CN115191348B - 一种魔芋突变体的批量诱导方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种魔芋突变体的批量诱导方法，涉及生物技术领域。该方法包括以下步骤：将魔芋根状茎或球茎经催芽处理后切块，之后将所得切块置于含有EMS诱变剂的培养基中进行诱变培养；诱变培养后的切块进行60Co‑γ诱变处理；60Co‑γ诱变处理后的切块直接诱导不定芽分化出幼苗；所述幼苗进行生根培养，之后移栽培养，收获得到小球茎。本发明的方法不仅能快速诱导出大量突变个体，且过程操作简单、可重复性强、种资创新丰度高，为魔芋品种的定向筛选和选育提供了丰富的材料来源。

Description

一种魔芋突变体的批量诱导方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种魔芋突变体的批量诱导方法。
背景技术
目前已知的魔芋各地方种、野生种及育成品种在富硒能力、抗旱抗病性、KGM含量、繁殖及膨大性等方面均存在不同程度缺陷。如花魔芋，分布广、种植历史长，且种芋膨大性好，但繁殖倍数低，抗性较差。再如白魔芋，品质高、抗病抗旱性较强，但膨大性较差，且只适合部分地域环境种植。另外还有近些年发展较热的珠芽魔芋，在膨大性、抗病抗旱性等方面均表现较好，但对光、热、水份等要求较高，一般需设施化种植，并且KGM含量较低。另外，现有的魔芋传统杂交体系尚不十分成熟，如纯合体难获得、自交系未建立、全基因组序列不清楚、远缘杂交难突破等。同时，利用现代生物技术手段，如转基因技术、原生质体融合技术及诱变技术等进行魔芋育种的研究太少，从而造成了魔芋新品种选育时间长、效率低，以及后代种资创新程度低、可选范围窄。
发明内容
本发明的目的是提供一种魔芋突变体的批量诱导方法，以解决上述现有技术存在的问题，本发明的方法不仅能快速诱导出大量突变个体，且过程操作简单、可重复性强、种资创新丰度高，为魔芋品种的定向筛选和选育提供了丰富的材料来源。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种魔芋突变体的批量诱导方法，包括以下步骤：
(1)将魔芋根状茎或球茎经催芽处理后切块，之后将所得切块置于含有诱变剂的培养基中进行诱变培养；所述诱变剂为：0.8％-1.2％EMS+2.0-4.0mg/L 6-BA+0.5-1.0mg/LKT+0.1-0.2mg/L 2.4-D+0.2％-0.4％二甲基亚砜；
(2)诱变培养后的切块进行60Co-γ诱变处理；
(3)60Co-γ诱变处理后的切块直接诱导不定芽分化出幼苗；
(4)所述幼苗进行生根培养，之后移栽培养，收获得到小球茎。
进一步地，在步骤(1)中，在催芽处理前，所述魔芋根状茎或球茎经过了去顶芽处理。
进一步地，在步骤(1)中，所述催芽处理包括对所述魔芋根状茎或球茎喷施激素溶液的操作，所述激素溶液:1.0-2.0mg/L 6-BA+0.1-0.2mg/L KT+0.2-0.5mg/L NAA+0.1-0.2mg/L GA3。
进一步地，在步骤(1)中，所述催芽处理的温度为18-22℃，湿度为30-40％。
进一步地，在步骤(1)中，除诱变剂外，所述培养基包括：MS基础培养基+30g/L蔗糖+4.2g/L琼脂，pH5.8-6.0。
进一步地，在步骤(2)中，辐照剂量率为20Gy/min，辐照剂量为120-180Gy。
进一步地，在步骤(3)中，直接诱导不定芽分化出幼苗的培养基为：MS基础培养基+1.0-2.0mg/L KT+0.2-0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+4.2g/L琼脂，pH5.8-6.0。
