JPWO2019103034A1 - ゲノム編集植物の生産方法 - Google Patents
ゲノム編集植物の生産方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2019103034A1 JPWO2019103034A1 JP2019555333A JP2019555333A JPWO2019103034A1 JP WO2019103034 A1 JPWO2019103034 A1 JP WO2019103034A1 JP 2019555333 A JP2019555333 A JP 2019555333A JP 2019555333 A JP2019555333 A JP 2019555333A JP WO2019103034 A1 JPWO2019103034 A1 JP WO2019103034A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- genome
- gene
- plant
- editing
- genome editing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 title claims abstract description 124
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 208
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 230000008722 morphological abnormality Effects 0.000 claims abstract description 16
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 170
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 48
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 44
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 claims description 40
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 claims description 40
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 36
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims description 32
- 101150012864 ipt gene Proteins 0.000 claims description 24
- 229940123611 Genome editing Drugs 0.000 claims description 23
- 229930008677 glyco alkaloid Natural products 0.000 claims description 21
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 claims description 21
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 17
- 101150031785 WUS gene Proteins 0.000 claims description 10
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 claims description 10
- 101150064205 ESR1 gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101150007515 esr2 gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101150040468 LEC2 gene Proteins 0.000 claims description 8
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 8
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 34
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 27
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 26
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 20
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 20
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 20
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 20
- 101150033156 SSR2 gene Proteins 0.000 description 18
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 18
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 18
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 18
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 18
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 15
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 15
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 14
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 13
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 13
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 12
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 12
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 12
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 12
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 12
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 11
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 10
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 9
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 7
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 6
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 6
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 6
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 6
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 238000004226 microchip electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 6
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 6
