the DNA, the vector into which the DNA is inserted, the protein, or the RNA.
  • the present invention provides a method for producing wheat shorts, which contains as an active ingredient at least one substance targeting short anther genes selected from the group consisting of the DNA, the vector into which the DNA is inserted, the protein, and the RNA. Agents may also be provided to confer the anther trait.
  • Such a drug may be in the form of containing two active ingredients in one composition, or may be in the form of containing two active ingredients in separate compositions (so-called kit).
  • kit may be in addition to the substances described above, other ingredients such as buffers, stabilizers, preservatives, and antiseptics.
  • techniques for producing transformed plants related to wheat include Tingay et al. (Tingay S. et al. Plant J. 11:1369-1376, 1997), Murray et al. -402, 2004), Travalla et al. (Travalla Set al. Plant Cell Report 23:780-789, 2005), Vasil et al. Ishida Y. et al.Methods in Molecular Biology 1223:189-193, 2015).
  • transformation and regeneration into plants are performed using the methods described in Tabei et al. be able to.
  • the present invention provides Wheat having a short anther trait in which the function of at least one gene selected from the group consisting of the following (a) to (d) is artificially suppressed (a) SEQ ID NO: 10, 12, 14 or 16 (b) a gene encoding a protein consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, 12, 14 or 16, in which one or more amino acids are substituted, deleted, added, and/or inserted (c) a gene encoding a protein consisting of SEQ ID NO: 10, 12, 14 or 16 and a gene (d) encoding an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10, 12, A gene comprising a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a nucleot
  • the short anther gene, artificial suppression of its function, and wheat etc. to which the short anther trait is imparted by the suppression are as described above. Moreover, once a plant in which the function of the short anther gene is artificially suppressed is obtained, offspring can be obtained from the plant by sexual or asexual reproduction. Furthermore, it is also possible to obtain propagation materials (eg, seeds, cuttings, stumps, callus, protoplasts, etc.) from the plant, progeny or clones thereof, and mass-produce the plant based on these materials.
  • the present invention includes wheat progeny and clones having the short anther trait, and propagation material thereof. Examples of propagation materials include seeds, strains, callus, and protoplasts.
  • the method of the present invention for determining whether or not it has the short anther trait is characterized by analyzing the nucleotide sequence of the short anther gene or its expression control region in the wheat to be tested. More specifically, it is as follows.
  • a method for determining whether or not wheat has the short anther trait which comprises analyzing the nucleotide sequence of the short anther gene or its expression control region in the wheat to be tested.
  • the short anther gene to be detected in the determination method of the present invention is as described above.
  • the anther length is shortened by introducing nucleotide insertions or deletions into the short anther gene. Therefore, by analyzing the nucleotide sequence of the short anther gene region, it is possible to determine whether or not the individual has the short anther trait.
  • an amplification product obtained by amplifying the short anther gene of the present invention or its expression control region by PCR can be used.
  • the primers to be used are not limited as long as they can specifically amplify the short anther gene or its expression control region. can be designed.
  • the method for determining whether or not the individual has the short anther trait can include, for example, a step of comparing with a "control nucleotide sequence.”
  • the "control nucleotide sequence" to be compared with the nucleotide sequence of the short anther gene or its expression control region in the wheat to be tested encodes the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10, 12, 14 or 16 in the case of wheat, for example.
  • the test wheat By comparing the determined nucleotide sequence of the short anther gene or its expression control region in the test wheat with the nucleotide sequence of the control, it is possible to determine whether or not the test wheat has the short anther trait. For example, when there is a large difference in the nucleotide sequence compared to the control nucleotide sequence (e.g., SEQ ID NO: 9, 11, 13 or 15) (especially due to the appearance of a new stop codon or frameshift, coding If there is a large change in the protein molecular weight or amino acid sequence), it is determined that the test wheat has a high probability of having the short anther trait.
  • the control nucleotide sequence e.g., SEQ ID NO: 9, 11, 13 or 15
  • preparation of DNA from the wheat to be tested can be performed using a conventional method, for example, the CTAB method.
  • a conventional method for example, the CTAB method.
  • wheat for DNA preparation not only grown plants but also seeds and seedlings can be used.
  • the nucleotide sequence can be determined by conventional methods such as the dideoxy method and the Maxam-Gilbert method. Commercially available sequencing kits and sequencers can be used for nucleotide sequence determination.
  • nucleotide sequence of the short anther gene or its expression control region in the test wheat differs from the control nucleotide sequence is indirectly analyzed by various methods other than the above-mentioned direct determination of the base sequence.
  • Such methods include, for example, PCR-SSCP (single-strand conformation polymorphism) method, RFLP method using restriction fragment length polymorphism (RFLP), PCR-RFLP method, denaturant gradient gel electrophoresis method (DGGE), allele specific oligonucleotide (ASO) hybridization method, ribonuclease A mismatch cleavage method.
  • Another method of the present invention for determining whether or not a plant has the short anther trait is characterized by detecting the expression of the short anther gene or the molecular weight of the amplification product or the expression product in the wheat to be tested. More specifically, it is as follows.
  • a method for determining whether or not wheat has the short anther trait comprising detecting the expression of the short anther gene or the molecular weight of the amplification product or expression product of the wheat to be tested.
  • the short anther gene to be detected in the determination method of the present invention is as described above.
  • introduction of nucleotide insertion or deletion into the short anther gene reduces the molecular weight of the expression product and shortens the anther length. Therefore, by detecting the molecular weight of the amplification product or expression product of the short anther gene, it is possible to determine whether or not the plant has the short anther trait. In addition, by detecting the expression of the short anther gene, it is possible to determine whether or not the plant has the short anther trait.
  • detection of short anther gene expression includes both detection at the transcription level and detection at the translation level.
  • detection of expression includes not only detection of the presence or absence of expression, but also detection of the degree of expression.
  • Detection at the transcription level of short anther genes can be carried out by conventional methods such as RT-PCR and Northern blotting.
  • the primers used in carrying out the PCR are not limited as long as they can specifically amplify the DNA to be detected of the present invention, and can be appropriately designed based on the sequence information of the short anther gene that has already been determined. can.
  • detection at the translation level can be performed by a conventional method, such as Western blotting.
  • Antibodies used for Western blotting may be polyclonal antibodies or monoclonal antibodies, and methods for preparing these antibodies are well known to those skilled in the art.
  • the expression level of the short anther gene was higher than that of the Chinese Spring gene in the wheat to be tested. If the expression level is significantly lower than that of Golden Promise (for example, if the short anther gene is not substantially expressed), it is determined that the wheat has a high probability of having the short anther trait. In addition, if the molecular weight of the amplification product or expression product of the short anther gene is significantly different from, for example, the molecular weight of Chinese Spring in wheat, or the molecular weight of Golden Promise in barley, wheat having the short anther trait. A certain probability is determined to be high.
  • the present invention provides a method of breeding wheat with the short anther trait.
  • a breeding method includes (a) the step of crossing wheat having the short anther trait with an arbitrary variety; (b) includes a step of selecting wheat determined to have the short anther trait by the method described above from among the individuals obtained by crossing in step (a).
  • “Wheat having the short anther trait” includes, for example, wheat having the short anther trait due to suppression of the function of the above-mentioned short anther gene.
  • examples of the "arbitrary variety" to be crossed with the wheat include, but are not limited to, wheat varieties that do not have the short anther trait because the function of the short anther gene is not suppressed.
  • from the viewpoint of producing wheat with higher resistance to Fusarium spp. Preference is given to barley having the gene ), and wheat exhibiting a tendency to close flowers such as U24, U56, IL416 or Corringin.
  • Example 1 Search for a candidate causative gene for rice short anther mutant Rice san-1 (short anther) mutant was produced by using rice cultivar T65 (Taichung 65) as the original cultivar, and using the chemical mutagen N-Methyl- It was obtained from among a mutant population induced by N-nitrosourea (MNU). The anther length of san-1 is shorter than that of the wild type by about 30%, while the inner glume length shows no difference (Fig. 1, Non-Patent Document 1).
  • the causative gene for this short anther trait has not been clarified. Therefore, first, san-1 was crossed with the rice cultivar Kasalath, and map-based cloning was performed using the F2 population. As a result, the causative gene was predicted to exist between markers RM18639 and RM6841 on chromosome 5 (Fig. 2).
  • the gene encodes a protein of unknown function having a nuclear localization signal and an ARM (Armadillo repeat) domain on the N-terminal side and a TPR (tetratricopeptide repeat) domain on the C-terminal side (Fig. 4).
  • Example 2 Short anther formation by genome editing targeting the gene Os05g0421300
  • the following method was used. , performed genome editing targeting the gene, and verified whether or not the short anther trait was expressed.
  • SAN-CR1 positions: 376-395, sequence 5'-CCATTGGTTGAACTCTTACG-3', SEQ ID NO: 3
  • SAN-CR2 positions: 137-156, sequence 5'-TTCTCCCTATTAGTGGTCTT-3', SEQ ID NO: 3) : 4).
  • a vector for expressing each guide RNA and SpCas9 was produced according to the usual method.
  • the vector is based on the pZNH2GTR--U6CR vector (Fig. 5), and the DNA encoding the guide RNA is inserted between the OsU6-2 promoter and the Scaffold sequence.
  • the DNA encoding SpCas9 is inserted between the rice Ubi1b promoter and the rice Ubi1b terminator sequences.
  • This genome-editing expression vector also has an expression cassette sequence for a hygromycin resistance gene for selection of transformants.
  • Transformation into Rice Callus The genome-editing expression vector prepared above is described in Oikawa et al., Plant Mol. Biol. 55, 687-700 (2004), it was introduced into a callus derived from rice scutellum of rice cultivar Nipponbare by Agrobacterium-mediated transformation. Transformed callus was selected by culturing in a medium containing hygromycin.
  • SAN-CR1 analysis primer SAN_CR1_seqF 5′-TCAACTTGGGGATATTTGAATG-3′ (SEQ ID NO: 5)
  • SAN_CR1_seqR 5′-ACTTCTCCATGGTCAGCAACT-3′
  • SAN-CR2 analysis primer SAN_CR2_seqF 5′-TCATTTGTCTCTCACGATGGA-3′ (SEQ ID NO: 7)
  • SAN_CR2_seqR 5'-TGTGCTGCATAATATGGGATG-3' SEQ ID NO: 8).
  • Tks Gflex DNA Polymerase (manufactured by TAKARA) was used as the PCR enzyme, and the total volume of 10 ⁇ L of the reaction mixture was as follows, and the reaction was performed in a 0.2 mL 8-tube tube. 5 ⁇ L of 2 ⁇ Gflex PCR Buffer 100 ⁇ M Forward primer 0.2 ⁇ L 100 ⁇ M Reverse primer 0.2 ⁇ L Tks Gflex DNA Polymerase (1.25 U/ ⁇ L) 0.2 ⁇ L Pure water 3.4 ⁇ L DNA extract 1 ⁇ L.
  • TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice was used and operated under the following conditions. 94°C for 1 minute, then 40 cycles of 98°C for 10 seconds, 55°C for 15 seconds and 68°C for 30 seconds.
  • Observation of Anther Length Observation of anther length in the SAN genome editor was performed in the genetically fixed T1 generation. Pre-flowering spikelets, in which the anthers were elongated to the middle of the spikelet, were collected. The spikelets of the spikelet collected with tweezers were removed, the anthers were exposed, and the length of the anthers was observed with a stereoscopic microscope.
  • the plant bodies in which genome editing was detected were transplanted into pots and continued to be cultivated in an isolated greenhouse to obtain progeny seeds.
  • #20-1 among the strains using SAN-CR1 as a guide RNA and #14-1 among the strains using SAN-CR2 as a guide RNA the T1 generation was raised and each individual was subjected to sequence analysis. Individuals undergoing editing were selected.
  • san-CR1 #20-1 one thymine was inserted between the 392nd and 393rd bases counting from the translation start point of the gene Os05g0421300 (Fig. 6), san-CR2 #14-1 found that a frameshift occurs due to a mutation that inserts one base of thymine between the 153rd and 154th bases (Fig. 7).
  • the gene Os05g0421300 is the causative gene (SAN gene) for short anther formation in san-1.
  • SAN gene causative gene
  • the sequence of the SAN homologous gene (TaSAN-A/B/D (A, B, D gene of each subgenome) of wheat (variety "Chinese Spring”) was obtained from publicly available information.
  • the genome sequence of barley was searched using the TaSAN-A gene, which was assumed to be a homologous gene on the wheat A genome, as a query sequence. (https://ics.hutton.ac.uk/gmapper/index.html)”
  • a BLAST search was performed on this database and a base sequence of 5,213 bp was obtained.
  • HvSAN target 1 positions: 2243-2262
  • HvSAN target 2 positions 4176-4195
  • HvSAN target 1 was inserted between the HvU3 promoter and the scaffold sequence of the HvU3-sgRNA vector (Fig. 10)
  • HvSAN target 2 was inserted between the HvU6 promoter and the scaffold sequence of the HvU6-sgRNA vector (Fig. 11).
  • a guide RNA expression vector was constructed.
  • the SpCas9 sequence is the previously reported OsCas9ver. 3, pNEB193-ZmUbi-OsCas9 ver.
  • the maize Ubi promoter was connected downstream of the 5'UTR sequence of the rice alcohol dehydrogenase gene, and further downstream thereof, the nuclear localization signal sequence of the SV40 virus, the cauliflower mosaic virus 35S terminator and Agrobacterium NOS terminator sequences were ligated to create an SpCas9 expression vector.
  • Composition of MSE3M medium Murashige & Skoog (1962) inorganic salts and vitamins, 150 mg/L asparagine, 150 g/L maltose monohydrate, 2.5 mg/L 2,4-D, 8 g/L agar, pH 5.8 .
  • the bombardment treatment was performed using the Bio-Rad PDS-1000/He system. Ten microliters of the vector-adsorbed gold particle suspension was applied to a plastic disk called a macrocarrier, and ethanol was evaporated to immobilize it. After that, gold particles were fired into the immature blastoderm by a conventional method to introduce the vector into the cells. The firing pressure during introduction was 900 psi, and the distance between the disc stop position and the immature embryo was 5 cm. After treatment, the petri dishes were sealed with parafilm and incubated at 26° C. in the dark.