进一步地，在步骤(3)中，直接诱导不定芽分化出幼苗的培养条件包括：光照强度1500-2000LX，光照时间12/12h，温度25-28℃，湿度50-60％。
进一步地，在步骤(4)中，所述生根培养的培养基为：1/2MS基础培养基+1.0-1.5mg/L NAA+0.1-0.2mg/L 2,4-D+20g/L蔗糖+4.2g/L琼脂，pH5.8-6.0。
进一步地，在步骤(4)中，所述生根培养的条件包括：光照强度1500-2000LX，光照时间8/16h，室温25-28℃，湿度50-60％。
本发明公开了以下技术效果：
为了解决现有技术魔芋新品种选育时间长、效率低，以及后代种资创新程度低、可选范围窄的技术问题，本发明提供了一种魔芋突变体的批量诱导方法。突变体的用途主要有：(1)提高现有品种的抗性或品质等。如针对花魔芋突变体，可从中选育出抗性强、繁殖性好的突变个体；而对白魔芋突变体，可从中选育膨大性较好的突变个体；珠芽魔芋则可选择植株矮化、KGM含量高的突变个体。(2)利用突变体进行定向筛选。如利用不同形态、不同浓度硒源对突变体进行定向筛选，选育出富硒或高聚硒魔芋品种等。(3)其他用途。可在突变体中筛选出早出苗、耐寒、耐贮存、皮厚、球茎光滑、芽窝浅等不同特性的突变个体。
本发明通过化学和物理诱变相结合的方法，通过简单的一步成苗培养即可得到魔芋突变体植株，减少了魔芋新品种的选育时间，提高了育种效率，并且诱变率可达16.31％以上。
本发明的方法不仅能快速诱导出大量突变个体，且过程操作简单、可重复性强、种资创新丰度高，为魔芋品种的定向筛选和选育提供了丰富的材料来源。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为魔芋根状茎潜伏芽萌发图；
图2为实施例1获得的小球茎播种后，出现的突变类型，植株矮化、主枝生长不对称、叶形卷曲、缺刻；
图3为实施例1获得的小球茎播种后，出现的突变类型，主枝多分支、小叶柄分支较少、株型异常；
图4为实施例1获得的小球茎播种后，出现的突变类型，株型分散、叶形细长、叶边缘呈波浪状弯曲；
图5为实施例1获得的小球茎播种后，出现的突变类型，株型分散、主枝少分支、小叶柄多分支；
图6为实施例1获得的小球茎播种后，出现的突变类型，主枝少分支、株型异常；
图7为实施例1获得的小球茎播种后，出现的突变类型，主枝生长不一致、叶萎缩卷曲；
图8为实施例1获得的小球茎播种后，出现的突变类型，植株矮化、多主枝、小叶柄无分支；
图9为实施例1获得的小球茎播种后，出现的突变类型，主枝分支萎缩、叶萎缩、缺刻；
图10为实施例1获得的小球茎播种后，出现的突变类型，典型窄叶变异；
图11为实施例1获得的小球茎播种后，出现的突变类型，主枝多分支，主枝生长不对称，大叶；
图12为实施例1获得的小球茎播种后，出现的突变类型，主枝少分支，小叶柄多分支，且叶绿素含量高于常规7.44％以上；
图13为魔芋球茎潜伏芽萌发图；
图14为实施例2获得的小球茎播种后，出现的突变类型，典型Y型变异；
图15为实施例2获得的小球茎播种后，出现的突变类型，大叶、叶片增厚、主枝少分支；
图16为实施例2获得的小球茎播种后，出现的突变类型，多主枝，小叶柄少分支；
图17为实施例2获得的小球茎播种后，出现的突变类型，典型扇形变异；
图18为实施例2获得的小球茎播种后，出现的突变类型，大叶、多主枝、少分支；
图19为实施例2获得的小球茎播种后，出现的突变类型，典型X型变异；
图20为实施例2获得的小球茎播种后，出现的突变类型，大叶、多叶、主枝分支异常；
图21为实施例2获得的小球茎播种后，出现的突变类型，极度矮化，叶柄3.8cm；
图22为实施例2获得的小球茎播种后，出现的突变类型，叶柄底纹、斑点均出现变异，叶柄颜色异常，叶型较紧凑；