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 6
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 5
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 5
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 3
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 3
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 description 3
- 101000629913 Homo sapiens Translocon-associated protein subunit beta Proteins 0.000 description 3
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 3
- 102100026229 Translocon-associated protein subunit beta Human genes 0.000 description 3
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 description 3
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 3
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 102100022266 DnaJ homolog subfamily C member 22 Human genes 0.000 description 2
- 101150013191 E gene Proteins 0.000 description 2
- 102100029951 Estrogen receptor beta Human genes 0.000 description 2
- 240000009088 Fragaria x ananassa Species 0.000 description 2
- 101001010910 Homo sapiens Estrogen receptor beta Proteins 0.000 description 2
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 2
- 244000017020 Ipomoea batatas Species 0.000 description 2
- 235000002678 Ipomoea batatas Nutrition 0.000 description 2
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 2
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 101150060143 PGA1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150003338 PGA2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150088079 PGA3 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150024008 PGA4 gene Proteins 0.000 description 2
- 235000004347 Perilla Nutrition 0.000 description 2
- 244000124853 Perilla frutescens Species 0.000 description 2
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 description 2
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 description 2
- 101150044453 Y gene Proteins 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 108010050516 adenylate isopentenyltransferase Proteins 0.000 description 2
- RXVGBQCEAQZMLW-UHFFFAOYSA-N alpha-solanine Natural products CC1CCC2C(C)C3C(CC4C5CC=C6CC(CCC6(C)C5CCC34C)OC7OC(CO)C(O)C(OC8OC(CO)C(O)C(O)C8O)C7OC9OC(CO)C(O)C(O)C9O)N2C1 RXVGBQCEAQZMLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 2
- ZGVSETXHNHBTRK-OTYSSXIJSA-N solanine Chemical compound O([C@H]1[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O[C@@H]1[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O1)O)O[C@@H]1CC2=CC[C@H]3[C@@H]4C[C@@H]5N6C[C@@H](C)CC[C@@H]6[C@H]([C@@H]5[C@@]4(C)CC[C@@H]3[C@@]2(C)CC1)C)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O ZGVSETXHNHBTRK-OTYSSXIJSA-N 0.000 description 2
- 229940031352 solanine Drugs 0.000 description 2
- 102100023833 ADP-ribosylation factor 5 Human genes 0.000 description 1
- 101000860090 Acidaminococcus sp. (strain BV3L6) CRISPR-associated endonuclease Cas12a Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102100039736 Adhesion G protein-coupled receptor L1 Human genes 0.000 description 1
- 102100039702 Alcohol dehydrogenase class-3 Human genes 0.000 description 1
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 1
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 1
- 240000002234 Allium sativum Species 0.000 description 1
- 244000144730 Amygdalus persica Species 0.000 description 1
- 241000256837 Apidae Species 0.000 description 1
- 240000007087 Apium graveolens Species 0.000 description 1
- 235000015849 Apium graveolens Dulce Group Nutrition 0.000 description 1
- 235000010591 Appio Nutrition 0.000 description 1
- 101710087856 Auxin response factor 5 Proteins 0.000 description 1
- 235000000832 Ayote Nutrition 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 108010040467 CRISPR-Associated Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710172824 CRISPR-associated endonuclease Cas9 Proteins 0.000 description 1