  • MSE3 medium MS inorganic salts and vitamins (Murashige & Skoog, Physiol. Plant. 15, 473-497), 150 mg/L asparagine, 30 g/L sucrose, 2.5 mg/L 2,4-D, 8 g /L agar, pH 5.8.
  • SR7 medium 20 mM KNO3 , 2.5 mM ( NH4 ) 2SO4 , 1 mM CaCl2 , 1 mM MgSO4 , 2 mM KH2PO4 , R2 trace mineral salts (Ohira et al., Plant Cell Physiol. 14, 1113-1121), B5 vitamins (Gamborg et al. Exp. Cell. Res., 50, 151-158), 30 g/L maltose monohydrate, 1 mg/L BA, 8 g/L agar, pH 5.8.
  • KOD FX Neo manufactured by TOYOBO
  • the composition of the reaction solution with a total volume of 10 ⁇ L was as follows, and the reaction was carried out in an 8-tube tube with a volume of 0.2 mL. 5 ⁇ L of 2 ⁇ KOD Fx Neo buffer 2 ⁇ L of 2 mM dNTP mix 10 ⁇ M FW primer 0.3 ⁇ L 10 ⁇ M RV primer 0.3 ⁇ L KOD FX Neo (1 U/ ⁇ L) 0.1 ⁇ L Pure water 1.3 ⁇ L DNA extract 1 ⁇ L.
  • ABI9700 was used as a PCR machine and operated under the following conditions. 94°C for 2 minutes, then 32 cycles of 98°C for 10 seconds, 60°C for 10 seconds and 68°C for 15 seconds.
  • Observation of anther length was performed in the genetically fixed T1 generation. Using the length between the tip node (the base found at the bottom of the cob) and the flag leaf node (the base of the flag leaf) as a guide, the panicles with the same growth period among individuals were collected. The flower organ was removed from the collected ear, and the flower was dissected with tweezers to expose the anther and measure its length.
  • RNA expression vector and a Cas9 expression vector were simultaneously injected into immature barley embryos with a particle gun, and plants were regenerated from the immature embryos by tissue culture, and whether or not genome editing had occurred was examined by CAPS analysis.
  • T1 seeds of HvSAN target 1 #11 individual and HvSAN target 2 #01 individual were sown, and the genotype of the T1 individual was determined by direct sequence analysis. After cultivating until the heading stage, the ears were collected just before flowering, the flower vessel was dissected, and the anther length was measured to investigate the relationship between the introduced mutation and the anther length.
  • Example 4 Short anthers by genome editing of the wheat TaSAN gene
  • the following method was used. , underwent genome editing. Then, the anthers of the obtained genome-edited individuals were analyzed.
  • the TaSAN-A/B/D genes were extracted as homologous genes of the rice SAN gene from the database of the wheat cultivar “Chinese Spring”.
  • a genome-editing vector containing a guide RNA expression cassette, a Cas9 expression cassette and a hygromycin resistance gene expression cassette was constructed.
  • gRNA sequences (20 bp length) targeted for genome editing were designed at four locations (targets 3, 4, 5, 6) within the exon regions of the TaSAN-A/B/D genes (Fig. 19). ).
  • the sequence of each gRNA is as follows.
  • target 3 5'-CATGGCAGCTCTAATATGGA-3' (SEQ ID NO: 23) target 4 5'-CCATTAGTTGAACTCTTAAG-3' (SEQ ID NO: 24) target 5 5'-GAGTTGCTGTCAGAGCTTTG-3' (SEQ ID NO: 25) target 6 5'-CTCCATGATCAGCAACAGCA-3' (SEQ ID NO: 26).
  • Each gRNA was inserted between the wheat U6 (TaU6) promoter and the tracrRNA sequence to construct a guide RNA expression cassette.
  • SpCas9 codon-optimized for maize was connected downstream of the maize Ubi1 promoter (ZmUbi1p), and a Cas9 expression cassette was constructed by connecting a terminator sequence downstream thereof. Then, to these expression cassettes, sequences for the expression cassette of the hygromycin-resistant gene were added for selection of transformants to prepare vectors for TaSAN-A/B/D genome editing (Fig. 20).
  • Sterilization was carried out by immersing in 70% ethanol for 1 minute and 10% antiformin solution for 15 minutes, followed by stirring. After sterilization, the cells were washed with sterilized water three times to remove antiformin. Under a stereoscopic microscope on a clean bench, immature embryos were taken out using tweezers without damaging them, and collected in a 2 mL microtube containing 2 mL of MS infection solution.
  • Composition of MS infection solution 1/10 MS mineral salts and vitamins (Murashige & Skoog, 1962), 10 g/L glucose, 0.5 g/L 2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid (MES), pH 5.8.
  • Agrobacterium (EHA101 strain) was introduced with 500 ng of the TaSAN-A/B/D genome editing vector using the Freeze-thaw method, and LB containing spectinomycin and kanamycin was introduced. It was cultured in a medium (selective medium) at 28°C for 48 hours to obtain colonies. The resulting colonies were liquid-cultured in LB medium at 28° C. for 24 hours, glycerol was added to a final concentration of 30%, and cryopreserved until use.
  • a medium selective medium
  • glycerol was added to a final concentration of 30%, and cryopreserved until use.
  • MG/L liquid medium 5 g/L mannitol, 1 g/L glutamic acid, 250 mg/L KH2PO4, 100 mg/L NaCl, 100 mg/L MgSO4.7H2O , 5 g /L tryptone, 2.5 g/L yeast extract, 1 ⁇ g/L biotin, pH to 7.0. Then, 1 ml of the Agrobacterium suspension was placed in a 1.5 ml microtube, centrifuged at 4° C. and 6000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was discarded.
  • MS infection solid medium 1/10 MS mineral salts and vitamins, 10 g /L glucose, 0.5 g/L MES, 1.25 mg/L CuSO4.5H2O, pH 5.8 , 8 g/L agarose (type I) . Add 100 ⁇ M acetosyringone, 0.85 g/L AgNO 3 after autoclaving.
  • MS resting solid medium MS mineral salts, MS vitamins, 0.5 g/L glutamine, 0.1 g/L casamino acids, 40 g/L maltose, 1.95 g/L MES, 750 mg/L MgCl2.6H2O , pH 5.8, 5 g/L agarose (type I).
  • MS primary selection solid medium MS resting solid medium with cefotaxime removed and 15 mg/L hygromycin B added.
  • MS secondary selection solid medium Hygromycin B of MS primary selection solid medium was doubled to 30 mg/L.
  • MS regeneration solid medium MS mineral salts, MS vitamins, 20 g/L sucrose, 0.5 g/L MES, 2.5 mg/L CuSO4.5H2O, pH 5.8 , 3 g/L gellan gum. After autoclaving, add 5 mg/L zeatin, 30 mg/L hygromycin B, 125 mg/L carbenicillin, 100 mg/L cefotaxime.
  • MS rooting solid medium MS mineral salts, MS vitamins, 15 g/L sucrose, 0.5 g/L MES, 0.1 mg/L Indole-3-butyric acid (IBA), pH 5.8, 3 g/L gellan gum. Add 15 mg/L hygromycin B after autoclaving. Then, the rooted plants were potted up and grown in a closed growth chamber.
  • Genome Extraction from Wheat Leaves About 1 cm of the tip of the selected wheat leaf is collected, placed in a 2 mL plastic tube containing one 6 mm diameter bead, frozen in liquid nitrogen, and crushed with a crusher for 30 seconds. bottom. After that, 400 ⁇ L of DNA buffer (100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA, 1 M KCl) was added, and centrifugation was performed at 8,000 rpm for 15 minutes using a micro high-speed centrifuge. 100 ⁇ L of the resulting supernatant was transferred to a tube containing 100 ⁇ L of isopropanol and mixed.
  • DNA buffer 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA, 1 M KCl
  • Centrifugation was performed at 14,000 rpm for 10 minutes using a high-speed microcentrifuge, and the supernatant was discarded. 200 ⁇ L of 70% ethanol was added to the precipitate, mixed, and centrifuged at 14,000 rpm for 3 minutes. After drying the precipitate, 50 ⁇ L of sterilized water was added to dissolve the precipitate, which was subjected to PCR.
  • TaSAN_A_seqF 5′-CGTTTTGCTGATACTATGGT-3′ (SEQ ID NO: 27) TaSAN_A_seqR1 5′-CACAGTGGTAGCCAAGTCTT-3′ (SEQ ID NO: 28)
  • TaSAN_B_seqF 5′-CATTTGTTGATACTATGGT-3′ (SEQ ID NO: 29) TaSAN_B_seqR1 5′-CACAGTGGTAGCCAAGCCTT-3′ (SEQ ID NO: 30)
  • TaSAN_D_seqF 5′-CGTTTTGCTGATAATATGAT-3′ (SEQ ID NO: 31) TaSAN_D_seqR1 5'-CACAGTGGTAGCCAAGTCTC-3' (SEQ ID NO: 32).
  • Quick Taq HS DyeMix (manufactured by TOYOBO) was used as the PCR enzyme, and the composition of the reaction solution with a total volume of 10 ⁇ L was as follows, and the reaction was performed in an 8-tube tube with a volume of 0.2 mL. 5 ⁇ L of 2 ⁇ Quick Taq HS Dye Mix 10 ⁇ M FW primer 0.2 ⁇ L 0.2 ⁇ L of 10 ⁇ M RV primer Pure water 3.6 ⁇ L DNA extract 1 ⁇ L.
  • a TP600 TaKaRa PCR Thermal Cycler was used as a PCR machine and operated under the following conditions. 94°C for 2 minutes, then 40 cycles of 94°C for 30 seconds, 55°C for 30 seconds and 68°C for 15 seconds. The resulting PCR product was subjected to electrophoresis on a 2% agarose gel to confirm the PCR amplified fragment. Furthermore, the PCR product was subjected to direct sequence analysis using the same primers used in the PCR.
  • TaSAN-A/B/D genes were extracted as homologous genes of the rice SAN gene from the database of the wheat cultivar “Chinese Spring”. Then, based on the obtained gene sequences, vectors for TaSAN-A/B/D genome editing were designed and constructed (FIGS. 19 and 20). The prepared vector was introduced into immature embryos of wheat cultivar Fielder by Agrobacterium-mediated transformation. Transformed wheat was selected by culturing in a medium containing hygromycin. The selected wheat plants were transplanted to culture soil, then DNA was extracted from newly elongated leaves and subjected to PCR to confirm the presence or absence of genome editing.
  • mutations due to genome editing were detected in at least one TaSAN-A/B/D gene in 14 of the 46 transgenic individuals selected.
  • mutations due to genome editing were detected in all TaSAN-A/B/D in 8 of the 14 individuals.
  • base sequences of TaSAN-A/B/D were compared in #3, #34, and #46 out of the 8 individuals, deletions, translocations, inversions, etc. were detected in the regions between the designed gRNAs ( 21, 22, 23).
  • the anther length of these individuals was measured, about 20 to 30% of anther shortening was observed (Figs. 24 and 25).