图23为实施例2获得的小球茎播种后，出现的突变类型，出现多叶，且各植株均出现变异，集中表现为主枝少分支，株型生长不对称。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
1、材料来源及取材时间
(1)材料来源
根状茎：选用当年2～3龄花魔芋球茎生产的根状茎，短的可选7-12cm，长的可选12-18cm，质量在10-20g，周身不定芽芽点在3个以上。
(2)取材时间
在当年的11月上中旬对收获的根状茎进行挑选，选择表皮光滑、芽眼饱满、顶芽短壮、无破损且无病虫眼的白魔芋。
2、根状茎前处理
(1)根状茎的分拣
在当年的10月中下旬--11月上旬进行开挖，边挖边将根状茎从球茎上掰离，同时将球茎与根状茎按大小规格分别装框；这样不仅可以防止在装框过程中，造成根状茎的挤压和折断，还可使根状茎与球茎掰离的伤口能够得到及时晾晒。
(2)清洗
将挑选好的根状茎，于流水下清洗，注意清洗时要用小毛刷沿芽点周边进行擦洗，不可直接用海绵、棉网或是戴手套进行搓洗，这样会导致不定芽芽点被破坏。
(3)去顶芽
根状茎清洗晾干后，选择晴天利用小凹勺将根状茎顶芽轻轻削除，削除厚度在0.1-0.3cm；去除顶芽后及时于太阳下晾晒。
(4)切面处理
将植物伤口愈合剂(国光糊涂植物伤口愈合剂)与6-BA(2-4mg/L)、KT(1-2mg/L)按3：1：1的体积比混匀后，涂于切面处，然后于阴处晾干，最后在室内弱光环境下放置3周，待切面形成愈伤组织层或凸起。
(5)晾晒
阴雨天，将根状茎摊晾于大棚或储藏库的网架上(可移动最好)，保持根状茎底部处于透气状态，切不可放于塑料薄膜上，或底部实心的盆里，或谷壳稻草上或直接铺于地面上，以免引起底部腐烂；晴天则置于室外晾晒，一般晴天连续晾晒3-4天，失水在10-15％之间，至切面发白硬化，而根状茎尾部则逐渐萎缩干瘪。
(6)消毒
晾晒完的根状茎于密闭空间里，利用KMnO4和稀酸按质量比1:1.2进行过夜熏杀；另外，利用如菇房用熏烟等不定期对根状茎和库房进行消毒。同时，发现霉烂病变的种芋及时清除，并撒上消毒粉对周围进行消毒。
(7)越冬贮藏
将根状茎于库房进行摊晾架藏，白天适时开窗或利用排风扇、空调等进行通风换气，晚上维持库房温度在8-10℃，湿度在40-50％。
3、无菌室催芽
(1)催芽时间
选择在2月上旬对根状茎进行催芽处理，此时期根状茎已基本解除休眠，且提前去除顶芽在最大程度上解除了顶端优势对不定芽的抑制，易快速诱导出根状茎周身的不顶芽。
(2)催芽措施
将无菌薄棉布铺于钢丝网上，棉布厚度在0.3-0.5cm，透气保湿性较好，将根状茎均匀置于棉布上。钢丝网较稀疏，钢丝间距在2-5cm。放置完种芋，再在其上盖一块薄棉布，棉布大小较铺于底层的棉布长宽分别多出3-5cm。接着将钢丝网置于培养架上，培养架中空，两层培养架间距为40-50cm。最后利用黑色遮光布从培养架顶层垂直放下，盖住整个培养架四周。其中，钢丝网、棉布、遮光布及种芋等均先经消毒处理。
(3)激素配制
1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L KT+0.5mg/L NAA+0.2mg/L GA3，刺激不定芽加速生长分化。激素溶解后过滤除菌，然后无菌水定容至所需浓度。
(4)催芽处理
将步骤(3)配好的激素溶液倒入不锈钢盆中，利用手钳将钢丝网提起，将底部棉布浸于处理液中，待棉布润湿即可；另外，利用喷壶将激素溶液均匀喷到根状茎种芋表面，待表面湿润即可；再将上层棉布也浸于处理液中，润湿后盖于芋鞭上，最后放置于培养架上。
整个操作过程中，无菌室处于暗光环境中，所用器械均先消毒灭菌处理；操作人员佩戴口罩头套，用后的激素溶液倒入废液桶中。每次处理完，无菌室均用紫外和臭氧进行照射和熏杀。