- 240000008574 Capsicum frutescens Species 0.000 description 1
- 241001517197 Cattleya Species 0.000 description 1
- 244000241235 Citrullus lanatus Species 0.000 description 1
- 235000012828 Citrullus lanatus var citroides Nutrition 0.000 description 1
- 241000951471 Citrus junos Species 0.000 description 1
- 235000006481 Colocasia esculenta Nutrition 0.000 description 1
- 244000205754 Colocasia esculenta Species 0.000 description 1
- 241000219112 Cucumis Species 0.000 description 1
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 235000009854 Cucurbita moschata Nutrition 0.000 description 1
- 240000001980 Cucurbita pepo Species 0.000 description 1
- 235000009804 Cucurbita pepo subsp pepo Nutrition 0.000 description 1
- 241000219130 Cucurbita pepo subsp. pepo Species 0.000 description 1
- 235000003954 Cucurbita pepo var melopepo Nutrition 0.000 description 1
- 244000019459 Cynara cardunculus Species 0.000 description 1
- 235000019106 Cynara scolymus Nutrition 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 241000257465 Echinoidea Species 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 235000016623 Fragaria vesca Nutrition 0.000 description 1
- 235000011363 Fragaria x ananassa Nutrition 0.000 description 1
- 101000860092 Francisella tularensis subsp. novicida (strain U112) CRISPR-associated endonuclease Cas12a Proteins 0.000 description 1
- 241000702463 Geminiviridae Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 101000684206 Homo sapiens ADP-ribosylation factor 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000959588 Homo sapiens Adhesion G protein-coupled receptor L1 Proteins 0.000 description 1
- 101000959452 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase class-3 Proteins 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 235000000177 Indigofera tinctoria Nutrition 0.000 description 1
- 235000010254 Jasminum officinale Nutrition 0.000 description 1
- 240000005385 Jasminum sambac Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 1
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 1
- 244000165082 Lavanda vera Species 0.000 description 1
- 235000010663 Lavandula angustifolia Nutrition 0.000 description 1
- -1 LbCpf1 Proteins 0.000 description 1
- 241000234435 Lilium Species 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 241000220225 Malus Species 0.000 description 1
- 235000011430 Malus pumila Nutrition 0.000 description 1
- 235000015103 Malus silvestris Nutrition 0.000 description 1
- 235000016278 Mentha canadensis Nutrition 0.000 description 1
- 244000245214 Mentha canadensis Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101100494367 Mus musculus C1galt1 gene Proteins 0.000 description 1
- 240000008881 Oenanthe javanica Species 0.000 description 1
- 240000007817 Olea europaea Species 0.000 description 1
- 241000233855 Orchidaceae Species 0.000 description 1
- 101150035415 PLT1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150095879 PLT2 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006002 Pepper Substances 0.000 description 1
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 1
- 235000016761 Piper aduncum Nutrition 0.000 description 1
- 240000003889 Piper guineense Species 0.000 description 1
- 235000017804 Piper guineense Nutrition 0.000 description 1
- 235000008184 Piper nigrum Nutrition 0.000 description 1
- 241000758706 Piperaceae Species 0.000 description 1
- 235000006040 Prunus persica var persica Nutrition 0.000 description 1
- 235000014443 Pyrus communis Nutrition 0.000 description 1
- 240000001987 Pyrus communis Species 0.000 description 1
- 235000005733 Raphanus sativus var niger Nutrition 0.000 description 1
- 244000155437 Raphanus sativus var. niger Species 0.000 description 1
- 241000612182 Rexea solandri Species 0.000 description 1