  • the present invention it is possible to produce wheat having the short anther trait. Because of its short anthers, it is difficult to extract the anthers from the glume of the wheat, so it is useful for preventing diseases (such as Fusarium head blight) caused by infection with Fusarium spp. In addition, the short anthers are difficult to extract from the glume, and pollen is also less likely to scatter, so crossbreeding with other wheat or the like can be suppressed. Therefore, the present invention is useful in the field of agriculture related to wheat.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

ムギの、（ａ）配列番号：１０、１２、１４又は１６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、（ｂ）配列番号：１０、１２、１４又は１６に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、（ｃ）配列番号：１０、１２、１４又は１６に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び（ｄ）配列番号：１０、１２、１４又は１６に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子の機能を人為的に抑制する工程を含む、短葯形質を有するムギの製造方法。

Description

短葯形質を有するムギ、及びその製造方法
　本発明は、短葯形質を有するムギ、及びその製造方法に関する。
　乾燥地に起源するムギ類は、雨の多い我が国での安定生産が難しい。特にフザリウム属菌等によるかび毒は、食中毒や免疫抑制を引き起こし、人や家畜の健康を損なう恐れがある。殺菌性農薬による防除や抵抗性品種によってその低減が試みられてきたが、未だ十分な成果が得られておらず、有効な抵抗性品種の開発が求められている。
　このような抵抗性品種に関し、フザリウム属菌等は開花時に抽出した葯に付着し感染源となるため、閉花受粉性を有するムギは、かかる菌の初期感染に対して抵抗性を示す。
　コムギでは閉花性遺伝資源　Ｕ２４由来の閉花性を導入した小麦中間母本農９号が開発されている（非特許文献１）。この系統は、受精期に頴が開きにくく、葯が抽出しないため、フザリウム属菌等の感染に対して抵抗性を示す。その一方で、長稈で耐倒伏性が劣るため交配後代での選抜には注意が必要とされている。さらに、コムギは六倍体のため、イネやオオムギのように二倍体の単純な遺伝をしない。そのため、フザリウム属菌等の感染に対する抵抗性を付与する有用な遺伝資源が仮に見つかったとしても、効率のよい育種は難しく、ゲノム編集技術やＴＩＬＬＩＮＧ等で同定した変異体の適用が期待されている。
　また、オオムギでは閉花性品種が普及しているものの、当該品種においても葯殻は小花の先端から抽出するため、この葯殻抽出始めの時期は感受性が高くなり、農薬の散布が必要となる（非特許文献２）。
　このように、ムギ類において、葯が頴から抽出し難い形質は、フザリウム属菌等の感染に対する抵抗性の観点から有用である。また、その原因遺伝子は、上記のとおり、ゲノム編集技術やＴＩＬＬＩＮＧ等による変異体作製において有用である。しかしながら、かかる原因遺伝子はムギ類において同定されていない。
　また、このような葯が頴から抽出し難い形質に関し、ムギ類以外では、イネの突然変異体　ｓａｎ－１（ｓｈｏｒｔ　ａｎｔｈｅｒ）が知られている。ｓａｎ－１は、台中６５号（Ｔ６５）を原品種として、化学変異源物質によって誘発された突然変異体であり、葯長が、野生型に比べて約３０％減少する短葯性を示す（非特許文献３）。そして、かかる葯の短さ故、葯が頴から抽出し難い形質も示す。しかながら、この突然変異体の表現型に関与する原因遺伝子は同定されていない。そのため、Ｔ６５以外のイネの品種、更にはイネ以外の植物種において、かかる短葯形質を有する系統を作出することは困難であった。
久保　堅司ら、「閉花性で赤かび病抵抗性に優れる「小麦中間母本農９号」（赤かび系３号）の育成」、九州沖縄農業研究センター報告、２０１２年２月、５７号、２１～３４ページ Ｙｏｓｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ．、Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２００７年、９７巻、１０５４～１０６２ページ 科学研究費助成事業　２０１６年度　研究成果報告書、研究代表者　吉田　均、研究課題名：イネの花器官サイズの制御機構の解明、公開日：２０１８年３月２２日
　本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、ｓａｎ－１における短葯形質に関与する原因遺伝子を同定し、さらに当該原因遺伝子のムギにおける相同遺伝子も同定する。そして、当該遺伝子を標的とする短葯形質を有するムギの製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、前記目的を達成すべく、先ず、短葯形質を有するイネの突然変異体　ｓａｎ－１とイネ品種カサラスを交配し、Ｆ２集団を用いたマップベースクローニングを行った。その結果、原因遺伝子は第５染色体上のマーカーＲＭ１８６３９とＲＭ６８４１の間に存在すると予想された。さらに候補領域を絞り込んだ結果、候補領域はマーカーＩＲＩＣ１１とＲＭ１８７１９の間に存在すると予想された。この候補領域内にはＲＡＰ－ＤＢデータベース上に２０遺伝子が存在していた。次に、遺伝子配列を比較したところ、ｓａｎ－１において、遺伝子Ｏｓ０５ｇ０４２１３００の翻訳開始点から数えて２３６番目のグアニンがアデニンに置換することにより、未成熟終始コドンが生じていることを見出した。
　そこで、当該候補遺伝子（配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子）内の第１エキソンにおいて、異なる２箇所にガイドＲＮＡを設計し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法でのゲノム編集を用いてフレームシフト変異を引き起こした。その結果、いずれのガイドＲＮＡを用いた場合においてもｓａｎ－１と同様の短葯性を示したため、当該遺伝子がｓａｎ－１における短葯形質に関与する原因遺伝子（ＳＡＮ遺伝子）であることを明らかにした。
　次に、公開されているゲノム情報から、オオムギ及びコムギのＳＡＮ相同遺伝子のヌクレオチド配列を取得し、それぞれ、ＨｖＳＡＮ及びＴａＳＡＮ－Ａ／Ｂ／Ｄ（Ａ，Ｂ，Ｄ　各サブゲノムの遺伝子）と名付けた。
　そして、ＨｖＳＡＮのＮ末側に相当する位置（ｔａｒｇｅｔ　１）とＣ末端側に相当する位置（ｔａｒｇｅｔ　２）にそれぞれｇＲＮＡを設計し、オオムギのゲノム編集個体を作出した。また、ＴａＳＡＮ－Ａ／Ｂ／ＤのＮ末端側に相当する位置に、ＴａＳＡＮ－Ａ／Ｂ／Ｄ間で保存されている配列からなる４つのｇＲＮＡ（ｔａｒｇｅｔ　３，４，５，６）を設計し、コムギのゲノム編集個体を作出した。その結果、いずれの標的配列を用いたゲノム編集個体も短葯性を示ししたため、ムギ類においても、ＳＡＮ相同遺伝子の機能を抑制することによって、短葯形質を付与できることが明らかとなり、本発明を完成するに至った。したがって、本発明は以下を提供するものである。
＜１＞　短葯形質を有するムギの製造方法であって、
　ムギの、下記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子の機能を人為的に抑制する工程を含む、方法
（ａ）配列番号：１０、１２、１４又は１６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｂ）配列番号：１０、１２、１４又は１６に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｃ）配列番号：１０、１２、１４又は１６に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子
（ｄ）配列番号：１０、１２、１４又は１６に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子。
＜２＞　下記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子の機能が人為的に抑制された、短葯形質を有するムギ
（ａ）配列番号：１０、１２、１４又は１６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｂ）配列番号：１０、１２、１４又は１６に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｃ）配列番号：１０、１２、１４又は１６に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子
（ｄ）配列番号：１０、１２、１４又は１６に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子。
　本発明によれば、短葯形質を有するムギを製造することが可能となる。当該ムギは、その短葯故、葯が頴から抽出し難いため、フザリウム属菌等の感染による病害（赤かび病等）の予防において有用である。また、短葯は、葯が頴から抽出し難く、さらに花粉も飛散し難くなるため、他のムギ等との交雑を抑制することも可能となる。
イネ突然変異体ｓａｎ－１は短葯形質を有することを示す図である。図中、（Ａ）は、野生型（Ｔ６５）及びｓａｎ－１に関し、外穎を取り除いた穎花を各々観察した結果を示す写真である。（Ｂ）は、野生型と比較してｓａｎ－１は、葯長が３０％程短縮していることを示すグラフである。（Ｃ）は、内穎長においては、野生型とｓａｎ－１とで有意な差はみられないことを示すグラフである。 ｓａｎ－１における原因遺伝子のマッピング経緯を示す、概要図である。原因遺伝子の候補領域であるマーカーＩＲＩＣ１１とＲＭ１８７１９の間において、ＲＡＰ－ＤＢデータベースで推測される遺伝子の領域を矢印で示す。これらの２０遺伝子のうち、遺伝子Ｏｓ０５ｇ０４２１３００がｓａｎ－１の原因遺伝子として同定された。 ｓａｎ－１の原因遺伝子にみられた塩基置換の概要を示す図である。遺伝子Ｏｓ０５ｇ０４２１３００の翻訳開始点から数えて２３６番目のグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に置換することにより、本来トリプトファン（Ｗ）をコードするコドンが未成熟終始コドン（ｓｔｏｐ）に変化していた。 イネＳＡＮ遺伝子の構造を示す、概略図である。イネＳＡＮ遺伝子は、Ｎ末端側にＡＲＭ（Ａｒｍａｄｉｌｌｏ　ｒｅｐｅａｔ）ドメイン、Ｃ末端側にＴＰＲ（ｔｅｔｒａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ　ｒｅｐｅａｔ）ドメインを持つ６０１アミノ酸をコードする。 イネゲノム編集ベクターの概略を示す図である。 イネｓａｎ－ＣＲ１ゲノム編集体における塩基挿入部位を示す、概略図である。イネＳＡＮ遺伝子の翻訳開始点から数えて３９２番目と３９３番目の塩基の間にチミンが挿入することにより、フレームシフトが生じていた。 イネｓａｎ－ＣＲ２ゲノム編集体における塩基挿入部位を示す、概略図である。イネＳＡＮ遺伝子の翻訳開始点から数えて１５３番目と１５４番目の塩基の間にチミンが挿入することにより、フレームシフトが生じていた。 イネＳＡＮゲノム編集体における短葯化を観察した結果を示す、写真である。ｓａｎ－ＣＲ１、ｓａｎ－ＣＲ２いずれのゲノム編集体においても、ｓａｎ－１と同様の短葯性がみられた。 オオムギのＳＡＮ相同遺伝子（ＨｖＳＡＮ遺伝子）の構造とゲノム編集の標的部位を示す、概略図である。遺伝子上流にガイドＲＮＡ　ｔａｒｇｅｔ　１、下流にガイドＲＮＡ　ｔａｒｇｅｔ　２を設計し、ゲノム編集を行った。 オオムギガイドＲＮＡ（ｔａｒｇｅｔ　１）発現ベクターの概略を示す図である。 オオムギガイドＲＮＡ（ｔａｒｇｅｔ　２）発現ベクターの概略を示す図である。 ＳｐＣａｓ９発現ベクターの概略を示す図である。 ＨｖＳＡＮ遺伝子の構造を示す、概略図である。 イネＳＡＮ遺伝子、並びにオオムギ及びコムギのＳＡＮ相同遺伝子等における類縁関係を示す、遺伝子系統樹である。 オオムギＨｖＳＡＮゲノム編集体における塩基挿入部位を示す、概略図である。 ＨｖＳＡＮ　ｔａｒｇｅｔ１　＃１１　Ｔ１ホモ接合体（ｈｏｍｏｚｙｇｏｔｅ、ホモ個体）における短葯化を解析した結果を示す、写真及びグラフである。図中、「Δ５」は、５塩基欠失ホモ個体を示し、「１ｓΔ３」は、１塩基置換及び３塩基欠失ホモ個体を示す。 ＨｖＳＡＮ　ｔａｒｇｅｔ１　＃１１　Ｔ１ヘテロ接合体（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅ、ヘテロ個体）における短葯化を解析した結果を示す、写真である。図中、「Δ５／１ＳΔ３」は、５塩基欠失と１塩基置換３塩基欠失とのヘテロ個体を示す。 ＨｖＳＡＮ　ｔａｒｇｅｔ２　＃０１　Ｔ１ホモ遺伝子型個体における短葯化を解析した結果を示す、写真及びグラフである。図中、「＋Ｇ」は、グアニン１塩基挿入ホモ個体を示し、「ΔＴＧ」は、チミンおよびグアニン２塩基欠失ホモ個体を示す。 コムギのＳＡＮ相同遺伝子（ＴａＳＡＮ遺伝子）の構造とゲノム編集の標的部位を示す概略図である。遺伝子内で４つのｔａｒｇｅｔ　３，４，５，６を設計し、ゲノム編集を行った。 コムギガイドＲＮＡ（ｔａｒｇｅｔ　３，４，５，６）及びＣａｓ９を発現させるためのベクターの概略を示す図である。 コムギゲノム編集体（ＴａＳＡＮ♯３）において導入された変異を示す、概略図である。 コムギゲノム編集体（ＴａＳＡＮ♯３４）において導入された変異を示す、概略図である。 コムギゲノム編集体（ＴＴａＳＡＮ♯４６）において導入された変異を示す、概略図である。 ＴａＳＡＮ♯３のＴ０世代における短葯化を解析した結果を示す、写真である。 ＴａＳＡＮ♯３４及び♯４６のＴ０世代における短葯化を解析した結果を示す、写真及びグラフである。
　後述の実施例に示すとおり、本発明者らは、マップベースクローニング及びゲノム編集法等によって、短葯形質を有するイネの系統であるｓａｎ－１（ｓｈｏｒｔ　ａｎｔｈｅｒ）の表現型に関与する原因遺伝子（ＳＡＮ遺伝子）を同定した。さらに、ＳＡＮ遺伝子子のムギ類における相同遺伝子も同定し、当該遺伝子の機能をゲノム編集法により抑制することによって、野生型のオオムギ及びコムギに短葯形質を付与することに成功した。したがって、本発明の短葯形質を有するムギの製造方法は、前記遺伝子（短葯遺伝子）の機能を人為的に抑制する工程を含むことを特徴とし、より具体的には以下を提供する。
　短葯形質を有するムギの製造方法であって、
　ムギの、下記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子の機能を人為的に抑制する工程を含む、方法
（ａ）配列番号：１０、１２、１４又は１６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｂ）配列番号：１０、１２、１４又は１６に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｃ）配列番号：１０、１２、１４又は１６に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子
（ｄ）配列番号：１０、１２、１４又は１６に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子。