处理时间：
选择在2月集中处理两次，一次处理5天，间隔7-10天，再处理5天。每天上午8点和下午5点各处理一次，培养期间室内温度18-22℃，湿度30-40％。
(5)不定芽萌发
在2月下旬及3月上旬即可见根状茎上不定芽萌发，芽头白嫩或粉嫩，有的呈原点状，在根状茎表面，有的近似呈圆锥形，突出根状茎表面，如图1。
(6)晾晒
根状茎不定芽萌发后，利用噻菌铜(500倍液)、腐熟基质及泥沙按2：5：1(V/W/W)的比例拌湿混匀后，裹于种芋表面，然后于太阳下晾晒2天(晴天早上9-11点以及下午4-6点，忌晴天中午高温强光暴晒)，使种芋干燥、失水、杀菌及起保护萌发的嫩芽的作用等。
4、离体诱变处理
在多次重复试验的基础上发现，单独用EMS对魔芋切块和切段进行诱变培养，常造成切块和切段褐化严重，芽萎缩、生长缓慢或不生长，苗弱、畸形以及死亡等现象；而EMS低浓度长时间或高浓度短时间诱变培养，对芽的分化及后期幼苗的生长均会造成不可逆的影响，畸形率较高，有效突变率极低。因此，本技术方法在EMS溶液中加入不同浓度细胞分裂素及生长素，并降低EMS浓度和诱变时间，在诱变的同时促进芽的快速生长分化，以利于EMS的诱变；同时，在EMS短时低浓度诱变后，辅以低辐照剂量的60Co-γ射线处理，发现有效突变率及较单独EMS短时高浓度培养或长时低浓度培养，提高了8.39％以上，且畸形化率较低，利于优良突变体的筛选(表1)。
(1)根状茎消毒
根状茎催完芽后于超净台上用0.10wt％次氯酸钠溶液浸泡30min，无菌水清洗4遍，然后于70wt％乙醇中浸泡45s，无菌水清洗3遍；再于无菌托盘上用滤纸吸干表面水分，待用。
(2)根状茎切段
根据每个根状茎上不定芽的分布、数量和芽的大小等对根状茎进行切段，保持每个切段上平均留有1-2个芽点，切段平均长1.5-2cm，切块平均大小1-2cm3，置于无菌托盘中，待用。
(3)EMS诱变培养
配制培养基(培养基：MS基础培养基+30g/L蔗糖+4.2g/L琼脂，pH6.0)，待培养基温度冷却至40-50℃，加入由EMS、6-BA、KT、2.4-D和二甲基亚砜组成的诱变剂，使得混匀后上述诱变剂的各组分含量为：0.8wt％EMS+4mg/L 6-BA+1mg/L KT+0.1mg/L 2.4-D+0.2wt％二甲基亚砜，之后分装于培养瓶中。每瓶接种1个，接种时切段横向插入培养基中，保证不定芽接触到培养基。光照培养2周，光照强度1000-1500LX，光照时间6h/18h，室温设定为25-28℃，湿度50％-60％。培养瓶外用黑色遮光膜包裹，保证培养基处于暗环境中。
(4)60Co-γ诱变处理
将上述EMS诱变培养后的切段用无菌水清洗干净，于超净台晾干，然后利用60Co-γ进行辐照，辐照剂量率为20Gy/min，辐照剂量设定为120Gy。
(5)一步成苗培养
将上述诱变后的切段用无菌水清洗3-4遍，于超净台晾干，然后转接于幼苗分化培养基，每瓶接种1个，接种时切段竖起插入培养基中，直接诱导不定芽分化出幼苗。光照培养3-4周，光照强度1500-2000LX，光照时间12/12h，室温设定为25-28℃，湿度50％-60％。
幼苗分化培养基：MS基础培养基+1.0mg/L KT+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+4.2g/L琼脂，pH5.8。
(6)生根培养
3-4周后待不定芽芽鞘长至1-2cm或分化出幼苗，按每个切段上不定芽生长情况，继续对切段进行切分，保持每个切段上留有1个完整芽或幼苗。再将切段转接至生根培养基中，设置光照强度1500-2000LX，光照时间8/16h，室温25-28℃，湿度50-60％。光照培养15-20天，即可在不定芽基部分化出3-5条、长0.5-1.5cm的不定根。