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 241000220222 Rosaceae Species 0.000 description 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 description 1
- 101000910035 Streptococcus pyogenes serotype M1 CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1 Proteins 0.000 description 1
- 235000004338 Syringa vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 244000297179 Syringa vulgaris Species 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 241000219793 Trifolium Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000722921 Tulipa gesneriana Species 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 244000195452 Wasabia japonica Species 0.000 description 1
- 235000000760 Wasabia japonica Nutrition 0.000 description 1
- FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N [4,6-bis(cyanoamino)-1,3,5-triazin-2-yl]cyanamide Chemical compound N#CNC1=NC(NC#N)=NC(NC#N)=N1 FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- TYNQWWGVEGFKRU-AJDPQWBVSA-N alpha-Chaconine Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]([C@H]1O)O[C@H]1[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O1)O)O[C@@H]1CC2=CC[C@H]3[C@@H]4C[C@@H]5N6C[C@@H](C)CC[C@@H]6[C@H]([C@@H]5[C@@]4(C)CC[C@@H]3[C@@]2(C)CC1)C)[C@@H]1O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O TYNQWWGVEGFKRU-AJDPQWBVSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000016520 artichoke thistle Nutrition 0.000 description 1
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000001390 capsicum minimum Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 1
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 1
- 244000013123 dwarf bean Species 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 235000004611 garlic Nutrition 0.000 description 1
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 1
- 235000021331 green beans Nutrition 0.000 description 1
- 210000003701 histiocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 101150104752 iaaH gene Proteins 0.000 description 1
- 101150063121 iaaM gene Proteins 0.000 description 1
- 229940097275 indigo Drugs 0.000 description 1
- COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N indigo powder Natural products N1C2=CC=CC=C2C(=O)C1=C1C(=O)C2=CC=CC=C2N1 COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010079535 indoleacetamide hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N kanamycin A sulfate Chemical group OS(O)(=O)=O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N 0.000 description 1
- 239000004922 lacquer Substances 0.000 description 1
- 239000001102 lavandula vera Substances 0.000 description 1
- 235000018219 lavender Nutrition 0.000 description 1
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 1
- 230000036244 malformation Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000015136 pumpkin Nutrition 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 235000021012 strawberries Nutrition 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 101150046289 tms2 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
Abstract
Description
(a)ゲノム上の特定の遺伝子を標的化したゲノム編集酵素をコードする遺伝子および植物の再分化を誘導または促進するタンパク質をコードする遺伝子を発現する構築物を植物細胞に導入する工程、
(b)工程(a)で得られた植物細胞を培養し、再分化した個体を選抜する工程、および
(c)工程(b)で選抜した個体から、ゲノム編集酵素をコードする遺伝子および植物の再分化を誘導または促進するタンパク質をコードする遺伝子がゲノムに組み込まれていない個体を選抜する工程、を含む方法。
(a)ゲノム編集酵素によりゲノム上の特定の遺伝子に変異が導入されている
(b)ゲノム上に外来遺伝子が組み込まれていない
(c)ゲノム編集酵素によるゲノムの編集後に交配されていない
[8] 栄養繁殖性栽培品種を持つ植物である、[7]に記載のゲノム編集植物。
(a)ゲノム編集酵素によりゲノム上の特定の遺伝子に変異が導入されている
(b)ゲノム上に外来遺伝子が組み込まれていない
(c)ゲノム編集酵素によるゲノムの編集後に交配されていない
このようなゲノム編集植物は、品種維持などの観点から栄養繁殖を行う必要のある植物において、品種の同一性を維持しながらゲノム編集した個体が得られる点で有利である。このような観点から、本発明のゲノム編集植物は、栄養繁殖性栽培品種を持つ植物であることが好ましく、ジャガイモが特に好ましい。
(1)ipt遺伝子を含むベクター構築