　本発明において、「短葯形質」とは、雄蕊の葯の長さ（葯長）が短縮する形質を意味する。ここで「葯長」とは、略楕円形である葯の縦（長軸）の長さを意味する。また「短縮」とは、例えば、本発明にかかる短葯遺伝子の機能を人為的に抑制する前（例えば、野生型のムギ）と比較して１０％以上（好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上）短くなることが挙げられる。
　本発明において、短葯形質の付与対象となる「ムギ」は、イネ科イチゴツナギ亜科に属するムギ類の植物を意味し、例えば、コムギ、オオムギ、ライムギ、ライコムギ、エンバクが挙げられる。また野生種であってもよく、栽培種であってもよい。さらに、これらムギの遺伝子組み換え体やゲノム編集体（例えば、病害耐性作物、除草剤耐性作物、害虫耐性作物、食味向上作物、保存性向上作物、収量向上作物）であっても良い。このように、本発明において、短葯形質の付与対象となるムギとしては、特に制限はないが、フザリウム属菌等に対する抵抗性がより高いムギを製造するという観点から、閉花性を有するムギが好ましい。かかるムギとしては、より具体的に、マイクロＲＮＡの一種であるｍｉＲ１７２に対して切断抵抗性を示す閉花性ＡＰ２遺伝子（ｃｌｙ１．ｂ型あるいはｃｌｙ１．ｃ型の遺伝子）を有するオオムギ、Ｕ２４、Ｕ５６、ＩＬ４１６若しくはＣｏｒｒｉｎｇｉｎ等の閉花の傾向を示すコムギが挙げられる。さらにまた、同観点から、本発明においては、前記閉花性のような、フザリウム属菌等の初期感染に対する抵抗性を有するムギのみならず、感染後の進展に対する抵抗性を有するムギ、又は、かび毒蓄積に対する抵抗性を有するムギに、短葯形質を付与してもよい。
　本発明において機能抑制の対象となる「短葯遺伝子」として、典型的なアミノ酸配列をコードする遺伝子の例は、下記表１に示すとおりである。
　なお、自然界においてもヌクレオチド配列が変異することは起こり得ることである。そして、それに伴いコードするアミノ酸も変化し得る。したがって、本発明の短葯遺伝子には、その機能が抑制されることによって短葯形質を付与し得る限り、配列番号：１０、１２、１４又は１６に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。
　ここで「複数」とは、通常１２０アミノ酸以内、好ましくは９０アミノ酸以内、より好ましくは６０アミノ酸以内、さらに好ましくは５５アミノ酸以内、より好ましくは５０アミノ酸以内、さらに好ましくは４５アミノ酸以内、より好ましくは４０アミノ酸以内、さらに好ましくは３５アミノ酸以内、より好ましくは３０アミノ酸以内（例えば、２５アミノ酸以内、２０アミノ酸以内、１５アミノ酸以内）、特に好ましくは１０アミノ酸以内（例えば、９アミノ酸以内、８アミノ酸以内、７アミノ酸以内、６アミノ酸以内、５アミノ酸以内、４アミノ酸以内、３アミノ酸以内、２アミノ酸）である。
　さらに、現在の技術水準においては、当業者であれば、特定の遺伝子が得られた場合、その遺伝子のヌクレオチド配列情報を利用して、同種若しくは他の植物から、その相同遺伝子を同定することが可能である。相同遺伝子を同定するための方法としては、例えば、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３，１９７５）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３５０－１３５４，１９８５、Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７－４９１，１９８８）が挙げられる。相同遺伝子を同定するためには、通常、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件としては、６Ｍ　尿素、０．４％　ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣの条件又はこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を例示できる。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ　尿素、０．４％ＳＤＳ、０．１ｘＳＳＣの条件を用いれば、より相同性の高い遺伝子の単離を期待することができる。本発明の短葯遺伝子には、その機能が抑制されることによって短葯形質を付与し得る限り、配列番号：１０、１２、１４又は１６に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号：９、１１、１３又は１５に記載のヌクレオチド配列）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子が含まれる。
　同定された相同遺伝子がコードするタンパク質は、通常、前記特定の遺伝子がコードするそれと高い相同性（高い類似性）、好ましくは高い同一性を有する。ここで「高い」とは、少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）のことである。本発明の短葯遺伝子には、その機能が抑制されることによって短葯形質を付与し得る限り、配列番号：１０、１２、１４又は１６に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性（類似性）又は８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子が含まれる。
　配列の相同性は、ＢＬＡＳＴのプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３－４１０，１９９０）を利用して決定することができる。該プログラムは、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２６４－２２６８，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３－５８７７，１９９３）に基づいている。例えば、ＢＬＡＳＴによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。また、Ｇａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９９７）に記載されているように行うことができる。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
　本発明の「短葯遺伝子の機能の人為的抑制」には、該機能の完全な抑制（阻害）及び部分的な抑制の双方が含まれる。また、短葯遺伝子の発現の人為的抑制の他、短葯遺伝子がコードするタンパク質の活性の人為的抑制が含まれる。そして、かかる人為的抑制は、例えば、短葯遺伝子のコード領域、非コード領域、転写制御領域（プロモーター領域）等に変異を導入することによって行なうことができる。
　本発明において、短葯遺伝子に導入される変異としては、該遺伝子の機能を抑制する限り特に制限はなく、例えば、ヌクレオチドの置換、欠失、付加、及び／又は挿入が挙げられるが、フレームシフト変異、ナンセンス変異、ヌル変異、インフレーム変異、逆位、転座が好ましい。また、本発明において、短葯遺伝子に導入される変異は、かかるヌクレオチドにおける変異を伴わない、エピジェネティック制御における変異であってもよい。エピジェネティック制御としては、例えば、ＤＮＡのメチル化、ヒストンの化学的修飾（アセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化等）が挙げられる。また、短葯遺伝子に導入される変異の個数としても、該遺伝子の機能を抑制する限り特に制限はなく、１個でもよく、また複数個（例えば、２個、３個以下、５個以下、１０個以下、２０個以下、３０個以下、４０個以下、５０個以下）でもよい。
　このような変異としては、例えば、後述の実施例に示すように、配列番号：１６に記載のアミノ酸配列の１３０位又は１３１位以降のアミノ酸（全体の約７８％）の変更又は欠失を伴うヌクレオチド変異、配列番号：１６に記載のアミノ酸配列の５５５又は５５６位以降のアミノ酸（全体の約９％）の変更又は欠失を伴うヌクレオチド変異が挙げられる。そして、このような欠失等により、本発明の短葯遺伝子の機能は抑制され、短葯形質を有するムギを得ることができる。
　したがって、短葯遺伝子に導入される変異としては、当該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列全部を失わせる必要はなく、その一部が失われるか変化するように当該遺伝子内に導入されてもよい。
　なお、遺伝子の変異により発現するタンパク質の一部が欠失する場合、通常、全体の５％以上（例えば、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上）のアミノ酸が変更又は欠失すればよく、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上、さらに好ましくは２５％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは３５％以上、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは４５％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは５５％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）が変更又は欠失していればよい。
　このようにアミノ酸配列が変更又は欠失する領域としては、特に制限はないが、例えば、後述の実施例に示すように、Ｃ末側の領域が挙げられる。また、本発明の短葯遺伝子がコードするアミノ酸配列において、その機能（タンパク質間相互作用等）を発揮する上で重要であると示唆される領域（ＡＲＭ（アルマジロリピート）ドメイン及び／又はＴＰＲ（テトラトリコペプチドリピート））も、アミノ酸配列が変更又は欠失する領域の例として挙げられる。
　また、本発明においては、後述の実施例に示すように、短葯遺伝子における、変異の導入箇所、導入する変異の種類、又はそれらに伴いアミノ酸配列が変更又は欠失する領域を調整することによって、葯長の短縮の程度を制御することも可能となる。例えば、短葯遺伝子の上流（コードするアミノ酸配列において１～４００位に相当する領域）に変異を導入することによって強い短葯化がもたらされる一方で、下流（コードするアミノ酸配列において４０１位以降に相当する領域）に変異を導入することによって弱い短葯化がもたらされる。また、インフレーム変異等でコードするタンパク質の活性を弱めることにより、弱い短葯化をもたらすことも可能となる。
　短葯遺伝子への変異の導入は、当業者であれば公知の変異導入方法により達成することができる。かかる公知の方法としては、ゲノム編集法、物理的変異導入法、化学的変異剤を用いる方法、トランスポゾン等をゲノムＤＮＡに導入する方法、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ及びリボザイム活性を有するＲＮＡ等を用いた、転写産物を標的とする方法が挙げられるが、これらに限定はされない。
　これらの中で、短葯遺伝子を標的として人為的に変異を導入できるという観点から、ゲノム編集法、転写産物を標的とする方法、後述のＴＩＬＬＩＮＧ法が好ましい。
　ゲノム編集法は、部位特異的なヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素等のＤＮＡ二本鎖切断酵素）を利用して、標的遺伝子を改変する方法である。例えば、ＺＦＮｓ（米国特許６２６５１９６号、８５２４５００号、７８８８１２１号、欧州特許１７２０９９５号）、ＴＡＬＥＮｓ（米国特許８４７０９７３号、米国特許８５８６３６３号）、ヌクレアーゼドメインが融合されたＰＰＲ（ｐｅｎｔａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅｒｅｐｅａｔ）（Ｎａｋａｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　５３：１１７１－１１７９（２０１２））等の融合タンパク質や、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９（米国特許８６９７３５９号、国際公開２０１３／１７６７７２号）、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１（Ｚｅｔｓｃｈｅ　Ｂ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６３（３）：７５９－７１，（２０１５））やＴａｒｇｅｔ－ＡＩＤ（Ｋ．Ｎｉｓｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｕｓｉｎｇ　ｈｙｂｒｉｄ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ａｎｄ　ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　ａｄａｐｔｉｖｅ　ｉｍｍｕｎｅ　ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｆ８７２９，（２０１６））等のガイドＲＮＡとタンパク質の複合体、あるいはタンパク質の複合体を用いる方法が挙げられる。
　「Ｃａｓ酵素」としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素、II型ＣＲＩＳＰＲ系酵素、III型ＣＲＩＳＰＲ系酵素等が挙げられるが、II型ＣＲＩＳＰＲ系酵素であるＣａｓ９が好ましい。「Ｃａｓ９」としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のＣａｓ９、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９、Ｓ．サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９等が挙げられるが、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）が好ましい。また、これらの生物に由来するＣａｓ９の変異体であってもよく、ニッカーゼ（一方のＤＮＡ鎖のみにｎｉｃｋを入れるＤＮＡ切断酵素）として機能することが知られているＣａｓ９のＤ１０Ａ変異体であってもよく、Ｃａｓ９ホモログ、又はオルソログであってもよい。
　物理的変異導入法としては、例えば、重イオンビーム（ＨＩＢ）照射、速中性子線照射、ガンマ線照射、紫外線照射が挙げられる（Ｈａｙａｓｈｉら、Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅｉｒ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２００７年、第１８回国際会議、２３７～２３９ページ、及び、Ｋａｚａｍａら、Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００８年、２５巻、１１３～１１７ページ　参照）。
　化学的変異剤を用いる方法としては、例えば、化学変異剤によって種子等を処理する方法（Ｚｗａｒ及びＣｈａｎｄｌｅｒ、Ｐｌａｎｔａ、１９９５年、１９７巻、３９～４８ページ等　参照）が挙げられる。化学変異剤としては特に制限はないが、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソウレア（ＭＮＵ）、エチルメタンスルホート（ＥＭＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－ニトロソウレア（ＥＮＵ）、アジ化ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、ヒドリキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトログアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、Ｏ－メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、蟻酸及びヌクレオチド類似体が挙げられる。