生根培养基：1/2MS基础培养基+1.0mg/L NAA+0.2mg/L 2,4-D+20g/L蔗糖+4.2g/L琼脂，pH5.8。
5、移栽
将切段及切块用无菌水洗净根部培养基后，于阴凉处炼苗5天，再于水培室利用定植篮雾培技术进行培养，45天左右即可收获10-20g的小球茎。
6、获得突变体
经过诱变处理后，获得突变体，其中包括大叶、多叶、叶色及叶形变异、分支异常、缺刻、矮化、株型分散或紧凑等多种突变类型。
本实施例的诱变率为16.31％。
本实施例获得的小球茎播种后，出现的系列突变类型有：
如图2所示，植株矮化、主枝生长不对称、叶形卷曲、缺刻；
如图3所示，主枝多分支、小叶柄分支较少、株型异常；
如图4所示，株型分散、叶形细长、叶边缘呈波浪状弯曲；
如图5所示，株型分散、主枝少分支、小叶柄多分支；
如图6所示，主枝少分支、株型异常；
如图7所示，主枝生长不一致、叶萎缩卷曲；
如图8所示，植株矮化、多主枝、小叶柄无分支；
如图9所示，主枝分支萎缩、叶萎缩、缺刻；
如图10所示，典型窄叶变异；
如图11所示，主枝多分支，主枝生长不对称，大叶；
如图12所示，主枝少分支，小叶柄多分支，且叶绿素含量高于常规7.44％以上。
实施例2
1、材料来源及取材时间
(1)材料来源
①球茎：选用当年收获的2龄白魔芋球茎，质量在50-100g，周身不定芽芽点在6-8个以上。
(2)取材时间
在当年的11月上中旬对收获的球茎进行挑选，选择表皮光滑、芽眼饱满、顶芽短壮、无破损且无病虫眼的花魔芋球茎。
2、球茎前处理
(1)球茎的分拣
在当年的10月中下旬--11月上旬进行开挖，边挖边将根状茎从球茎上掰离，同时将球茎与根状茎按大小规格分别装框；这样不仅可以防止在装框过程中，造成根状茎的挤压和折断，还可使根状茎与球茎掰离的伤口能够得到及时晾晒。
(2)清洗
将挑选好的球茎，于流水下清洗，注意清洗时要用小毛刷沿芽点周边进行擦洗，不可直接用海绵、棉网或是戴手套进行搓洗，这样会导致不定芽芽点被破坏。
(3)去顶芽
球茎清洗晾干后，选择晴天沿球茎的芽窝一圈将整个顶芽挑出，顶芽去除深度在0.2-0.5cm，去除顶芽后及时于太阳下晾晒。
(4)切面处理
将植物伤口愈合剂(国光糊涂植物伤口愈合剂)与6-BA(4mg/L)、KT(1mg/L)按4：1：1的体积比混匀后，涂于切面处，然后于阴处晾干，最后在室内弱光环境下放置2-3周，待切面形成愈伤组织层或凸起。
(5)晾晒
阴雨天，将球茎摊晾于大棚或储藏库的网架上(可移动最好)，保持球茎底部处于透气状态，切不可放于塑料薄膜上，或底部实心的盆里，或谷壳稻草上或直接铺于地面上，以免引起底部腐烂；晴天则置于室外晾晒，一般晴天连续晾晒3-4天，失水在10％-15％之间，至切面发白硬化。
(6)消毒
晾晒完的球茎于密闭空间里，利用KMnO4和稀酸按质量比1:1.5进行过夜熏杀；另外，利用如菇房用熏烟等不定期对球茎和库房进行消毒。同时，发现霉烂病变的种芋及时清除，并撒上消毒粉对周围进行消毒。
(7)越冬贮藏
将球茎于库房进行摊晾架藏，白天适时开窗或利用排风扇、空调等进行通风换气，晚上维持库房温度在8-10℃，湿度在40-50％。
3、无菌室催芽
(1)催芽时间
选择在2月上旬对球茎进行催芽处理，此时期球茎已基本解除休眠，且提前去除顶芽在最大程度上解除了顶端优势对不定芽的抑制，易快速诱导出球茎周身的不顶芽。
(2)催芽措施
将无菌薄棉布铺于钢丝网上，棉布厚度在0.3-0.5cm，透气保湿性较好，将球茎均匀置于棉布上。钢丝网较稀疏，钢丝间距在2-5cm。放置完种芋，再在其上盖一块薄棉布，棉布大小较铺于底层的棉布长宽分别多出3-5cm。接着将钢丝网置于培养架上，培养架中空，两层培养架间距为40-50cm。最后利用黑色遮光布从培养架顶层垂直放下，盖住整个培养架四周。其中，钢丝网、棉布、遮光布及球茎等均先经消毒处理。