Agrobacterium tumefaciens A281株のDNA(特許3905607号)を鋳型に、DDBJに登録されているipt遺伝子の配列(ACCESSION X17432)を基に合成したプライマーU1126:CACCGGTACCCGTTACAAGTATTGCACGTTTTGT(配列番号:1)、U1127:GGATCCATCGATTAAGTGATTATCGAACG(配列番号:2)を用いて、アニール温度55℃にてPCR(30サイクル、タカラバイオ社 PrimeStarを使用)を行い、遺伝子を増幅した。これをpENTR/D-TOPOベクター(サーモフィッシャー社)へクローニングして、遺伝子断片を取得した。
(1)で作製したベクターを凍結融解法により、アグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3101株に導入した。ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3110株を、50ppmのカナマイシンを含むYEB液体培地[5g/lビ−フエキス、1g/l酵母エキス、5g/lペプトン、5g/l蔗糖、2mM硫酸マグネシウム(pH7.2)]にて28℃、12時間振とう培養した。培養液1.5mlを10,000rpmで3分間遠心して集菌後、1.5mlの3%蔗糖を含むMS培地[Murashige & Skoog, Physiol. Plant., 15, 473-497 (1962)]に再懸濁し、感染用菌液とした。
再分化した個体からDNAを抽出した。得られた個体のゲノムに外来遺伝子が組み込まれているか否かは、外来遺伝子として用いたカナマイシン耐性遺伝子を指標に行った。具体的には、カナマイシン耐性遺伝子を特異的に増幅するプライマーTN5-1:CTCACCTTGCTCCTGCCGAGA(配列番号:3)およびTN5-2:CGCCTTGAGCCTGGCGAACAG(配列番号:4)を用い、アニール温度55℃にてPCR(30サイクル、タカラバイオ社 TakaraTaqを使用)を行うことで、個体のゲノムに組み込まれた当該遺伝子を検出した。
(1)bbm遺伝子を含むベクターの構築
シロイヌナズナ(エコタイプ コロンビア)の未熟種子から抽出した全RNAから合成されたcDNA(理化学研究所榊原圭子上級研究員より分与いただいた)を鋳型に、DDBJに登録されているbbm遺伝子の配列(ACCESSION NM_001343497)を基に合成したプライマーU1145:CACCTCTAGAATGAATCAAACCCAACGTTGG(配列番号:7)およびU1146:CTAAGTGTCGTTCCAAACTGAAAAC(配列番号:8)を用い、アニール温度55℃にてPCR(30サイクル、タカラバイオ社 PrimeStarを使用)を行い、遺伝子を増幅した。これをpENTR/D-TOPOベクター(サーモフィッシャー社)へクローニングして、遺伝子断片を取得した。バイナリーベクターpSuehiro105を基本として、カリフラワーモザイクウイルスの35S RNAプロモーター、シロイヌナズナ5’非翻訳配列、bbm遺伝子、シロイヌナズナHSP遺伝子ターミナーターを、それぞれ両端に設定した制限酵素部位を利用して連結し、植物形質転換用ベクターpSuehiro109を作成した(図1)。
(1)で作製したベクターを凍結融解法により、アグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3101株に導入した。ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3110株を、50ppmのカナマイシンを含むYEB液体培地[5g/lビ−フエキス、1g/l酵母エキス、5g/lペプトン、5g/l蔗糖、2mM硫酸マグネシウム(pH7.2)]にて28℃、12時間振とう培養した。培養液1.5mlを10,000rpmにて3分間遠心して集菌後、1.5mlの3%蔗糖を含むMS培地[Murashige & Skoog, Physiol. Plant., 15, 473-497 (1962)]に再懸濁し、感染用菌液とした。
再分化した個体からDNAを抽出した。得られた個体のゲノムに外来遺伝子が組み込まれているか否かは、外来遺伝子として用いたカナマイシン耐性遺伝子を指標に行った。具体的には、カナマイシン耐性遺伝子を特異的に増幅するプライマーTN5-1:CTCACCTTGCTCCTGCCGAGA(配列番号:3)およびTN5-2:CGCCTTGAGCCTGGCGAACAG(配列番号:4)を用い、アニール温度55℃にてPCR(30サイクル、タカラバイオ社 TakaraTaqを使用)を行うことで、個体のゲノムに組み込まれた当該遺伝子を検出した。
(1)再分化促進と形質転換体のネガティブ選抜マーカー遺伝子であるESR2遺伝子を含むベクター構築
シロイヌナズナ(エコタイプ コロンビア)の植物体から抽出した全ゲノムに対して、ESR2遺伝子にはイントロンがないことから、DDBJに登録されている配列(ACCESSION NM_102301)を基に合成したプライマーU1157:CACCTCTAGAATGGAAGAAGCAATCATGAGACT(配列番号:9)、U1158:CTAATAATCATCATGAAAGCAATACTGA(配列番号:10)を用いてアニール温度55℃でPCR(30サイクル、タカラバイオ社 PrimeStarを使用)によって遺伝子を増幅した。これをpENTR/D-TOPOベクター(サーモフィッシャー社)へクローニングし、遺伝子断片を取得した。両端に設定した制限酵素を用いてバイナリーベクターpSuehiro105を基本として、カリフラワーモザイクウイルスの35S RNAプロモーター、シロイヌナズナ5’非翻訳配列、当該遺伝子、シロイヌナズナHSP遺伝子ターミナーターを連結し、植物形質転換用ベクターpSuehiro112を作成した(図1)。
(1)で作製したベクターを凍結融解法により、アグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3101株に導入した。ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3110株を、50ppmのカナマイシンを含むYEB液体培地[5g/lビ−フエキス、1g/l酵母エキス、5g/lペプトン、5g/l蔗糖、2mM硫酸マグネシウム(pH7.2)]にて28℃、12時間振とう培養した。培養液1.5mlを10,000rpm、3分間遠心して集菌後、1.5mlの3%蔗糖を含むMS培地[Murashige & Skoog, Physiol. Plant., 15, 473-497 (1962)]に再懸濁し、感染用菌液とした。
再分化した個体からDNAを抽出した。各形質転換体の評価は外来遺伝子としてカナマイシン耐性遺伝子を含有する個体を、カナマイシン耐性遺伝子の配列を特異的に増幅するプライマーTN5-1:CTCACCTTGCTCCTGCCGAGA(配列番号:3)、及びTN5-2:CGCCTTGAGCCTGGCGAACAG(配列番号:4)を用いてアニール温度55℃でPCR(30サイクル、タカラバイオ社 TakaraTaqを使用)を行うことで検出し、該再分化植物体が形質転換植物体か否かを確認できる。ゲノム編集個体の評価はヘテロ二本鎖移動度分析(HMA:Heteroduplex Mobility Assay)を用いた。SSR2遺伝子の標的配列を挟んだプライマーU1131:TCACATCTTTGGATTGTTCTCTG(配列番号:5)、及びU1017:TGGACCATAAATCATGCCTTC(配列番号:6)を用いてアニール温度55℃でPCR(35サイクル、タカラバイオ社 TakaraTaqを使用)を行いマイクロチップ電気泳動装置 MultiNA(島津製作所)で解析を行った。再分化し供試した個体を確認することで、形質転換されていないがゲノム編集が起きている個体を得ることができる。また、品種の形質が維持され、同時に全アレルに変異が起き、かつ他の遺伝子に変異が入らず、かつステロイドグリコアルカロイドを極めて低下したジャガイモを得ることができる。
(1)再分化促進と形質転換体のネガティブ選抜マーカー遺伝子であるLEC2遺伝子を含むベクター構築
シロイヌナズナ(エコタイプ コロンビア)の未熟種子から抽出した全RNAから合成されたcDNAに対し、DDBJに登録されている配列(ACCESSION NM_102595)を基に合成したプライマーU1155:CCACTCTAGAATGGATAACTTCTTACCCTTTCCCT(配列番号:11)、U1156:TCACCACCACTCAAAGTCGTTAAA(配列番号:12)を用いてアニール温度55℃でPCR(30サイクル、タカラバイオ社 PrimeStarを使用)によって遺伝子を増幅した。これをpENTR/D-TOPOベクター(サーモフィッシャー社)へクローニングし、遺伝子断片を取得した。バイナリーベクターpSuehiro105を基本として、カリフラワーモザイクウイルスの35S RNAプロモーター、シロイヌナズナ5’非翻訳配列、当該遺伝子、シロイヌナズナHSP遺伝子ターミナーターを、それぞれ両端に設定した制限酵素部位を利用して連結し、植物形質転換用ベクターpSuehiro111を作成した(図1)。