　トランスポゾン等をゲノムＤＮＡに導入する方法としては、例えば、ＴＯＳ１７等のトランスポゾン、Ｔ－ＤＮＡ等を植物のゲノムＤＮＡに挿入する方法が挙げられる（Ｋｕｍａｒら、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ．、２００１年、６巻、３号、１２７～１３４ページ、及び、Ｔａｍａｒａら、Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９年、４巻、３号、９０～９６ページ　参照）。
　以上の方法により変異が導入されたムギについては、公知の方法により、短葯遺伝子に変異が導入されていることを確認することができる。かかる公知の方法としては、例えば、ＤＮＡシークエンス法（次世代シークエンシング法等）、ＰＣＲ法、マイクロアレイを用いた解析法、サザンブロット法、ノーザンブロット法が挙げられる。かかる方法によれば、短葯遺伝子に変異が導入されているか否かを、変異導入前後の当該遺伝子の配列又は長さを比較することによって判断することができる。また、ノーザンブロット法、ＲＴ－ＰＣＲ法、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、マイクロアレイによる解析法等を利用することにより、転写制御領域等に変異が導入されたムギにおいて、短葯遺伝子の転写産物又は翻訳産物の発現量の低下が認められれば、該ムギは短葯遺伝子に変異が導入されたムギであると確認することもできる。
　また、短葯遺伝子に変異が導入されていることを確認する他の方法として、ＴＩＬＬＩＮＧ（標的誘導型ゲノム特定位傷害、Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　Ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｌｏｃａｌ　Ｌｅｓｉｏｎｓ　ＩＮ　Ｇｅｎｏｍｅｓ）が挙げられる（Ｓｌａｄｅら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｒｅｓ．、２００５年、１４巻、１０９～１１５ページ、及び、Ｃｏｍａｉら、Ｐｌａｎｔ　Ｊ．、２００４年、３７巻、７７８～７８６ページ　参照）。特に、前述の重イオンビーム照射や化学的変異剤等を用いてムギのゲノム中に非選択的変異を導入した場合には、短葯遺伝子又はその一部をＰＣＲで増幅した後に、該増幅産物に変異を有する個体を、前記ＴＩＬＬＩＮＧ等により選抜することができる。
　また、上述の方法により変異が導入されたムギと野生型のムギとを交配させ、戻し交配を行うことにより、目的とする遺伝子以外の遺伝子に導入された変異を除去することもできる。
　短葯遺伝子に変異を導入することにより当該遺伝子の機能が抑制されたムギが、短葯遺伝子のヘテロ接合体である場合がある。そのような場合、例えば、かかるヘテロ同士を交配してＦ１植物体を得ることにより、当該Ｆ１植物体から当該変異が導入された短葯遺伝子を有するホモ接合体を選抜する。この場合、「当該変異が導入された短葯遺伝子を有するホモ接合体であるムギ」には、互いに同一である変異を有する短葯遺伝子の対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）を２つ有するムギだけでなく、第１の変異を有し活性が抑制されたタンパク質をコードする第１の短葯遺伝子と、第２の変異を有し活性が抑制されたタンパク質をコードする第２の短葯遺伝子とを有するムギが含まれる。
　本発明において、短葯遺伝子の機能を人為的に抑制するための方法として、上述の変異導入の他、短葯遺伝子の転写産物と相補的なｄｓＲＮＡ（二重鎖ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡ）をコードするＤＮＡを用いる方法、短葯遺伝子の転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ（アンチセンスＤＮＡ）を用いる方法、短葯遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡを用いる方法（リボザイム法）といった、短葯遺伝子の転写産物を標的とする方法も挙げられる。
　本発明において、短葯遺伝子の機能の人為的な抑制は、上述の方法等に応じ、ムギの植物体、種子又は植物細胞に対して行うことができる。植物細胞には、ムギ由来の培養細胞の他、植物体中の細胞も含まれる。さらに、種々の形態のムギ由来の細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルス、未熟胚、花粉等が含まれる。
　また、本発明において、上述の、部位特異的ヌクレアーゼ、融合タンパク質又はガイドＲＮＡとタンパク質の複合体をコードするＤＮＡ、トランスポゾンをコードするＤＮＡ、二重鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ、リボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ等を、ベクターに挿入した形態にてムギの細胞に導入してもよい。
　短葯遺伝子の機能を人為的に抑制するための前記ＤＮＡが挿入されるベクターとしては、ムギの細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はないが、前記ＤＮＡを恒常的又は誘導的に発現させるためのプロモーターを含有しうる。恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、イネのユビキチンプロモーター、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター、イネのアクチンプロモーター、トウモロコシのユビキチンプロモーター等が挙げられる。また、誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布等の外因によって発現することが知られているプロモーター等が挙げられる。さらに、本発明にかかるＤＮＡとしてガイドＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等の短いＲＮＡをコードするＤＮＡを発現させるためのプロモーターとしては、Ｕ６プロモーター等ｐｏｌIII系のプロモーターが好適に用いられる。
　ムギの細胞へ前記ＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されたベクター等を導入する方法としては、例えば、パーティクルボンバードメント法、アグロバクテリウムを介する方法（アグロバクテリウム法）、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）等、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。
　なお、ＤＮＡの形態をとらずとも、上述の、部位特異的ヌクレアーゼ、融合タンパク質、トランスポゾンは、タンパク質として、上述の、ガイドＲＮＡ、二重鎖ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム活性を有するＲＮＡは、ＲＮＡとして、ムギの細胞に導入しても、変異を導入することはできる。
　このように、本発明においては、前記ＤＮＡ、該ＤＮＡが挿入されたベクター、前記タンパク質、前記ＲＮＡといった短葯遺伝子を標的とする物質を用いることにより、ムギに短葯形質を付与することができる。したがって、本発明は、前記ＤＮＡ、該ＤＮＡが挿入されたベクター、前記タンパク質及び前記ＲＮＡからなる群から選択される、短葯遺伝子を標的とする少なくとも１の物質を有効成分として含む、ムギに短葯形質を付与するための薬剤も提供し得る。
　かかる薬剤においては、２種の有効成分を１つの組成物中に含む態様であってもよく、２種の有効成分を別々の組成物中に含む態様（所謂、キット）であってもよい。また、本発明の薬剤においては、上記物質の他、緩衝液、安定剤、保存剤、防腐剤等の他の成分が添加してあってもよい。
　また、上述の方法等により遺伝子の機能が人為的に抑制された細胞からムギの植物体を再生することにより、短葯形質を有するムギを得ることができる。
　例えば、ムギに関する形質転換植物体を作出する手法としては、Ｔｉｎｇａｙら（Ｔｉｎｇａｙ　Ｓ．ｅｔ　ａｌ．Ｐｌａｎｔ　Ｊ．１１：１３６９－１３７６，１９９７）、Ｍｕｒｒａｙら（Ｍｕｒｒａｙ　Ｆ　ｅｔ　ａｌ．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔ　２２：３９７－４０２，２００４）、Ｔｒａｖａｌｌａら（Ｔｒａｖａｌｌａ　Ｓ　ｅｔ　ａｌ．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔ　２３：７８０－７８９，２００５）、Ｖａｓｉｌら（Ｖａｓｉｌ　Ｖ．　ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１０：６６７－６７４，１９９２）、及びＩｓｈｉｄａら（Ｉｓｈｉｄａ　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１２２３：１８９－１９３，２０１５）に記載された方法を挙げることができる。また、Ｔａｂｅｉら（田部井豊　編、「形質転換プロトコール［植物編］」、株式会社化学同人、２０１２年９月２０日出版）に記載に方法等を用い、形質転換及び植物体への再生を行なうことができる。
　（短葯形質を有するムギ）
　上述の方法等により、本発明の短葯遺伝子の機能が人為的に抑制された、短葯形質を有するムギを得ることができる。したがって、本発明は、
　下記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子の機能が人為的に抑制された、短葯形質を有するムギ
（ａ）配列番号：１０、１２、１４又は１６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｂ）配列番号：１０、１２、１４又は１６に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｃ）配列番号：１０、１２、１４又は１６に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子
（ｄ）配列番号：１０、１２、１４又は１６に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子
を提供する。
　なお、短葯遺伝子、その機能の人為的抑制、該抑制によって短葯形質が付与されるムギ等については、上述のとおりである。また、一旦、短葯遺伝子の機能が人為的に抑制されている植物体が得られれば、該植物体から有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることが可能である。さらに、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、切穂、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。したがって本発明には、短葯形質を有するムギの子孫及びクローン、並びに、それらの繁殖材料が含まれる。なお、繁殖材料としては、例えば、種子、株、カルス、プロトプラストが挙げられる。
　＜短葯形質を有するか否かを判定する方法＞
　本発明の、短葯形質を有するか否かを判定する方法は、被検ムギにおける、短葯遺伝子、又はその発現制御領域のヌクレオチド配列を解析することを特徴とする。より具体的には以下のとおりである。
　ムギにおいて短葯形質を有するか否かを判定する方法であって、被検ムギにおける短葯遺伝子又はその発現制御領域のヌクレオチド配列を解析することを特徴とする方法。なお、本発明の判定方法において検出対象となる短葯遺伝子は、上述のとおりである。
　後述の実施例において示すように、短葯遺伝子において、ヌクレオチドの挿入や欠失が導入されることで、葯長が短縮することとなる。したがって、短葯遺伝子領域のヌクレオチド配列を解析することによって、短葯形質を有するか否かを判定することができる。
　また、短葯遺伝子の発現量、並びにその発現量を制御する転写制御領域（エンハンサー、プロモータ－、サイレンサー、インスレーター等）のヌクレオチド配列を解析することによって、短葯形質を有するか否かを判定することもできる。
　短葯遺伝子又はその発現制御領域のヌクレオチド配列の解析に際しては、本発明の短葯遺伝子又はその発現制御領域をＰＣＲにより増幅した増幅産物を用いることができる。前記ＰＣＲを実施する場合において、用いられるプライマーは、短葯遺伝子又はその発現制御領域を特異的に増幅できるものである限り制限はなく、短葯遺伝子又はその発現制御領域の配列情報に基づいて適宜設計することができる。
　なお、短葯形質を有するか否かを判定する方法においては、例えば、「対照のヌクレオチド配列」と比較する工程を含むことができる。被検ムギにおける短葯遺伝子又はその発現制御領域のヌクレオチド配列と比較する「対照のヌクレオチド配列」は、ムギであれば、例えば、配列番号：１０、１２、１４又は１６に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子又はその発現制御領域のヌクレオチド配列である。
　決定した被検ムギにおける短葯遺伝子又はその発現制御領域のヌクレオチド配列と、前記対照のヌクレオチド配列とを比較することにより、被検ムギにおいて短葯形質を有するか否かを判定することができる。例えば、前記対照のヌクレオチド配列（例えば、配列番号：９、１１、１３又は１５）と比較して、ヌクレオチド配列において大きな相違がある場合（特に、新たな終止コドンの出現やフレームシフトにより、コードするタンパク質の分子量やアミノ酸配列に大きな変化が生じる場合）、被検ムギは短葯形質を有するムギである蓋然性が高いと判定される。
　なお、本発明の判定方法における、被検ムギからのＤＮＡの調製は、常法、例えば、ＣＴＡＢ法を用いて行うことができる。ＤＮＡを調製するためのムギとしては、成長した植物体のみならず、種子や幼植物体を用いることもできる。また、ヌクレオチド配列の決定は、常法、例えば、ジデオキシ法やマキサム－ギルバート法などにより行なうことができる。ヌクレオチド配列の決定においては、市販のシークエンスキット及びシークエンサーを利用することができる。
　被検ムギにおける短葯遺伝子又はその発現制御領域のヌクレオチド配列が、対照のヌクレオチド配列と相違するか否かは、上記した直接的な塩基配列の決定以外に、種々の方法により間接的に解析することができる。このような方法としては、例えば、ＰＣＲ－ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一本鎖高次構造多型）法、制限酵素断片長多型（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ／ＲＦＬＰ）を利用したＲＦＬＰ法やＰＣＲ－ＲＦＬＰ法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ）、アレル特異的オリゴヌクレオチド（Ａｌｌｅｌｅ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ／ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション法、リボヌクレアーゼＡミスマッチ切断法が挙げられる。
　本発明の、短葯形質を有するか否かを判定する別の方法は、被検ムギにおける短葯遺伝子の発現又は増幅産物若しくは発現産物の分子量を検出することを特徴とする。より具体的には以下のとおりである。
　ムギにおいて短葯形質を有するか否かを判定する方法であって、被検ムギにおける短葯遺伝子の発現又は増幅産物若しくは発現産物の分子量を検出することを特徴とする方法。
なお、本発明の判定方法において検出対象となる短葯遺伝子は、上述のとおりである。