(3)激素配制
2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L KT+0.2mg/L NAA+0.1mg/L GA3，刺激不定芽加速生长分化。激素溶解后过滤除菌，然后无菌水定容至所需浓度。
(4)催芽处理
将步骤(3)配好的激素溶液倒入不锈钢盆中，利用手钳将钢丝网提起，将底部棉布浸于处理液中，待棉布润湿即可；另外，利用喷壶将激素溶液均匀喷到球茎表面，待球茎表面湿润即可；再将上层棉布也浸于处理液中，润湿后盖于芋鞭上，最后放置于培养架上。
整个操作过程中，无菌室处于暗光环境中，所用器械均先消毒灭菌处理；操作人员佩戴口罩头套，用后的激素溶液倒入废液桶中。每次处理完，无菌室均用紫外和臭氧进行照射和熏杀。
处理时间：
选择在2月集中处理两次，一次处理7天，间隔7天，再处理7天。每天上午8点和下午5点各处理一次，培养期间室内温度18-22℃，湿度30-40％。
(5)不定芽萌发
在2月下旬及3月上旬即可见球茎上不定芽萌发，芽头白嫩或粉嫩，有的呈原点状(图13)。
(7)晾晒
球茎不定芽萌发后，利用噻菌铜(800倍液)、腐熟基质及泥沙按3：3：1(V/W/W)比例拌湿混匀后，裹于种芋表面，然后于太阳下晾晒3天(晴天早上9-11点以及下午4-6点，忌晴天中午高温强光暴晒)，使种芋干燥、失水、杀菌及保护萌发的嫩芽等。
4、离体诱变处理
(1)球茎消毒
球茎催完芽后于超净台上用0.15wt％次氯酸钠溶液浸泡20min，无菌水清洗5遍，然后于70wt％乙醇中浸泡1min，无菌水清洗4遍；再于无菌托盘上用滤纸吸干表面水分，待用。
(2)球茎切块
根据每个球茎上不定芽的分布、数量和芽的大小等对球茎进行切块，保持每个切块上平均留有1-2个芽点，切块平均大小1-2cm3，置于无菌托盘中，待用。
(3)EMS诱变培养
配制培养基(培养基：MS基础培养基+30g/L蔗糖+4.2g/L琼脂，pH5.8)，待培养基温度冷却至40-50℃，加入由EMS、6-BA、KT、2.4-D和二甲基亚砜组成的诱变剂，使得混匀后，上述诱变剂的各组分含量为：1.2wt％EMS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L KT+0.2mg/L 2.4-D+0.4wt％二甲基亚砜，之后分装于培养瓶中。每瓶接种1个，切块侧向接入培养基中，保证不定芽接触到培养基。光照培养10天，光照强度1000-1500LX，光照时间6h/18h，室温设定为25-28℃，湿度50％-60％。培养瓶外用黑色遮光膜包裹，保证培养基处于暗环境中。
(4)60Co-γ诱变处理
将上述EMS诱变培养后的切块用无菌水清洗干净，于超净台晾干，然后利用60Co-γ进行辐照，辐照剂量率为20Gy/min，辐照剂量设定为180Gy。
(5)一步成苗培养
将上述诱变后的切块用无菌水清洗4遍，于超净台晾干，然后转接于幼苗分化培养基，每瓶接种1个，接种时切块切口向下接入培养基中，直接诱导不定芽分化出幼苗。光照培养3-4周，光照强度1500-2000LX，光照时间12/12h，室温设定为25-28℃，湿度50％-60％。
幼苗分化培养基：MS基础培养基+2.0mg/L KT+0.2mg/L NAA+30g/L蔗糖+4.2g/L琼脂，pH5.8。
(6)生根培养
3-4周后待不定芽芽鞘长至1-2cm或分化出幼苗，按每个切块上不定芽生长情况，继续对切块进行切分，保持每个切块上留有1个完整芽或幼苗。再将切块转接至生根培养基中，设置光照强度1500-2000LX，光照时间8/16h，室温25-28℃，湿度50-60％。光照培养15-20天，即可在不定芽基部分化出3-5条、长0.5-1.5cm的不定根。