(1)で作製したベクターを凍結融解法により、アグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3101株に導入した。ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3110株を、50ppmのカナマイシンを含むYEB液体培地[5g/lビ−フエキス、1g/l酵母エキス、5g/lペプトン、5g/l蔗糖、2mM硫酸マグネシウム(pH7.2)]にて28℃、12時間振とう培養した。培養液1.5mlを10,000rpm、3分間遠心して集菌後、1.5mlの3%蔗糖を含むMS培地[Murashige & Skoog, Physiol. Plant., 15, 473-497 (1962)]に再懸濁し、感染用菌液とした。
再分化した個体からDNAを抽出した。各形質転換体の評価は外来遺伝子としてカナマイシン耐性遺伝子を含有する個体を、カナマイシン耐性遺伝子の配列を特異的に増幅するプライマーTN5-1:CTCACCTTGCTCCTGCCGAGA(配列番号:3)、及びTN5-2:CGCCTTGAGCCTGGCGAACAG(配列番号:4)を用いてアニール温度55℃でPCR(30サイクル、タカラバイオ社 TakaraTaqを使用)を行うことで検出し、該再分化植物体が形質転換植物体か否かを確認できる。ゲノム編集個体の評価はヘテロ二本鎖移動度分析(HMA:Heteroduplex Mobility Assay)を用いた。SSR2遺伝子の標的配列を挟んだプライマーU1131:TCACATCTTTGGATTGTTCTCTG(配列番号:5)、及びU1017:TGGACCATAAATCATGCCTTC(配列番号:6)を用いてアニール温度55℃でPCR(35サイクル、タカラバイオ社 TakaraTaqを使用)を行いマイクロチップ電気泳動装置 MultiNA(島津製作所)で解析を行うことができる。再分化し供試した個体を確認することで、形質転換されていないがゲノム編集が起きている個体を得ることができる。また、品種の形質が維持され、同時に全アレルに変異が起き、かつ他の遺伝子に変異が入らず、かつステロイドグリコアルカロイドを極めて低下したジャガイモを得ることができる。
(1)再分化促進と形質転換体のネガティブ選抜マーカー遺伝子であるESR1遺伝子を含むベクター構築
シロイヌナズナ(エコタイプ コロンビア)の植物体から抽出した全ゲノムに対して、ESR1遺伝子にはイントロンがないことから、DDBJに登録されている配列(ACCESSION NM_101169)を基に合成したプライマーU1163:CACCTCTAGAATGGAAAAAGCCTTGAGAAACTT(配列番号:13)、U1164:CTATCCCCACGATCTTCGG(配列番号:14)を用いてアニール温度55℃でPCR(30サイクル、タカラバイオ社 PrimeStarを使用)によって遺伝子を増幅した。これをpENTR/D-TOPOベクター(サーモフィッシャー社)へクローニングし、遺伝子断片を取得した。バイナリーベクターpSuehiro105を基本として、カリフラワーモザイクウイルスの35S RNAプロモーター、シロイヌナズナ5’非翻訳配列、当該遺伝子、シロイヌナズナHSP遺伝子ターミナーターを、それぞれ両端に設定した制限酵素部位を利用して連結し、植物形質転換用ベクターpSuehiro114を作成した(図1)。
(1)で作製したベクターを凍結融解法により、アグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3101株に導入した。ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3110株を、50ppmのカナマイシンを含むYEB液体培地[5g/lビ−フエキス、1g/l酵母エキス、5g/lペプトン、5g/l蔗糖、2mM硫酸マグネシウム(pH7.2)]にて28℃、12時間振とう培養した。培養液1.5mlを10,000rpm、3分間遠心して集菌後、1.5mlの3%蔗糖を含むMS培地[Murashige & Skoog, Physiol. Plant., 15, 473-497 (1962)]に再懸濁し、感染用菌液とした。
再分化した個体からDNAを抽出した。得られた個体のゲノムに外来遺伝子が組み込まれているか否かは、外来遺伝子として用いたカナマイシン耐性遺伝子を指標に行った。具体的には、カナマイシン耐性遺伝子を特異的に増幅するプライマーTN5-1:CTCACCTTGCTCCTGCCGAGA(配列番号:3)およびTN5-2:CGCCTTGAGCCTGGCGAACAG(配列番号:4)を用い、アニール温度55℃にてPCR(30サイクル、タカラバイオ社 TakaraTaqを使用)を行うことで、個体のゲノムに組み込まれた当該遺伝子を検出した。
(1)再分化促進と形質転換体のネガティブ選抜マーカー遺伝子であるWUS遺伝子を含むベクター構築
シロイヌナズナ(エコタイプ コロンビア)の花茎から抽出した全RNAから合成されたcDNAに対し、DDBJに登録されているWUS遺伝子の配列(ACCESSION NM_127349)を基に合成したプライマーU1187:CACCACTAGTATGGAGCCGCCACAGCATCA(配列番号:15)、U1188:AGATCTAGTTCAGACGTAGCTCAAGAGAAG(配列番号:16)を用いてアニール温度55℃でPCR(30サイクル、タカラバイオ社 PrimeStarを使用)によって遺伝子を増幅した。これをpENTR/D-TOPOベクター(サーモフィッシャー社)へクローニングし、遺伝子断片を取得した。バイナリーベクターpSuehiro105を基本として、カリフラワーモザイクウイルスの35S RNAプロモーター、シロイヌナズナ5’非翻訳配列、当該遺伝子、カリフラワーモザイクウイルスの35S RNAターミナーターを、それぞれ両端に設定した制限酵素部位を利用して連結し、植物形質転換用ベクターpSuehiro119を作成した(図1)。
(1)で作製したベクターを凍結融解法により、アグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3101株に導入した。ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3110株を、50ppmのカナマイシンを含むYEB液体培地[5g/lビ−フエキス、1g/l酵母エキス、5g/lペプトン、5g/l蔗糖、2mM硫酸マグネシウム(pH7.2)]にて28℃、12時間振とう培養した。培養液1.5mlを10,000rpm、3分間遠心して集菌後、1.5mlの3%蔗糖を含むMS培地[Murashige & Skoog, Physiol. Plant., 15, 473-497 (1962)]に再懸濁し、感染用菌液とした。
再分化した個体からDNAを抽出した。各形質転換体の評価は外来遺伝子としてカナマイシン耐性遺伝子を含有する個体を、カナマイシン耐性遺伝子の配列を特異的に増幅するプライマーTN5-1:CTCACCTTGCTCCTGCCGAGA(配列番号:3)、及びTN5-2:CGCCTTGAGCCTGGCGAACAG(配列番号:4)を用いてアニール温度55℃でPCR(30サイクル、タカラバイオ社 TakaraTaqを使用)を行うことで検出し、該再分化植物体が形質転換植物体か否かを確認できる。ゲノム編集個体の評価はヘテロ二本鎖移動度分析(HMA:Heteroduplex Mobility Assay)を用いた。SSR2遺伝子の標的配列を挟んだプライマーU1131:TCACATCTTTGGATTGTTCTCTG(配列番号:5)、及びU1017:TGGACCATAAATCATGCCTTC(配列番号:6)を用いてアニール温度55℃でPCR(35サイクル、タカラバイオ社 TakaraTaqを使用)を行いマイクロチップ電気泳動装置 MultiNA(島津製作所)で解析を行うことができる。再分化し供試した個体を確認することで、形質転換されていないがゲノム編集が起きている個体を得ることができる。また、品種の形質が維持され、同時に全アレルに変異が起き、かつ他の遺伝子に変異が入らず、かつステロイドグリコアルカロイドを極めて低下したジャガイモを得ることができる。
<223> 人工的に合成されたプライマー配列
Claims (11)
- ゲノム上の特定の遺伝子に変異が導入され、かつ、ゲノム上に外来遺伝子が組み込まれていないゲノム編集植物を生産する方法であって、