　後述の実施例において示すように、短葯遺伝子において、ヌクレオチドの挿入や欠失が導入されることにより、発現産物の分子量は低減し、葯長が短縮することとなる。したがって、短葯遺伝子の増幅産物又は発現産物の分子量を検出することによって、短葯形質を有するか否かを判定することができる。また、短葯遺伝子の発現を検出することによって、短葯形質を有するか否かを判定することができる。
　ここで「短葯遺伝子の発現の検出」には、転写レベルにおける検出及び翻訳レベルにおける検出の双方を含む意である。また、「発現の検出」には、発現の有無の検出のみならず、発現の程度の検出も含む意である。
　短葯遺伝子の転写レベルにおける検出は、常法、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ法やノーザンブロッティング法により実施することができる。前記ＰＣＲを実施する場合において用いられるプライマーは、本発明の検出対象ＤＮＡを特異的に増幅できるものである限り制限はなく、既に決定された短葯遺伝子の配列情報に基づいて適宜設計することができる。
　一方、翻訳レベルにおける検出は、常法、例えば、ウェスタンブロッティング法により、実施することができる。ウェスタンブロッティングに用いる抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、これら抗体の調製方法は、当業者に周知である。
　遺伝子発現の検出の結果、被検ムギにおいて、短葯遺伝子の発現量が、例えば、コムギにおいては、Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓｐｒｉｎｇの発現量よりも、またオオムギにおいては、
Ｇｏｌｄｅｎ　Ｐｒｏｍｉｓｅの発現量よりも、有意に低ければ（例えば、短葯遺伝子が実質的に発現していなければ）、短葯形質を有するムギである蓋然性が高いと判定される。また、短葯遺伝子の増幅産物又は発現産物の分子量が、例えば、コムギにおいては、Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓｐｒｉｎｇにおける分子量と、またオオムギにおいては、Ｇｏｌｄｅｎ　Ｐｒｏｍｉｓｅにおける分子量と、有意に異なれば、短葯形質を有するムギである蓋然性が高いと判定される。
　＜短葯形質を有するムギを育種する方法＞
　本発明は、短葯形質を有するムギを育種する方法を提供する。かかる育種方法は、（ａ）短葯形質を有するムギと任意の品種とを交配させる工程、
（ｂ）工程（ａ）における交配により得られた個体の中から、上述の方法により、短葯形質を有すると判定されたムギを、選抜する工程を含む。
　「短葯形質を有するムギ」とは、例えば、上述の短葯遺伝子の機能が抑制されたことにより短葯形質を有するムギが挙げられる。また当該ムギと交配させる「任意の品種」としては、例えば、短葯遺伝子の機能が抑制されておらず短葯形質を有さないムギの品種が挙げられるが、これに制限されない。また、フザリウム属菌等に対する抵抗性がより高いムギを製造するという観点から、任意の品種として上述のｍｉＲ１７２に対して切断抵抗性を示す閉花性ＡＰ２遺伝子（ｃｌｙ１．ｂあるいはｃｌｙ１．ｃ型の遺伝子）を有するオオムギ、Ｕ２４、Ｕ５６、ＩＬ４１６若しくはＣｏｒｒｉｎｇｉｎ等の閉花傾向を示すコムギが好ましい。本発明の育種方法を利用すれば、短葯形質を有するムギの品種を、幼植物等の段階で適宜選抜することが可能となり、当該形質を有する品種の育成を、短期間で行うことが可能となる。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　（実施例１）　イネ短葯変異体の原因遺伝子候補の探索
　イネのｓａｎ－１（ｓｈｏｒｔ　ａｎｔｈｅｒ）突然変異体は、イネ品種Ｔ６５（Ｔａｉｃｈｕｎｇ　６５）を原品種として、化学変異源物質　Ｎ－Ｍｅｔｈｙｌ－Ｎ－ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ（ＭＮＵ）によって誘発された突然変異体集団の中から得られたものである。ｓａｎ－１の葯長は、野生型に比べて約３０％減少する短葯性を示す一方、内穎長には差がみられない特徴を持つ（図１、非特許文献１）。
　しかしながら、この短葯形質の原因遺伝子は明らかにされていなかった。そこで先ず、ｓａｎ－１とイネ品種カサラス（Ｋａｓａｌａｔｈ）を交配し、Ｆ２集団を用いたマップベースクローニングを行った。その結果、原因遺伝子は第５染色体上のマーカーＲＭ１８６３９とＲＭ６８４１の間に存在すると予想された（図２）。
　そこで鋭意検討を重ね、さらに候補領域を絞り込んだ結果、候補領域はマーカーＩＲＩＣ１１とＲＭ１８７１９の間に存在すると予想された。この候補領域内にはＲＡＰ－ＤＢデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｒａｐｄｂ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）上に２０遺伝子存在していた。遺伝子配列を比較したところ、ｓａｎ－１において、遺伝子Ｏｓ０５ｇ０４２１３００の翻訳開始点から数えて２３６番目のグアニンがアデニンに置換することにより、未成熟終始コドンが生じていることを見出した（図３）。同遺伝子は、Ｎ末端側に核局在シグナルとＡＲＭ（Ａｒｍａｄｉｌｌｏ　ｒｅｐｅａｔ）ドメイン、Ｃ末端側にＴＰＲ（ｔｅｔｒａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ　ｒｅｐｅａｔ）ドメインを持つ機能未知のタンパク質をコードする（図４）。
　（実施例２）　遺伝子Ｏｓ０５ｇ０４２１３００を標的とするゲノム編集による短葯化
　前記にて同定された候補遺伝子が、イネ短葯変異体の原因遺伝子であるかを明らかにすべく、以下に示す方法にて、当該遺伝子を標的とするゲノム編集を行い、短葯の形質が発現するかどうかを検証した。
　＜ガイドＲＮＡ及びＳｐＣａｓ９等を発現するためのベクターの構築＞
　遺伝子Ｏｓ０５ｇ０４２１３００のゲノム配列をＲＡＰ－ＤＢデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｒａｐｄｂ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）から取得した。第１エキソンと予測される配列のうち、ゲノム編集の標的とするガイドＲＮＡ配列（２０ｂｐ長）として２カ所を選定した。それぞれをＳＡＮ－ＣＲ１（位置：３７６－３９５番、配列５’－ＣＣＡＴＴＧＧＴＴＧＡＡＣＴＣＴＴＡＣＧ－３’、配列番号：３）及びＳＡＮ－ＣＲ２（位置：１３７－１５６番、配列５’－ＴＴＣＴＣＣＣＴＡＴＴＡＧＴＧＧＴＣＴＴ－３’、配列番号：４）とした。
　そして、それぞれのガイドＲＮＡ及びＳｐＣａｓ９を発現するためのベクター（ゲノム編集系発現ベクター）を、常法に沿って作製した。当該ベクターは、ｐＺＮＨ２ＧＴＲ－‐Ｕ６ＣＲベクター（図５）に基づくものであり、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、ＯｓＵ６－２プロモーターとＳｃａｆｆｏｌｄ配列の間に挿入されている。さらに、ＳｐＣａｓ９をコードするＤＮＡは、イネＵｂｉ１ｂプロモーターとイネＵｂｉ１ｂターミネーター配列との間に挿入されている。また、このゲノム編集系発現ベクターは、形質転換体の選抜用にハイグロマイシン抵抗性遺伝子の発現用カセットの配列を有する。
　＜ゲノム編集イネの作出及び解析＞
　（１）イネカルスへの形質転換
　前記にて作製したゲノム編集系発現ベクターは、Ｏｉｋａｗａら、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５，６８７－７００（２００４）に記載の方法に従って、アグロバクテリウムを介した形質転換により、イネ品種　日本晴のイネ胚盤由来のカルスに導入した。そして、ハイグロマイシンを含む培地で培養することにより、形質転換カルスを選抜した。
　（２）葉からのゲノムＤＮＡの抽出
　ハイグロマイシンにより選抜され再分化させた形質転換イネを、培養土（ボンソル１号）へ移植し、約２週間後に伸長してきた葉の先端約５ｍｍ程度を採取し１．５ｍＬプラスチックチューブに入れ、ＤＮＡを抽出しＰＣＲに供試した。
　（３）ＰＣＲによる、ＳＡＮ　標的変異導入対象箇所のＤＮＡ断片の増幅
　ガイドＲＮＡ　ＳＡＮ－ＣＲ１又はＳＡＮ－ＣＲ２を用いてゲノム編集を引き起こした植物体の、標的変異対象部位を増幅するために使用したプライマー配列は以下のとおりである。
ＳＡＮ－ＣＲ１解析用プライマー
ＳＡＮ＿ＣＲ１＿ｓｅｑＦ　５’－ＴＣＡＡＣＴＴＧＧＧＧＡＴＡＴＴＴＧＡＡＴＧ－３’（配列番号：５）
ＳＡＮ＿ＣＲ１＿ｓｅｑＲ　５’－ＡＣＴＴＣＴＣＣＡＴＧＧＴＣＡＧＣＡＡＣＴ－３’ （配列番号：６）
ＳＡＮ－ＣＲ２解析用プライマー
ＳＡＮ＿ＣＲ２＿ｓｅｑＦ　５’－ＴＣＡＴＴＴＧＴＣＴＣＴＣＡＣＧＡＴＧＧＡ－３’ （配列番号：７）
ＳＡＮ＿ＣＲ２＿ｓｅｑＲ　５’－ＴＧＴＧＣＴＧＣＡＴＡＡＴＡＴＧＧＧＡＴＧ－３’（配列番号：８）。
　ＰＣＲ酵素は、Ｔｋｓ　Ｇｆｌｅｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を使用し、全量１０μＬの反応液組成を以下のとおりとし、０．２ｍＬ容量の８連チューブ内で反応させた。
２×Ｇｆｌｅｘ　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　５μＬ
１００μＭ　Ｆｏｒｗａｒｄ　プライマー　０．２μＬ
１００μＭ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　プライマー　０．２μＬ
Ｔｋｓ　Ｇｆｌｅｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１．２５Ｕ／μＬ）　０．２μＬ
純水　３．４μＬ
ＤＮＡ抽出液　１μＬ。
　ＰＣＲ機は、ＴａＫａＲａ　ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅを使用し、以下の条件で運転した。
９４℃１分、その後９８℃１０秒、５５℃１５秒及び６８℃３０秒を４０サイクル。
　（４）ＰＣＲ増幅断片のシーケンス解析
　ＳＡＮ－ＣＲ１を含む領域のＰＣＲ産物（野生型で断片長３０１ｂｐ）及びＳＡＮ－ＣＲ２を含む領域ＰＣＲ産物（野生型で断片長３２１ｂｐ）を、１％アガロースゲル電気泳動にて展開し、増幅を確認した。増幅が確認されたＰＣＲ産物は、ＥｘｏＳＡＰ－ＩＴ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）により精製し、増幅に用いたＦｏｒｗａｒｄプライマーを用いてダイレクトシーケンス解析を行った。
　（５）葯長の観察
　ＳＡＮゲノム編集体における葯長の観察は、遺伝的に固定したＴ１世代において行った。葯が穎花の中程まで伸長した、開花前の穎花を採取した。ピンセットにより採取した穎花の外穎を取り外し、葯を露出させて実体顕微鏡により葯長を観察した。
　＜ゲノム編集イネの解析結果＞
　上記のとおり、ゲノム編集系発現ベクターをイネカルスに導入し、ハイグロマイシンにより形質転換体を選抜した。当該カルスから再分化させた植物体を、培土入りのポットに移植し隔離温室で育成した。伸長した葉からゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ増幅及びシーケンス解析により、遺伝子Ｏｓ０５ｇ０４２１３００の各ガイドＲＮＡ領域にゲノム編集が生じているか否かを解析した。
　その結果、表２に示すとおり、解析したＴ０世代の実生当たり８３～８５％の割合でゲノム編集が生じていた。
　次いで、ゲノム編集が検出された植物体についてポットに移植し、隔離温室内での栽培を継続し後代種子を取得した。ガイドＲＮＡとしてＳＡＮ－ＣＲ１を使用した系統のうち＃２０－１、ＳＡＮ－ＣＲ２を使用した系統のうち＃１４－１について、Ｔ１世代を育成し各個体のシーケンス解析を行い、ホモ接合体としてゲノム編集が生じている個体を選抜した。その結果、ゲノム編集体　ｓａｎ－ＣＲ１　＃２０－１では遺伝子Ｏｓ０５ｇ０４２１３００の翻訳開始点から数えて３９２番目と３９３番目の塩基の間にチミンが１塩基挿入（図６）、ｓａｎ－ＣＲ２　＃１４－１では１５３番目と１５４番目の塩基の間にチミンが１塩基挿入する変異が生じることにより（図７）、フレームシフトが生じていることを見出した。
　次に、遺伝子Ｏｓ０５ｇ０４２１３００にフレームシフトを引き起こす変異をホモ接合体として持つ、ゲノム編集体ｓａｎ－ＣＲ１　＃２０－１個体及びｓａｎ－ＣＲ２　＃１４－１個体に加え、ゲノム編集が生じていない個体を、隔離温室内で育成し、開花前の穎花を採取した。そして、実体顕微鏡下で外穎を除去し葯を露出させて葯長を比較した。
　その結果、ゲノム編集が生じていない個体と比較して、ｓａｎ－ＣＲ１　＃２０－１及びｓａｎ－ＣＲ２　＃１４－１個体の両方について３０％程度の短葯化が認められた（図８）。
　よって、遺伝子Ｏｓ０５ｇ０４２１３００が、ｓａｎ－１における短葯化の原因遺伝子（ＳＡＮ遺伝子）であることが明らかとなり、当該遺伝子を標的とし、その機能を抑制することによって、イネに短葯形質を付与することが可能となった。
　（実施例３）　オオムギＨｖＳＡＮ遺伝子のゲノム編集による短葯化
　＜オオムギＨｖＳＡＮゲノム情報の取得＞
　ゲノム編集を実施するための基本となる短葯化に関与すると予測されるオオムギゲノム配列を以下の手順で調査し、入手した。
　イネＳＡＮ遺伝子の配列に基づき、公開されている情報から、コムギ（品種「Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓｐｒｉｎｇ」）のＳＡＮ相同遺伝子（ＴａＳＡＮ－Ａ／Ｂ／Ｄ（Ａ、Ｂ、Ｄ　各サブゲノムの遺伝子）の配列を取得した。次いで、コムギＡゲノム上の相同遺伝子と想定されたＴａＳＡＮ－Ａ遺伝子を照会配列として用い、オオムギのゲノム配列を検索した。データベースは、オオムギ品種Ｇｏｌｄｅｎ　Ｐｒｏｍｉｓｅのゲノム配列を格納した「Ｇｏｌｄｅｎ　Ｐｒｏｍｉｓｅ　Ｇｅｎｏｍｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｉｃｓ．ｈｕｔｔｏｎ．ａｃ．ｕｋ／ｇｍａｐｐｅｒ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）」を使用した。本データベースにおいてＢＬＡＳＴ検索を実施し、５，２１３ｂｐの塩基配列を入手した。
　＜ガイドＲＮＡ発現ベクターの構築＞
　ゲノム編集の標的とする配列（２０ｂｐ長）として２カ所を選定した（図９）。それぞれをＨｖＳＡＮ　ｔａｒｇｅｔ１（位置：２２４３－２２６２番）及びＨｖＳＡＮ　ｔａｒｇｅｔ２（４１７６－４１９５番）とした。ＨｖＳＡＮ　ｔａｒｇｅｔ１については、ＨｖＵ３－ｓｇＲＮＡベクター（図１０）のＨｖＵ３プロモーターとＳｃａｆｆｏｌｄ配列の間に挿入し、ＨｖＳＡＮ　ｔａｒｇｅｔ２については、ＨｖＵ６－ｓｇＲＮＡベクター（図１１）のＨｖＵ６プロモーターとＳｃａｆｆｏｌｄ配列間に挿入し、各ガイドＲＮＡ発現ベクターを構築した。
　＜ＳｐＣａｓ９発現ベクターの構築＞
　ＳｐＣａｓ９配列は、既報のＯｓＣａｓ９ｖｅｒ．３を用い、ｐＮＥＢ１９３－ＺｍＵｂｉ－ＯｓＣａｓ９　ｖｅｒ．３ベクター（図１２）として、トウモロコシＵｂｉプロモーター、イネアルコール脱水素酵素遺伝子の５’ＵＴＲ配列の下流に接続したのち、さらに、その下流にＳＶ４０ウィルスの核局在シグナル配列、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓターミネーター及びアグロバクテリウムＮＯＳターミネーター配列を接続し、ＳｐＣａｓ９発現ベクターを作製した。
　＜ゲノム編集オオムギの作出及び解析＞
　１）オオムギ未熟胚培養
　オオムギ品種Ｇｏｌｄｅｎ　Ｐｒｏｍｉｓｅを培養土（ボンソル２号と花三昧を１対１の割合で混和したもの）を詰めたポット（直径約１５ｃｍ×高さ約２０ｃｍ）に種子５粒を播き、２０℃、１２時間日長で栽培した。出穂後（閉花性品種であるため開花日は確認できない。）に未熟種子を採取した。発達段階としては、未熟胚の長径が２ｍｍ程度の時期を目安とした。