生根培养基：1/2MS基础培养基+1.5mg/L NAA+0.1mg/L 2,4-D+20g/L蔗糖+4.2g/L琼脂，pH6.0。
5、移栽
将切块用无菌水洗净根部培养基后，于阴凉处炼苗7天，再于水培室利用定植篮雾培技术进行培养，45天左右即可收获10-20g的小球茎。
6、获得突变体
经过诱变处理后，获得突变体，其中包括大叶、多叶、叶色及叶形变异、分支异常、缺刻、矮化、株型分散或紧凑等多种突变类型。本实施例的诱变率为18.25％。
本实施例获得的小球茎播种后，出现的系列突变类型有：
如图14所示，典型Y型变异；
如图15所示，大叶、叶片增厚、主枝少分支；
如图16所示，多主枝，小叶柄少分支；
如图17所示，典型扇形变异；
如图18所示，大叶、多主枝、少分支；
如图19所示，典型X型变异；
如图20所示，大叶、多叶、主枝分支异常；
如图21所示，极度矮化，叶柄3.8cm；
如图22所示，叶柄底纹、斑点均出现变异，叶柄颜色异常，叶型较紧凑；
如图23所示，出现多叶，且各植株均出现变异，集中表现为主枝少分支，株型生长不对称。
对比例1
同实施例1，区别在于，将“4、离体诱变处理”中的步骤(3)-(4)替换为将切段置于诱变剂2.0wt％EMS+0.2wt％二甲基亚砜”中浸泡3h。
对比例2
同实施例1，区别在于，将“4、离体诱变处理”中的步骤(3)-(4)替换为将切段置于诱变剂“1.5wt％EMS+0.2wt％二甲基亚砜”中浸泡5h。
对比例3
同实施例1，区别在于，将“4、离体诱变处理”中的步骤(3)中EMS的浓度调整为1.3wt％，并省略步骤(4)。
对比例4
同实施例1，区别在于，将“4、离体诱变处理”中的步骤(3)中的光照培养时间调整为16天，并省略步骤(4)。
对比例5
同实施例1，区别在于，将“4、离体诱变处理”中的步骤(3)中EMS的浓度调整为1.3wt％。
对比例6
同实施例1，区别在于，将“4、离体诱变处理”中的步骤(3)中的光照培养时间调整为16天。
统计对比例1-6和实施例1的褐化率、芽萎缩死亡率、畸形率和有效突变率，结果见表1。
在多次重复试验的基础上发现，单独用EMS对魔芋切块和切段进行诱变培养，常造成切块和切段褐化严重，芽萎缩、生长缓慢或不生长，苗弱、畸形以及死亡等现象；而EMS低浓度长时间(对比例2)或高浓度短时间(对比例1)诱变培养，对芽的分化及后期幼苗的生长均会造成不可逆的影响，畸形率较高，有效突变率极低。因此，本发明方法在EMS溶液中加入细胞分裂素及生长素，并降低EMS浓度和诱变时间，在诱变的同时促进芽的快速生长分化，以利于EMS的诱变；同时，在EMS短时低浓度诱变后，辅以低辐照剂量的60Co-γ射线处理，发现有效突变率及较EMS短时高浓度培养(对比例5)或长时低浓度培养(对比例6)，提高了8.39％以上，且畸形化率较低，利于优良突变体的筛选。
表1不同诱变方式对突变率等的影响
诱变方式 褐化率/％ 芽萎缩死亡率/％ 畸形率/％ 有效突变率/％
对比例1 23.42 27.59 15.14 4.19
对比例2 21.07 30.08 17.83 3.37
对比例3 16.58 19.61 11.05 4.28
对比例4 15.64 23.84 13.06 3.06
对比例5 22.14 20.70 17.15 7.92
对比例6 17.30 26.15 17.49 7.45
实施例1 5.43 9.09 6.55 16.31
注：褐化率％：表示褐化外植体数与接种外植体数的百分比，褐化表示外植体发黄发黑或部分呈水渍状，不再分化生长；
芽萎缩死亡率％：表示芽萎缩死亡的外植体数与接种外植体数的百分比，表示芽萎缩、干蔫、停止生长等；
畸形率％：表示畸形苗数与存活芽数的百分比，而畸形苗一般难以正常生长或移栽存活率极低，常表现苗弱、苗小、叶型或株型畸形、分化不完全、生长缓慢或不生长；
有效突变率％：表示出现突变症状且能正常生长的幼苗数与存活芽数的百分比。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (5)

1.一种魔芋突变体的批量诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将魔芋根状茎或球茎经催芽处理后切块，之后将所得切块置于含有诱变剂的培养基中进行诱变培养；所述诱变剂为：0.8% EMS+2.0-4.0mg/L 6-BA+0.5-1.0mg/L KT+0.1-0.2mg/L 2.4-D+0.2%-0.4%二甲基亚砜或1.2% EMS+2.0-4.0mg/L 6-BA+0.5-1.0mg/L KT+0.1-0.2mg/L 2.4-D+0.2%-0.4%二甲基亚砜；
（2）诱变培养后的切块进行60Co-γ诱变处理；
（3）60Co-γ诱变处理后的切块直接诱导不定芽分化出幼苗；
（4）所述幼苗进行生根培养，之后移栽培养，收获得到小球茎；
在步骤（1）中，所述诱变培养进行的是光照培养，当所述诱变剂为：0.8% EMS+2.0-4.0mg/L 6-BA+0.5-1.0mg/L KT+0.1-0.2mg/L 2.4-D+0.2%-0.4%二甲基亚砜时，所述光照培养的时间为14天；当所述诱变剂为：1.2% EMS+2.0-4.0mg/L 6-BA+0.5-1.0mg/L KT+0.1-0.2mg/L 2.4-D+0.2%-0.4%二甲基亚砜时，所述光照培养的时间为10天；
在步骤（1）中，所述催芽处理包括对所述魔芋根状茎或球茎喷施激素溶液的操作，所述激素溶液为：1.0-2.0mg/L 6-BA+0.1-0.2mg/L KT+0.2-0.5mg/L NAA+0.1-0.2mg/L GA3；
在步骤（1）中，除诱变剂外，所述培养基包括：MS基础培养基+30g/L蔗糖+4.2g/L琼脂，pH5.8-6.0；
在步骤（2）中，辐照剂量率为20 Gy/min，辐照剂量为120-180Gy；
在步骤（3）中，直接诱导不定芽分化出幼苗的培养基为：MS基础培养基+1.0-2.0mg/LKT+0.2-0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+4.2g/L琼脂，pH5.8-6.0；
在步骤（4）中，所述生根培养的培养基为：1/2MS基础培养基+1.0-1.5mg/L NAA+0.1-0.2mg/L 2,4-D+20g/L蔗糖+4.2g/L琼脂，pH5.8-6.0。
2.根据权利要求1所述的批量诱导方法，其特征在于，在步骤（1）中，在催芽处理前，所述魔芋根状茎或球茎经过了去顶芽处理。
3.根据权利要求1所述的批量诱导方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述催芽处理的温度为18-22℃，湿度为30-40%。
4.根据权利要求1所述的批量诱导方法，其特征在于，在步骤（3）中，直接诱导不定芽分化出幼苗的培养条件包括：光照强度1500-2000LX，光照时间12/12h，温度25-28℃，湿度50-60%。
5.根据权利要求1所述的批量诱导方法，其特征在于，在步骤（4）中，所述生根培养的条件包括：光照强度1500-2000LX，光照时间8/16h，室温25-28℃，湿度50-60%。
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