(a)ゲノム上の特定の遺伝子を標的化したゲノム編集酵素をコードする遺伝子および植物の再分化を誘導または促進するタンパク質をコードする遺伝子を発現する構築物を植物細胞に導入する工程、
(b)工程(a)で得られた植物細胞を培養し、再分化した個体を選抜する工程、および
(c)工程(b)で選抜した個体から、ゲノム編集酵素をコードする遺伝子および植物の再分化を誘導または促進するタンパク質をコードする遺伝子がゲノムに組み込まれていない個体を選抜する工程、を含む方法。 - 工程(a)における構築物の植物細胞への導入がアグロバクテリウム法により行われる、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)における植物細胞の培養が植物ホルモンを含まない培地で行われる、請求項1または2に記載の方法。
- 工程(c)において、形態異常が生じていない個体を選抜する、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- 植物の再分化を誘導または促進するタンパク質をコードする遺伝子が、ipt遺伝子、bbm遺伝子、ESR1遺伝子、ESR2遺伝子、LEC2遺伝子、およびWUS遺伝子からなる群より選択される遺伝子である、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 請求項1から5のいずれかに記載の方法により生産されたゲノム編集植物。
- 以下の(a)から(c)の特徴を有するゲノム編集植物。
(a)ゲノム編集酵素によりゲノム上の特定の遺伝子に変異が導入されている
(b)ゲノム上に外来遺伝子が組み込まれていない
(c)ゲノム編集酵素によるゲノムの編集後に交配されていない - 栄養繁殖性栽培品種を持つ植物である、請求項7に記載のゲノム編集植物。
- ジャガイモである、請求項8に記載のゲノム編集植物。
- ゲノム編集酵素によりステロイドグリコアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子に変異が導入されている、請求項9に記載のゲノム編集植物。
- ステロイドグリコアルカロイドの蓄積が減少している、請求項10に記載のゲノム編集植物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017226643 | 2017-11-27 | ||
JP2017226643 | 2017-11-27 | ||
PCT/JP2018/042972 WO2019103034A1 (ja) | 2017-11-27 | 2018-11-21 | ゲノム編集植物の生産方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2019103034A1 true JPWO2019103034A1 (ja) | 2021-01-14 |
JP7282382B2 JP7282382B2 (ja) | 2023-05-29 |
Family
ID=66631032
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019555333A Active JP7282382B2 (ja) | 2017-11-27 | 2018-11-21 | ゲノム編集植物の生産方法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11608505B2 (ja) |
JP (1) | JP7282382B2 (ja) |
CA (1) | CA3083443A1 (ja) |
WO (1) | WO2019103034A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP4002993A4 (en) * | 2019-07-30 | 2024-01-10 | Pairwise Plants Services Inc | MORPHOGENE REGULATORS AND METHODS OF USE THEREOF |
CN114369615A (zh) * | 2022-01-25 | 2022-04-19 | 云南中烟工业有限责任公司 | 一种基于混池文库创制基因编辑植株的高通量分子鉴定方法及应用 |
CN115191348B (zh) * | 2022-07-28 | 2023-06-06 | 安康市农业科学研究院 | 一种魔芋突变体的批量诱导方法 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH09154580A (ja) * | 1994-11-09 | 1997-06-17 | Nippon Paper Ind Co Ltd | 植物への遺伝子導入用ベクター、並びにこれを用いた遺伝子導入植物の作成方法及び植物への遣伝子多重導入方法 |
JP2015000060A (ja) * | 2013-06-18 | 2015-01-05 | キリン株式会社 | ステロイド骨格の16位を酸化する酵素をコードする遺伝子および該遺伝子の発現が低下した植物体 |
WO2016116032A1 (en) * | 2015-01-19 | 2016-07-28 | Institute Of Genetics And Developmental Biology,Chinese Academy Of Sciences | A method for precise modification of plant via transient gene expression |
WO2016119703A1 (zh) * | 2015-01-27 | 2016-08-04 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种通过基因瞬时表达对整株植物定点改造的方法 |
WO2016125078A1 (en) * | 2015-02-02 | 2016-08-11 | Cellectis | Agrobacterium-mediated genome modification without t-dna integration |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9598699B2 (en) | 2009-08-28 | 2017-03-21 | Kirin Holdings Kobushiki Kaisha | Protein having glycoalkaloid biosynthetic enzyme activity and gene encoding the same |
WO2013073699A1 (ja) | 2011-11-17 | 2013-05-23 | キリンホールディングス株式会社 | グリコアルカロイド生合成酵素活性を有するタンパク質とそれをコードする遺伝子 |
JP5902801B2 (ja) | 2012-03-23 | 2016-04-13 | キリンホールディングス株式会社 | ステロイド骨格の24位を還元する酵素をコードする遺伝子および該遺伝子の発現が低下した植物体 |
-
2018
- 2018-11-21 CA CA3083443A patent/CA3083443A1/en active Pending
- 2018-11-21 JP JP2019555333A patent/JP7282382B2/ja active Active
- 2018-11-21 WO PCT/JP2018/042972 patent/WO2019103034A1/ja active Application Filing
- 2018-11-21 US US16/767,355 patent/US11608505B2/en active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH09154580A (ja) * | 1994-11-09 | 1997-06-17 | Nippon Paper Ind Co Ltd | 植物への遺伝子導入用ベクター、並びにこれを用いた遺伝子導入植物の作成方法及び植物への遣伝子多重導入方法 |
JP2015000060A (ja) * | 2013-06-18 | 2015-01-05 | キリン株式会社 | ステロイド骨格の16位を酸化する酵素をコードする遺伝子および該遺伝子の発現が低下した植物体 |
WO2016116032A1 (en) * | 2015-01-19 | 2016-07-28 | Institute Of Genetics And Developmental Biology,Chinese Academy Of Sciences | A method for precise modification of plant via transient gene expression |