　採取した未熟胚は、外穎を外したあと、５０個程度を目安としてガーゼに包み、除菌した。除菌は、順に７０％エタノール３０秒間、１０％アンチホルミン液３０分間に浸し、撹拌することにより行った。除菌後、アンチホルミンを除去するため、滅菌水で３回洗浄した。クリーンベンチ内の実体顕微鏡下で、メスで生長点部分を取り除いたあと、未熟胚を取り出し、胚盤組織側を上に向け、ＭＳＥ３Ｍ培地に置床した。培地一枚当たり約５０個の未熟胚を培地の中心部に並べた。
ＭＳＥ３Ｍ培地の組成：Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　＆　Ｓｋｏｏｇ（１９６２）無機塩類及びビタミン類、１５０ｍｇ／Ｌアスパラギン、１５０ｇ／Ｌマルトース一水和物、２．５ｍｇ／Ｌ　２，４－Ｄ、８ｇ／Ｌ寒天、ｐＨ５．８。
　２）未熟胚に対するパーティクルボンバードメント処理と処理後の培養
　５０μＬの９９．５％エタノールに懸濁した、バイオラッド社製直径０．６ミクロン金粒子２ｍｇに、６μｇのガイドＲＮＡ発現ベクターと５μｇのＳｐＣａｓ９発現ベクターを常法により吸着させ、遠心により沈殿させた後、１００μＬの９９．５％エタノールに再懸濁させ、処理に供試した。
　ボンバードメント処理は、バイオラッド社製ＰＤＳ－１０００／Ｈｅシステムを使用し、行った。マクロキャリアーと呼ばれるプラスチック製ディスクに１０マイクロリットルのベクター吸着金粒子懸濁液を塗布し、エタノールを蒸発させ固定化した。その後は常法により、未熟胚胚盤に金粒子を発射し、細胞内にベクターを導入した。導入の際の発射圧力は９００ｐｓｉとし、ディスク停止位置と未熟胚間の距離は５ｃｍとした。処理後、シャーレをパラフィルムで密閉し、２６℃、暗黒下で培養した。
　翌日、未熟胚をＭＳＥ３培地へ移植し、さらに２６℃、暗黒下で１４日間培養した。
ＭＳＥ３培地の組成：ＭＳ無機塩類及びビタミン類（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　＆　Ｓｋｏｏｇ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．１５、４７３－４９７）、１５０ｍｇ／Ｌアスパラギン、３０ｇ／Ｌシュークロース、２．５ｍｇ／Ｌ　２，４－Ｄ、８ｇ／Ｌ寒天、ｐＨ５．８。
　１４日後、増殖してきた培養物をＳＲ７培地へ移植し、２６℃、１２時間日長下で培養し、植物体の再生を促した。
ＳＲ７培地の組成：２０ｍＭ　ＫＮＯ３、２．５ｍＭ　（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｍＭ　ＣａＣｌ２、１ｍＭ　ＭｇＳＯ４、２ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、Ｒ２微量無機塩（Ｏｈｉｒａ　ｅｔ　ａｌ．、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４、１１１３－１１２１）、Ｂ５ビタミン類（Ｇａｍｂｏｒｇ　ｅｔ　ａｌ．Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．、５０、１５１－１５８）、３０ｇ／Ｌ　マルトース一水和物、１ｍｇ／Ｌ　ＢＡ、８ｇ／Ｌ　寒天、ｐＨ５．８。
　３）葉からのゲノムＤＮＡの抽出
　ＳＲ７培地へ移植したあと、約３週間後に伸張してきた葉の先端約１センチ程度を採取し２ｍＬプラスチックチューブに入れ、ＤＮＡ抽出液（組成：２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，２５ｍＭ　ＮａＣｌ，２．５ｍＭ　ＥＤＴＡ，０．５％　ＳＤＳ，ｐＨ７．５）に浸し、粉砕機マルチビーズショッカー（安井器械）において２０００回転／分、７秒間粉砕し、その後、１５，０００回転／分、５分間遠心分離を行い、上清を得、ＰＣＲに供試した。
　４）ＰＣＲによる、ＨｖＳＡＮ標的変異導入対象箇所のＤＮＡ断片の増幅
　ＨｖＳＡＮ　ｔａｒｇｅｔ１及びＨｖＳＡＮ　ｔａｒｇｅｔ２の標的変異対象部位を増幅するために使用したプライマー配列は以下のとおりである。
ＨｖＳＡＮ　ｔａｒｇｅｔ１解析用プライマー
ＨｖＳＡＮ＿ｔ１＿ＦＷ１　５’－ＧＣＡＧＣＴＣＴＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＧ－３’（配列番号：１９）
ＨｖＳＡＮ＿ｔ１＿ＲＶ１　５’－ＧＣＡＧＧＧＡＡＴＧＴＡＣＴＡＧＧＧＴＡＴＧ－３’（配列番号：２０）
ＨｖＳＡＮ　ｔａｒｇｅｔ２解析用プライマー
ＨｖＳＡＮ＿ｔ２３４＿ＦＷ１　５’－ＧＣＡＴＴＧＴＧＣＣＴＴＣＡＴＡＧＴＣＣ－３’（配列番号：２１）
ＨｖＳＡＮ＿ｔ２３４＿ＲＶ１　５’－ＡＣＴＧＴＣＴＣＣＣＡＣＴＣＴＧＡＧＴＣＡＴ－３’（配列番号：２２）。
　ＰＣＲ酵素は、ＫＯＤ　ＦＸ　Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を使用し、全量１０μＬの反応液組成は以下のとおりとし、０．２ｍＬ容量の８連チューブ内で反応させた。
２×ＫＯＤ　Ｆｘ　Ｎｅｏバッファー　５μＬ
２ｍＭ　ｄＮＴＰミックス　２μＬ
１０μＭ　ＦＷプライマー　０．３μＬ
１０μＭ　ＲＶプライマー　０．３μＬ
ＫＯＤ　ＦＸ　Ｎｅｏ（１Ｕ／μＬ）　０．１μＬ
純水　１．３μＬ
ＤＮＡ抽出液　１μＬ。
　ＰＣＲ機は、ＡＢＩ９７００を使用し、以下の条件で運転した。
９４℃２分、その後９８℃１０秒、６０℃１０秒及び６８℃１５秒を３２サイクル。
　５）ＰＣＲ増幅断片の制限酵素処理と電気泳動
　ＨｖＳＡＮ　ｔａｒｇｅｔ１領域ＰＣＲ産物２５４ｂｐ及びＨｖＳＡＮ　ｔａｒｇｅｔ２領域ＰＣＲ産物３２０ｂｐを、各々ＡｆｌＩＩ及びＢｓｌＩにて制限酵素処理した。制限酵素処理後は、２％アガロースゲルで電気泳動を行った。
　６）シーケンス解析
　ＣＡＰＳ解析により変異が認められたＰＣＲ産物については、Ｚｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＴＯＰＯ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ｐＣＲ－ＢｌｕｎｔＩＩ－Ｔｏｐｏベクター中のクローニングサイトに挿入した後、大腸菌内へ導入することでクローニングし、常法によりコロニーを形成させた。Ｍ１３ユニバーサルプライマー（Ｍ１３－４７及びＲＶ－Ｍ）を用いてコロニーＰＣＲを実施し、得られたＰＣＲ産物を同じくＭ１３ユニバーサルプライマーを用いてシーケンス解析を行った。
Ｔ１世代の個体の場合には、Ｚｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＴＯＰＯ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔを用いたＰＣＲ産物のクローニングは行わずに、（２）のＰＣＲ産物を、ＰＣＲに用いたプライマーを使用しダイレクトシーケンス解析を行った。
　７）葯長の観察
　葯長の観察は、遺伝的に固定したＴ１世代において行った。穂首節（穂軸の下部に認められる基部）と止め葉節（止め葉の基部）の間の長さを目安に個体間での生育時期が同じ頃の穂を採取した。採取した穂から花器官を取り外し、ピンセットで花を解剖し葯を露出させ、その長さを測定した。
　＜ゲノム編集オオムギの解析結果＞
　上記のとおり、「Ｇｏｌｄｅｎ　Ｐｒｏｍｉｓｅ　Ｇｅｎｏｍｅ」データベースにおいて、ＴａＳＡＮ－Ａ遺伝子を照会配列として用いてＢＬＡＳＴ検索を実施し、５，２１３ｂｐ長の塩基配列を入手した。コムギＴａＳＡＮ－Ａ　ｃＤＮＡ配列と照合したところ、本遺伝子は４つのエキソンと３つのイントロンから成り、第２エキソンに翻訳開始コドンを、第３エキソンに終止コドンを持つことが推察された（図１３）。なお、これらＳＡＮ相同遺伝子の推定タンパク質はいずれも、シロイヌナズナの日陰回避反応に関与するＳＡＶ４（SHADE AVIDANCE4）と高い相同性を示した（図１４）。
　そして、ガイドＲＮＡ発現ベクターとＣａｓ９発現ベクターを同時に、パーティクルガンによりオオムギ未熟胚へ打ち込み、その未熟胚から組織培養により植物体を再生させ、ゲノム編集が生じているか否かをＣＡＰＳ解析により調べた。
　その結果、表３に示すとおり、解析した実生当たり、１．７～６．０％の割合でゲノム編集が起こっていた。培養の過程で消失した個体が出たが、ＨｖＳＡＮ　ｔａｒｇｅｔ１を標的としたゲノム編集個体を３個体、一方、ＨｖＳＡＮ　ｔａｒｇｅｔ２では４個体を獲得できた。
　得られた植物体を、ポットに移植し、人工気象器内での栽培を継続したところ、すべて良好な生育を示した。成長した個体において、シーケンス解析を実施した。その結果、ＨｖＳＡＮ　ｔａｒｇｅｔ１では＃１１個体において、ｔａｒｇｅｔ２では＃０１個体において、フレームシフト変異が認められた（図１５）。ＨｖＳＡＮ　ｔａｒｇｅｔ１　＃１１個体は、一対の染色体のうち、一方が５塩基欠失フレームシフト変異で、もう一方が３塩基欠失及び１塩基置換のインフレーム変異であった。ＨｖＳＡＮ　ｔａｒｇｅｔ２　＃０１は両染色体ともフレームシフトを起こしており、２塩基欠失及び１塩基挿入の変異を有していた。
　次に、ＨｖＳＡＮ　ｔａｒｇｅｔ１　＃１１個体及びＨｖＳＡＮ　ｔａｒｇｅｔ２　＃０１個体のＴ１種子を播種し、ダイレクトシーケンス解析によりＴ１個体の遺伝子型を決定した。出穂期まで栽培を進めた後、開花直前の時期に穂を採種し花器を解剖し葯長を測定し、導入された変異と葯長との関係を調査した。
　その結果、いずれの標的配列を用いたゲノム編集個体も短葯性を示した。具体的には、ｔａｒｇｅｔ１　１５塩基欠失ホモ・フレームシフト個体では約４０％の短葯化が認められた（図１６）のに対し、ｔａｒｇｅｔ２のフレームシフト変異（２塩基欠失及び１塩基挿入）ホモ個体では２０％の短葯化が認められた（図１８）。また、ｔａｒｇｅｔ１を標的とした場合においては、インフレームであるにもかかわらず、３塩基欠失１塩基置換ホモ個体においても１８％の短葯化を示した（図１６）、さらにｔａｒｇｅｔ１では５塩基欠失／３塩基欠失１塩基置換のヘテロ個体で２５％の短葯化を示した（図１７）。なお、以上の結果から、ＨｖＳＡＮ遺伝子上のゲノム編集においては、変異の導入箇所及び変異の種類を選ぶことにより、葯長を制御できることが示唆される。
　（実施例４）　コムギＴａＳＡＮ遺伝子のゲノム編集による短葯化
　前記オオムギ同様に、ＳＡＮ遺伝子の機能を抑制することによって、コムギにおいても短葯形質を付与できることを確認すべく、以下に示す方法にて、ゲノム編集を行った。そして、得られたゲノム編集個体の葯を解析した。
　＜ゲノム編集用ベクターの構築＞
　上記のとおり、コムギ品種「Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓｐｒｉｎｇ」のデータベースから、イネＳＡＮ遺伝子の相同遺伝子としてＴａＳＡＮ－Ａ／Ｂ／Ｄ遺伝子を抽出した。ＴａＳＡＮ－Ａ／Ｂ／Ｄ遺伝子をゲノム編集することを目的として、ガイドＲＮＡ発現カセット、Ｃａｓ９発現カセット及びハイグロマイシン抵抗性遺伝子の発現用カセットを含む、ゲノム編集用のベクターを構築した。具体的には先ず、ゲノム編集の標的とするｇＲＮＡ配列（２０　ｂｐ長）をＴａＳＡＮ－Ａ／Ｂ／Ｄ遺伝子のエキソン領域内に４箇所（ｔａｒｇｅｔ　３，４，５，６）設計した（図１９）。各ｇＲＮＡの配列は以下のとおりである。
ｔａｒｇｅｔ　３　５’―ＣＡＴＧＧＣＡＧＣＴＣＴＡＡＴＡＴＧＧＡ―３’（配列番号：２３）
ｔａｒｇｅｔ　４　５’―ＣＣＡＴＴＡＧＴＴＧＡＡＣＴＣＴＴＡＡＧ―３’（配列番号：２４）
ｔａｒｇｅｔ　５　５’―ＧＡＧＴＴＧＣＴＧＴＣＡＧＡＧＣＴＴＴＧ―３’（配列番号：２５）
ｔａｒｇｅｔ　６　５’―ＣＴＣＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＡＡＣＡＧＣＡ―３’（配列番号：２６）。
それぞれのｇＲＮＡをコムギＵ６（ＴａＵ６）プロモーターとｔｒａｃｒＲＮＡ配列の間に挿入し、ガイドＲＮＡ発現カセットを構築した。また、トウモロコシ用にコドンを最適化させたＳｐＣａｓ９をトウモロコシＵｂｉ１プロモーター（ＺｍＵｂｉ１ｐ）の下流に接続し、その下流にターミネーター配列を接続することでＣａｓ９発現カセットを構築した。そして、これら発現カセットに、形質転換体の選抜用にハイグロマイシン抵抗性遺伝子の発現用カセットの配列を加え、ＴａＳＡＮ－Ａ／Ｂ／Ｄゲノム編集用のベクターを作製した（図２０）。
　＜コムギ編集オオムギの作出及び解析＞
　１）コムギ未熟胚の調製
　コムギ品種Ｆｉｅｌｄｅｒを培養土（サカタスーパーミックスＡとニッピ園芸培土を２対１の割合で混合し、緩効性肥料オスモコートエグザクトミニを１ｇ／Ｌとなるよう加えたもの）を入れた直径１８ｃｍのポリポットに種子を６粒播種して、１６℃／１０℃、１０時間日長のガラス室で１２週間ほど育成して、開花直前に２３℃／１６℃、１４時間日長の人工育成室で栽培した。開花約１６日後の穂から未熟種子を採種した。採取した未熟種子は、１００個程度を目安としてガーゼに包み、除菌した。除菌は、順に７０％エタノール１分間、１０％アンチホルミン液１５分間に浸し、撹拌することにより行った。除菌後、アンチホルミンを除去するため、滅菌水で３回洗浄した。クリーンベンチ内の実体顕微鏡下で、ピンセットを使って未熟胚を傷つけないように取り出し、ＭＳ感染溶液を２ｍＬ入れた２ｍＬマイクロチューブに集めた。
ＭＳ感染液の組成：１／１０　ＭＳ無機塩とビタミン（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　＆　Ｓｋｏｏｇ，１９６２）、１０ｇ／Ｌ　グルコース、０．５ｇ／Ｌ　２－（Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）－ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＭＥＳ）、ｐＨ５．８。
　２）アグロバクテリウムの形質転換
　アグロバクテリウム（ＥＨＡ１０１株）に、上記ＴａＳＡＮ－Ａ／Ｂ／Ｄゲノム編集用ベクター５００ｎｇを、Ｆｒｅｅｚｅ－ｔｈａｗ法を用いて導入し、スペクチノマイシン及びカナマイシンを含むＬＢ培地（選択培地）にて２８℃で４８時間培養し、コロニーを得た。得られたコロニーをＬＢ培地にて２８℃で２４時間液体培養し、グリセロールを最終濃度３０％になるように添加し、使用するまで凍結保存した。
　３）アグロバクテリウム感染液の調製
　５０ｍｌの遠沈管に１０ｍｌのＭＧ／Ｌ液体培地を入れ、アグロバクテリウムのグリセロールストック液１０μｌを加えて、２８℃、１７５ｒｐｍで２０時間振とう培養した。
ＭＧ／Ｌ液体培地：５ｇ／Ｌ　マンニトール，１ｇ／Ｌ　グルタミン酸，２５０ｍｇ／Ｌ　ＫＨ２ＰＯ４，１００ｍｇ／Ｌ　ＮａＣｌ，１００ｍｇ／Ｌ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，５ｇ／Ｌ　ｔｒｙｐｔｏｎｅ，２．５ｇ／Ｌ　ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ，１μｇ／Ｌ　ビオチン，ｐＨ　ｔｏ　７．０。
そして、アグロバクテリウム懸濁液１ｍｌを１．５ｍｌマイクロチューブに取り、４℃、６０００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄みを捨てＭＳ感染液１ｍｌに１００μＭとなるようにアセトシリンゴンを加えた。
　４）未熟胚へのアグロバクテリウムの感染
　マイクロチューブに集めた未熟胚を、４℃、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。遠心後、ピペットで液を吸い取り、調製したアグロバクテリウム感染液を１ｍｌ加え、３０秒ボルテックスしてから、３分間静置した。溶液ごと未熟胚を６ｃｍ滅菌シャーレにあけ、ピンセットですくって、ＭＳ感染固形培地に胚盤側を上にして並べた。シャーレはパラフィルムでシールして２３℃、暗黒下で２日間共存培養した。
ＭＳ感染固形培地：１／１０　ＭＳ無機塩とビタミン，１０ｇ／Ｌ　グルコース，０．５ｇ／Ｌ　ＭＥＳ，１．２５ｍｇ／Ｌ　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，ｐＨ５．８，８ｇ／Ｌ　アガロース（ｔｙｐｅ　Ｉ）。オートクレーブ後に１００μＭ　アセトシリンゴン，０．８５ｇ／Ｌ　ＡｇＮＯ３を加える。
　５）組織培養
　共存培養後の未熟胚から胚軸をメスで切り取り、ＭＳレスティング固形培地に胚盤側を上にして並べて、サージカルテープでシールして２５℃、暗黒下で５日間レスティング培養した。
ＭＳレスティング固形培地：ＭＳ無機塩，ＭＳビタミン，０．５ｇ／Ｌ　グルタミン，０．１ｇ／Ｌ　カザミノ酸，４０ｇ／Ｌ　マルトース，１．９５ｇ／Ｌ　ＭＥＳ，７５０ｍｇ／Ｌ　ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ，ｐＨ５．８，５ｇ／Ｌ　アガロース（ｔｙｐｅ　Ｉ）．オートクレーブ後に０．５ｍｇ／Ｌ　２，４－Ｄ，２．２ｍｇ／Ｌ　ピクロラム，１００ｍｇ／Ｌアスコルビン酸，０．８５ｍｇ／Ｌ　ＡｇＮＯ３，２５０ｍｇ／Ｌ　カルベニシリン，１００ｍｇ／Ｌ　セフォタキシムを加える。
レスティング培養後、培養物をＭＳ一次選抜固形培地に移し、サージカルテープでシールして２５℃、暗黒で２週間培養した。
ＭＳ一次選抜固形培地：ＭＳレスティング固形培地からセフォタキシムを除き，１５　ｍｇ／ＬのハイグロマイシンＢを加えたもの。
　次に、一次選抜後の培養物を、ＭＳ二次選抜固形培地に移し、サージカルテープでシールして２５℃、暗黒で３週間培養した。
ＭＳ二次選抜固形培地：ＭＳ一次選抜固形培地のハイグロマイシンＢを倍の３０ｍｇ／Ｌにしたもの。
　次に、二次選抜後の培養物をＭＳ再分化固形培地に移し、パラフィルムでシールして、２５℃、１４時間日長で２週間培養した。
ＭＳ再分化固形培地：ＭＳ無機塩，ＭＳビタミン，２０ｇ／Ｌ　スクロース，０．５ｇ／Ｌ　ＭＥＳ，２．５ｍｇ／Ｌ　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，ｐＨ５．８，３ｇ／Ｌ　ジェランガム。オートクレーブ後、５ｍｇ／Ｌ　ゼアチン，３０ｍｇ／Ｌ　ハイグロマイシンＢ，１２５ｍｇ／Ｌ　カルベニシリン，１００ｍｇ／Ｌ　セフォタキシムを加える。
　次に、再分化してきた緑色のシュートをＭＳ発根培地に植えて、パラフィルムでシールして、２５℃、１４時間日長で２週間培養した。
ＭＳ発根固形培地：ＭＳ無機塩，ＭＳビタミン，１５ｇ／Ｌ　スクロース，０．５ｇ／Ｌ　ＭＥＳ，０．１ｍｇ／Ｌ　Ｉｎｄｏｌｅ－３－ｂｕｔｙｒｉｃ　ａｃｉｄ（ＩＢＡ），ｐＨ５．８，３ｇ／Ｌ　ジェランガム。オートクレーブ後１５ｍｇ／Ｌ　ハイグロマイシンＢを加える。
そして、発根してきた植物体は、鉢上げして閉鎖系育成室で生育させた。
　６）コムギ葉からのゲノム抽出
　選抜されたコムギの葉の先端１センチ程度を採取し、６ｍｍ径のビーズ１個が入った２ｍＬプラスチックチューブに入れ、液体窒素で凍結後、粉砕器で３０秒間粉砕した。その後ＤＮＡバッファー（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１０ｍＭ　ＥＤＴＡ，１Ｍ　ＫＣｌ）４００μＬを入れ、微量高速遠心機により８，０００回転／分、１５分間遠心分離を行った。得られた上清１００μＬを１００μＬのイソプロパノールが入ったチューブに移し替え、混ぜ合わせた。微量高速遠心機により１４，０００回転／分、１０分間遠心分離を行い、上澄み液を捨てた。沈殿に２００μＬの７０％エタノールを加え混和し、１４，０００回転／分、３分間遠心分離を行った。沈殿を乾燥させたのち、５０μＬの滅菌水を加えて沈殿を溶かし、ＰＣＲに供試した。
　７）ＰＣＲによる、ＴａＳＡＮ－Ａ／Ｂ／Ｄ標的変異導入対象箇所のＤＮＡ断片の増幅
　各ＴａＳＡＮ－Ａ／Ｂ／Ｄにおける、ガイドＲＮＡのｔａｒｇｅｔ３，４，５，６の標的変異対象部位を増幅するために使用したプライマー配列は、以下のとおりである。
ＴａＳＡＮ－Ａ用：
ＴａＳＡＮ＿Ａ＿ｓｅｑＦ　５’―ＣＧＴＴＴＴＧＣＴＧＡＴＡＣＴＡＴＧＧＴ―３’　（配列番号：２７）
ＴａＳＡＮ＿Ａ＿ｓｅｑＲ１　５’―ＣＡＣＡＧＴＧＧＴＡＧＣＣＡＡＧＴＣＴＴ―３’　（配列番号：２８）
ＴａＳＡＮ－Ｂ用：
ＴａＳＡＮ＿Ｂ＿ｓｅｑＦ　５’―ＣＡＴＴＴＴＧＴＴＧＡＴＡＣＴＡＴＧＧＴ―３’　（配列番号：２９）
ＴａＳＡＮ＿Ｂ＿ｓｅｑＲ１　５’―ＣＡＣＡＧＴＧＧＴＡＧＣＣＡＡＧＣＣＴＴ―３’　（配列番号：３０）
ＴａＳＡＮ－Ｄ用：
ＴａＳＡＮ＿Ｄ＿ｓｅｑＦ　５’―ＣＧＴＴＴＴＧＣＴＧＡＴＡＡＴＡＴＧＡＴ―３’　（配列番号：３１）
ＴａＳＡＮ＿Ｄ＿ｓｅｑＲ１　５’―ＣＡＣＡＧＴＧＧＴＡＧＣＣＡＡＧＴＣＴＣ―３’　（配列番号：３２）。
　ＰＣＲ酵素は、Ｑｕｉｃｋ　Ｔａｑ　ＨＳ　ＤｙｅＭｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を使用し、全量１０μＬの反応液組成は以下のとおりとし、０．２ｍＬ容量の８連チューブ内で反応させた。
２×　Ｑｕｉｃｋ　Ｔａｑ　ＨＳ　ＤｙｅＭｉｘ　５μＬ
１０μＭ　ＦＷプライマー　０．２μＬ
１０μＭ　ＲＶプライマー　０．２μＬ
純水　３．６μＬ
ＤＮＡ抽出液　１μＬ。
　ＰＣＲ機は、ＴＰ６００　ＴａＫａＲａ　ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒを使用し、以下の条件で運転した。
９４℃２分、その後９４℃３０秒、５５℃３０秒及び６８℃１５秒を４０サイクル。
そして、得られたＰＣＲ産物を２％アガロースゲルでの電気泳動に供し、ＰＣＲ増幅断片の確認を行なった。さらに、ＰＣＲ産物について、前記ＰＣＲ用いた同プライマーを用い、ダイレクトシーケンス解析を行った。
　８）コムギ葯長の観察
　葯長の観察は、ＴａＳＡＮ－Ａ／Ｂ／Ｄ全てにおいてゲノム編集による変異を確認できたＴ０世代の個体において行なった。開花前の穂から花器官を取り外し、ピンセットで花を解剖して葯を取り出し、その長さを測定した。
　＜ゲノム編集コムギの解析結果＞
　上記のとおり、コムギ品種「Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓｐｒｉｎｇ」のデータベースから、イネＳＡＮ遺伝子の相同遺伝子としてＴａＳＡＮ－Ａ／Ｂ／Ｄ遺伝子を抽出した。そして、得られた遺伝子の配列に基づき、ＴａＳＡＮ－Ａ／Ｂ／Ｄゲノム編集用のベクターを設計、作製した（図１９及び２０）。作製したベクターは、アグロバクテリウムを介した形質転換により、コムギ品種Ｆｉｅｌｄｅｒの未熟胚に導入した。ハイグロマイシンを含む培地で培養することにより、形質転換コムギを選抜した。選抜されたコムギ植物体を培養土へ移植し、その後新たに伸長した葉からＤＮＡを抽出し、ゲノム編集の有無を確認するためにＰＣＲに供試した。
　その結果、選抜された４６の形質転換個体のうち１４個体において、ＴａＳＡＮ－Ａ／Ｂ／Ｄの少なくとも１つ遺伝子でゲノム編集による変異が検出された。また、それら１４個体のうち８個体において、ＴａＳＡＮ－Ａ／Ｂ／Ｄ全てでゲノム編集による変異が検出された。８個体のうち♯３、♯３４、♯４６においてＴａＳＡＮ－Ａ／Ｂ／Ｄの塩基配列を比較したところ、設計されたｇＲＮＡ間の領域に欠失や転座・逆位等が検出された（図２１、２２、２３）。そして、これらの個体について葯長を計測したところ、２０～３０％程度の短葯化が認められた（図２４、２５）。
　以上説明したように、本発明によれば、短葯形質を有するムギを製造することが可能となる。当該ムギは、その短葯故、葯が頴から抽出し難いため、フザリウム属菌等の感染による病害（赤かび病等）の予防において有用である。また、短葯は、葯が頴から抽出し難く、さらに花粉も飛散し難くなるため、他のムギ等との交雑を抑制することも可能となる。よって、本発明は、ムギに関する農業分野において有用である。

Claims (2)

  1. 　短葯形質を有するムギの製造方法であって、
    　ムギの、下記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子の機能を人為的に抑制する工程を含む、方法
    （ａ）配列番号：１０、１２、１４又は１６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
    （ｂ）配列番号：１０、１２、１４又は１６に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
    （ｃ）配列番号：１０、１２、１４又は１６に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子
    （ｄ）配列番号：１０、１２、１４又は１６に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子。
  2. 　下記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子の機能が人為的に抑制された、短葯形質を有するムギ
    （ａ）配列番号：１０、１２、１４又は１６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
    （ｂ）配列番号：１０、１２、１４又は１６に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
    （ｃ）配列番号：１０、１２、１４又は１６に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子
    （ｄ）配列番号：１０、１２、１４又は１６に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子。
PCT/JP2023/002935 2022-01-31 2023-01-30 短葯形質を有するムギ、及びその製造方法 WO2023145948A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022013002 2022-01-31
JP2022-013002 2022-01-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023145948A1 true WO2023145948A1 (ja) 2023-08-03

Family

ID=87471761

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2023/002935 WO2023145948A1 (ja) 2022-01-31 2023-01-30 短葯形質を有するムギ、及びその製造方法

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2023145948A1 (ja)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030131376A1 (en) * 1999-08-30 2003-07-10 Okubara Patricia A. Nucleic acid sequences encoding cell wall-degrading enzymes and use to engineer resistance to fusarium and other pathogens
CN1699580A (zh) * 2005-06-21 2005-11-23 中国农业大学 一种调控植物组织或器官凋亡的方法及其专用表达载体
JP2011172562A (ja) * 2010-02-01 2011-09-08 Kanazawa Univ 赤かび病抵抗性植物の作製方法およびその利用
US20140020128A1 (en) * 2012-07-13 2014-01-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Molecular markers for various traits in wheat and methods of use

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030131376A1 (en) * 1999-08-30 2003-07-10 Okubara Patricia A. Nucleic acid sequences encoding cell wall-degrading enzymes and use to engineer resistance to fusarium and other pathogens
CN1699580A (zh) * 2005-06-21 2005-11-23 中国农业大学 一种调控植物组织或器官凋亡的方法及其专用表达载体
JP2011172562A (ja) * 2010-02-01 2011-09-08 Kanazawa Univ 赤かび病抵抗性植物の作製方法およびその利用
US20140020128A1 (en) * 2012-07-13 2014-01-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Molecular markers for various traits in wheat and methods of use

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210040569A1 (en) Methods of identifying, selecting, and producing disease resistant crops
US11479784B2 (en) Modulation of seed vigor
US20220267386A1 (en) Self-compatibility in cultivated potato
EP3696188A1 (en) Gene for resistance to plant disease
CA3138988A1 (en) Gene for parthenogenesis
CN112996804A (zh) 甜菜坏死性黄脉病毒(bnyvv)抗性修饰基因
JP2011120597A (ja) ゲノムｄｎａ断片の選抜方法
JP2022531054A (ja) 植物病害に対する抵抗性の遺伝子
JP6293660B2 (ja) 着粒数が増加したコムギ及びその生産方法、並びにコムギの着粒数を増加させるための薬剤
JP5769341B2 (ja) 植物の開花性／閉花性を支配する遺伝子およびその利用
WO2014208508A1 (ja) 作物の収量に関わる遺伝子及びその利用
WO2023145948A1 (ja) 短葯形質を有するムギ、及びその製造方法
JP5776958B2 (ja) 植物の種子休眠性を支配する遺伝子およびその利用
JP6012016B2 (ja) 単為結果制御遺伝子およびその利用
WO2024043238A1 (ja) 超開花性ムギとその生産方法および評価方法
JP2023111899A (ja) 短葯形質を有するイネ、及びその製造方法
WO2021193865A1 (ja) 温度感受性雄性不稔植物の製造方法
US11795469B2 (en) Scaevola plants with radially symmetrical flowers
Luo et al. Fine mapping of a pistilloid-stamen (PS) gene on the short arm of chromosome 1 in rice
Stanic Increasing Reproductive Output of Brassica napus (canola) Through Manipulation of Shoot Architecture
JP6188074B2 (ja) 植物の種子休眠性を支配するＱｓｄ１遺伝子およびその利用
JP2019126339A (ja) 種子のサイズが増大した植物の製造方法
JP2022162741A (ja) イネ科長日植物の茎葉収量及び種子収量の増加方法
JP5467274B2 (ja) 一次枝梗数を制御する遺伝子及びその利用
EA040147B1 (ru) Растение-восстановитель фертильности

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23747158

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2023577078

Country of ref document: JP