WO2016119703A1 (zh) * | 2015-01-27 | 2016-08-04 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种通过基因瞬时表达对整株植物定点改造的方法 |
WO2016125078A1 (en) * | 2015-02-02 | 2016-08-11 | Cellectis | Agrobacterium-mediated genome modification without t-dna integration |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
MA, J., ET AL., GENOME EDITING IN POTATO PLANTS BY AGROBACTERIUM-MEDIATED TRANSIENT EXPRESSION OF TR, JPN6019004630, ISSN: 0004980108 * |
SAWAI, S., ET AL., STEROL SIDE CHAIN REDUCTASE 2 IS A KEY ENZYME IN THE BIOSYNTHESIS OF CHOLESTEROL,, JPN6019004631, ISSN: 0004980109 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP7282382B2 (ja) | 2023-05-29 |
US20200385747A1 (en) | 2020-12-10 |
WO2019103034A1 (ja) | 2019-05-31 |
CA3083443A1 (en) | 2019-05-31 |
US11608505B2 (en) | 2023-03-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6521669B2 (ja) | 標的dnaに変異が導入された植物細胞、及びその製造方法 | |
US10487336B2 (en) | Methods for selecting plants after genome editing | |
AU2014378946B2 (en) | Modified plants | |
JP2019523011A (ja) | 植物における塩基編集のための方法 | |
US20140363561A1 (en) | Tal-mediated transfer dna insertion | |
US20200354735A1 (en) | Plants with increased seed size | |
JP7282382B2 (ja) | ゲノム編集植物の生産方法 | |
WO2018151155A1 (ja) | 植物ウイルスベクターを利用したゲノム編集植物の生産方法 | |
JP2022533813A (ja) | 単為生殖のための遺伝子 | |
US20190127755A1 (en) | Construct and vector for intragenic plant transformation | |
Chang et al. | Robust CRISPR/Cas9 mediated gene editing of JrWOX11 manipulated adventitious rooting and vegetative growth in a nut tree species of walnut | |
JP2023544753A (ja) | 単為生殖遺伝子の改変されたプロモーター | |
CN110881367A (zh) | 一种玉米事件t抗-4及其使用方法 | |
US20230270073A1 (en) | Compositions and methods comprising plants with modified anthocyanin content | |
Schaart et al. | Novel plant breeding techniques. Consequences of new genetic modification-based plant breeding techniques in comparison to conventional plant breeding | |
EP4082332A1 (en) | Solanaceous plant and solanaceous plant cell having resistance to tomato spotted wilt virus, and method for producing solanaceous plant | |
US20210348177A1 (en) | Generation of heritably gene-edited plants without tissue culture | |
US10047369B2 (en) | Citrus derived transcription and translation regulatory elements for tissue specific expression | |
US11932862B1 (en) | Genetic regulatory elements | |
Schaart et al. | Novel plant breeding techniques | |
WO2021193865A1 (ja) | 温度感受性雄性不稔植物の製造方法 | |
AU2018253628B2 (en) | Construct and vector for intragenic plant transformation | |
Zhong et al. | Mutation of GmDMP genes triggers haploid induction in soybean | |
Weiguo et al. | Applicatios of Genetic Engineering in Mulberry | |
Fujita et al. | In planta transformation technique for grapevines (Vitis vinifera L) using dormant buds |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A80 | Written request to apply exceptions to lack of novelty of invention |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A801 Effective date: 20200526 |
|
A80 | Written request to apply exceptions to lack of novelty of invention |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A80 Effective date: 20200609 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200713 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20211012 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220901 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20221018 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20221226 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230202 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230322 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230508 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230510 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7282382 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |