CN110583269A - 一种海南地区油茶嫁接用接穗的生产方法 - Google Patents

一种海南地区油茶嫁接用接穗的生产方法 Download PDF

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CN110583269A CN201911007160.8A CN201911007160A CN110583269A CN 110583269 A CN110583269 A CN 110583269A CN 201911007160 A CN201911007160 A CN 201911007160A CN 110583269 A CN110583269 A CN 110583269A
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Abstract

本发明提供了一种海南地区油茶嫁接用接穗的生产方法，属于组培技术领域，本发明以油茶的顶芽或带腋芽的茎段为外植体，以遗传相对稳定的器官直接发生的途径通过初代诱导培养、增殖培养来生产再生组培芽，再通过壮芽培养得到单芽，单芽可作为嫁接用接穗，以缓解海南地区芽苗砧嫁接穗条匮乏。

Description

一种海南地区油茶嫁接用接穗的生产方法
技术领域
本发明属于组培技术领域，尤其涉及一种海南地区油茶嫁接用接穗的生产方法。
背景技术
油茶(Camellia oleifera)是我国南方重要的木本食用油料树种，泛指山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)植物中种子油脂含量较高且具有经济栽培价值的植物总称，别名茶子树、茶油树、白花茶，约有50个物种，是我国特有的一种纯天然高级油料树，为中国南方18个省(区、市)的特产油料，也是海南省乡土油料树种。用于造林的主要种包括中果(普通)油茶(Camellia OleiferaAbel.)、大果(越南、高州、陆川)油茶(Camelliavietnamensis T.C.Huang ex Hu)和小果油茶(Camellia meiocarpa Hu.)等3种。其中大果油茶主产于广西壮族自治区陆川县和广东省高州市以南的南亚热带和热带地区，喜高温、高湿气候，从陆川县、
高州市逐渐北移，今海南当前栽植的大部分是越南油茶(Camellia vietnamensisT.C.Huang ex Hu)，因长期适应海南岛热带季风性气候，已形成区别于其他地区油茶的地理小种，本地俗称——山柚。
当前，海南省油茶林大部分属于低产林，尚需进行改造；早期种植的老油茶林，基本以本地实生苗或者国内20世纪60年代选育出的优良农家品种、优良家系和优良无性系等作为种源，由于实生苗后代个体间性状分离，种苗良莠不一；或优良品种经过长期的嫁接、扦插等无性繁殖已逐步退化，故现今，中老油茶林亩产茶油产量低，产值低，面临再次利用高接换冠等技术改良。2014年前大部分新发展的油茶林，大多数采用良莠不一的实生苗、扦插苗种植，低产低效隐患大，同样面临更新改造。海南土地后备资源较丰富，开发潜力较大。当前，适合海南当地种植的本地良种壮匮乏是限制海南油茶优良品种推广种植的限制因子之一。经海南本土试种，外来苗木在海南岛适应性差，易感病、易受虫害、抗逆性差，成活率低，而且成活的幼苗也表现长势弱、生长慢，不适应海南高温高湿天气下生长。另外，海南省油茶本土以及华侨消费者也认可海南本土的油茶油风味。故选育、发展种植本地优良油茶品种已成当务之急。
油茶组织培养对油茶优良种质资源的离体保存、良种快繁以及利用基因工程等生物技术进行遗传改良等方面有着深远的意义，对油茶产业可持续健康发展有巨大影响。油茶工作者对我国湖南、江西和广西等地区的主栽品种普通油茶(Camellia oleiferaAbel.)的组织培养进行相关研究，但海南因油茶产业发展相对慢，故对海南地区的主栽品种——越南油茶在海南地区形成的特殊地理油茶小种“山柚”的组织培养研究报道鲜见。植物离体培养产生再生植株的途径可分为器官发生途径和体细胞胚途径。体细胞胚状体途径是指外植体体细胞按胚胎发生方式形成再生植株的过程，体细胞胚是由那些未经畸变的细胞或变异较小的细胞形成，通过体细胞胚形成的再生植株变异性小于器官发生途径形成的再生植株，是植物优良的再生植株产生途径，但相对较难。笔者所在的海南大学油茶课题组以海南地区油茶未授粉花药为外植体，通过体细胞胚发生途径建立了油茶花药再生体系，目前其胚状体的诱导率低，因此限制了这种快速繁殖育苗途径的实际应用。器官发生途径包括两种，一种是直接发生途径，即由腋芽、顶芽等定芽直接萌发，这种途径不经过发生愈伤组织而再生，获得的苗木其遗传性和母株基本一致，能保持母本优良性状，苗木生长整齐一致，变异率小，但繁殖系数有待提高；另一种途径是不定芽发生，这种途径又包括外植体直接产生不定芽的直接不定芽发生途径和外植体先脱分化产生愈伤组织再分化形成不定芽的间接不定芽发生途径，油茶与很多山茶科植物一样，受限于外植体的苗龄和植株体内富含皂素，外植体直接产生不定芽的形态器官分化较难，不易获得再生植株，而经过愈伤组织阶段的不定芽发生途径虽然繁殖系数相对较高，但后代发生变异的概率较高，不宜作为苗木繁殖生产的方式。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种海南地区油茶嫁接用接穗的生产方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种海南地区油茶嫁接用接穗的生产方法，包括以下步骤：
1)对油茶的外植体用酒精溶液浸泡，无菌水冲洗后使用质量百分含量为2％次氯酸钠溶液消毒，无菌水冲洗后使用质量百分含量为0.1％氯化汞溶液消毒，无菌水冲洗后，得到消毒外植体；
所述外植体包括油茶的顶芽或带腋芽的茎段；
2)将所述步骤1)得到的消毒外植体接种于初代诱导培养基上暗培养3～7d后，再进行光照培养7～10dd，得到外植体萌芽；
所述初代诱导培养基以第一改良MS培养基为基础培养基，以水为溶剂，每升包括GA3 0.5mg、Zt 1mg、蔗糖30～35g、植物凝胶2.2～2.5g和体积浓度为5～8％的椰汁，所述初代诱导培养基的pH值为5～6；
3)将所述步骤2)得到的外植体萌芽以单芽无菌短枝扦插增殖或俩丛芽增殖的方式接种于增殖培养基上增殖培养30d以上，得到增殖芽；
所述增殖培养基以第二改良MS培养基为基础培养基，以水为溶剂，每升包括IAA0.2～0.5mg、Zt 1～3mg、蔗糖30～35g、植物凝胶2.2～2.5g和体积浓度为5～8％的椰汁，所述增殖培养基的pH值为5～6；
4)将所述步骤3)得到的增殖芽接种于壮芽培养基上壮芽培养25d以上，得到壮芽组培芽，所述壮芽组培芽上的单芽为油茶嫁接用接穗；
所述壮芽培养基以第三改良MS培养基为基础培养基，以水为溶剂，每升包括IAA0.5mg、GA3 0.5mg、酸水解酪蛋白200mg/L、蔗糖30～35g、植物凝胶2.2～2.5g，所述壮芽培养基的pH值为5～6。
优选的，所述步骤1)顶芽为带三分之一叶片的单个顶芽；
所述带腋芽茎段为带三分之一叶片含1个腋芽的茎段。
优选的，所述步骤1)2％次氯酸钠溶液消毒的时间为12～15min。
优选的，所述步骤1)0.1％氯化汞溶液消毒的时间为10～12min。
优选的，所述步骤2)光照培养的条件包括：所述光照培养的光照强度为1000～1500lx，所述光照培养的时间为12～14h/d，所述光照培养的环境湿度为60～70％，所述光照培养的温度为26～30℃。
优选的，所述步骤2)第一改良MS培养基以水为溶剂，包括硝酸铵733mg/L、硝酸钾1666mg/L、二水氯化钙293mg/L、七水硫酸镁247mg/L、磷酸二氢钾113mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素VB10.1mg/L、盐酸吡哆醇VB60.5mg/L和烟酸0.5mg/L。
优选的，所述步骤3)增殖培养的条件包括：所述增殖培养的光照强度为1500～2000lx，所述增殖培养的光照时间为14～16h/d，所述增殖培养的环境湿度为60～70％。
优选的，所述步骤3)第二改良MS培养基以水为溶剂，包括硝酸铵733mg/L、硝酸钾1666mg/L、二水氯化钙293mg/L、七水硫酸镁247mg/L、磷酸二氢钾113mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素VB110.0mg/L、盐酸吡哆醇VB61.0mg/L和烟酸1.0mg/L。
优选的，所述步骤4)壮芽培养的条件包括：所述壮芽培养的光照强度为2500～3000lx，所述壮芽培养的时间为14～16h/d，所述壮芽培养的环境湿度为60～70％。
优选的，所述步骤4)壮芽培养基以水为溶剂，包括硝酸铵1110mg/L、硝酸钾1267mg/L、二水氯化钙293mg/L、七水硫酸镁247mg/L、磷酸二氢钾226mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素VB110.0mg/L、盐酸吡哆醇VB61.0mg/L和烟酸1.0mg/L。
本发明提供了一种海南地区油茶嫁接用接穗的生产方法，本发明以油茶的顶芽或带腋芽的茎段为外植体，以遗传相对稳定的器官直接发生的途径通过初代诱导培养、增殖培养来生产再生组培芽，再通过壮芽培养得到单芽，单芽可作为嫁接用接穗，以缓解海南地区芽苗砧嫁接穗条匮乏。
附图说明
图1为油茶留1/3叶的顶芽和腋芽外植体接种和芽诱导，其中，A留1/3叶片的接种腋芽和顶芽外植体；B顶芽诱导I级萌芽；C腋芽诱导I级萌芽；D顶芽诱导多芽定芽丛芽；E腋芽诱导多芽定芽丛芽；
图2为添加细胞分裂素Zt对无菌芽增殖的影响，其中，A无菌短枝扦插增殖方式；B无菌芽诱导定芽丛芽增殖方式；
图3为组培芽壮芽和炼芽苗，其中，A增殖瓶苗芽；B壮芽后的组培芽；C炼苗7d后的组培芽；
图4为组培芽为接穗的芽苗砧嫁接，其中，A经壮芽炼苗后的瓶苗芽；B剔切下的组培芽；C芽苗砧木；D芽苗砧嫁接组培芽嫁接苗；
图5为组培芽接穗芽苗砧嫁接苗的栽植，其中，A用铝片绑扎的嫁接苗；B用薄膜绑扎的嫁接苗；C无纺布育苗袋栽植；D嫁接愈合期间的小拱棚保护栽植；
图6为60d成长茁壮的组培芽芽苗砧嫁接苗及20cm以上的组培芽接穗芽苗砧嫁接分级苗，其中，A第一次抽梢后的组培芽嫁接苗；B组培芽接穗和植株半硬枝穗条的芽苗砧嫁接苗对比；C 20cm以上的组培芽接穗芽苗砧嫁接分级苗。
具体实施方式
本发明提供了一种海南地区油茶嫁接用接穗的生产方法，包括以下步骤：
1)对油茶的外植体用酒精溶液浸泡，无菌水冲洗后使用质量百分含量为2％次氯酸钠溶液消毒，无菌水冲洗后使用质量百分含量为0.1％氯化汞溶液消毒，无菌水冲洗后，得到消毒外植体；
所述外植体包括油茶的顶芽或带腋芽的茎段；
2)将所述步骤1)得到的消毒外植体接种于初代诱导培养基上暗培养3～7d后，再进行光照培养7～10d，得到外植体萌芽；
所述初代诱导培养基以第一改良MS培养基为基础培养基，以水为溶剂，每升包括GA30.5mg、Zt 1mg、蔗糖30～35g、植物凝胶2.2～2.5g和体积浓度为5～8％的椰汁，所述初代诱导培养基的pH值为5～6；
3)将所述步骤2)得到的外植体萌芽以单芽无菌短枝扦插增殖或俩丛芽增殖的方式接种于增殖培养基上增殖培养30d以上，得到增殖芽；
所述增殖培养基以第二改良MS培养基为基础培养基，以水为溶剂，每升包括IAA0.2～0.5mg、Zt 1～3mg、蔗糖30～35g、植物凝胶2.2～2.5g和体积浓度为5～8％的椰汁，所述增殖培养基的pH值为5～6；
4)将所述步骤3)得到的增殖芽接种于壮芽培养基上壮芽培养25d以上，得到壮芽组培芽，所述壮芽组培芽上的单芽为油茶嫁接用接穗；
所述壮芽培养基以第三改良MS培养基为基础培养基，以水为溶剂，每升包括IAA0.5mg、GA30.5mg、酸水解酪蛋白200mg/L、蔗糖30～35g、植物凝胶2.2～2.5g，所述壮芽培养基的pH值为5～6。
本发明对油茶的外植体用酒精溶液浸泡，无菌水冲洗后使用质量百分含量为2％次氯酸钠溶液消毒，无菌水冲洗后使用质量百分含量为0.1％氯化汞溶液消毒，无菌水冲洗后，得到消毒外植体；所述外植体包括油茶的顶芽或带腋芽的茎段。
在本发明中，所述油茶的品种优选为海南本土油茶优良无性系“海大4号”。
在本发明中，所述外植体包括油茶的顶芽或带腋芽的茎段，所述顶芽优选为带三分之一叶片的单个顶芽，所述带腋芽茎段优选为带三分之一叶片含1个腋芽的茎段。采用本发明提供的外植体提高了诱导率。在本发明中，所述茎段的长度优选为3～4cm。在本发明中，预留的三分之一叶片中本身含有一定的营养物质，在腋芽和顶芽外植体离开母株进行离体培养的伊始能及时供给腋芽和顶芽的初步能量需求，随着外植体在培养基中的适应，叶片可逐渐恢复复光合作用，产生一定的营养物质供给腋芽和顶芽的细胞分化和能量所需。
在本发明中，所述酒精溶液的质量百分含量优选为70％，所述外植体用酒精溶液浸泡的时间优选为45s，浸泡后用无菌水冲洗的次数优选为2次。在本发明中，所述2％次氯酸钠溶液消毒的时间优选为12～15min，所述消毒优选将外植体浸泡于2％次氯酸钠溶液中，并在振荡下进行，所述振荡的速度优选为100rpm，消毒后用无菌水冲洗的次数优选为2次。在本发明中，所述0.1％氯化汞溶液消毒的时间优选为10～12min，所述消毒优选将外植体浸泡于0.1％氯化汞溶液消毒中，并在振荡下进行，所述振荡的速度优选为100rpm，消毒后无菌水冲洗的次数优选为5次。本发明的外植体采用2％次氯酸钠溶液和0.1％氯化汞溶液消毒显著降低了污染率。
本发明将得到的消毒外植体接种于初代诱导培养基上暗培养3～7d后，再进行光照培养7～10d，得到外植体萌芽；所述初代诱导培养基以第一改良MS培养基为基础培养基，以水为溶剂，每升包括GA30.5mg、Zt 1mg、蔗糖30～35g、植物凝胶2.2～2.5g和体积浓度为5～8％的椰汁，所述初代诱导培养基的pH值为5～6。
在本发明中，所述暗培养的温度优选为26～30℃，所述暗培养的环境湿度优选为60～70％。
在本发明中，所述光照培养的条件优选包括：所述光照培养的光照强度优选为1000～1500lx，所述光照培养的时间优选为12～14h/d，所述光照培养的环境湿度优选为60～70％，所述光照培养的温度优选为26～30℃。在本发明中，所述第一改良MS培养基优选以水为溶剂，包括硝酸铵733mg/L、硝酸钾1666mg/L、二水氯化钙293mg/L、七水硫酸镁247mg/L、磷酸二氢钾113mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素VB10.1mg/L、盐酸吡哆醇VB60.5mg/L和烟酸0.5mg/L。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。
本发明对所述椰汁的制备没有特殊限定，采用常规制备方法制备得到即可。
本发明将得到的外植体萌芽的顶芽或带腋芽的茎段接种于增殖培养基上增殖培养30d以上，得到增殖丛芽；所述增殖培养基以第二改良MS培养基为基础培养基，以水为溶剂，每升包括IAA0.2～0.5mg、Zt 1～3mg、蔗糖30～35g、植物凝胶2.2～2.5g和体积浓度为5～8％的椰汁，所述增殖培养基的pH值为5～6。
在本发明中，所述外植体萌芽的顶芽优选为带三分之一叶片的单个顶芽，所述外植体萌芽的带腋芽的茎段优选为带三分之一叶片含1个腋芽的茎段，所述茎段的长度优选为3～4cm。
在本发明中，所述增殖培养的条件优选包括：所述增殖培养的光照强度优选为1500～2000lx，所述增殖培养的光照时间优选为14～16h/d，所述增殖培养的环境湿度优选为60～70％，所述增殖培养的温度优选为26～30℃。
在本发明中，第二改良MS培养基以水为溶剂，优选包括硝酸铵733mg/L、硝酸钾1666mg/L、二水氯化钙293mg/L、七水硫酸镁247mg/L、磷酸二氢钾113mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素VB110.0mg/L、盐酸吡哆醇VB61.0mg/L和烟酸1.0mg/L。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。
本发明将得到的增殖芽接种于壮芽培养基上壮芽培养25d以上，得到壮芽组培芽，所述壮芽组培芽上的单芽为油茶嫁接用接穗；所述壮芽培养基以第三改良MS培养基为基础培养基，以水为溶剂，每升包括IAA0.5mg、GA30.5mg、酸水解酪蛋白200mg/L、蔗糖30～35g、植物凝胶2.2～2.5g，所述壮芽培养基的pH值为5～6。
在本发明中，所述壮芽培养的条件优选包括：所述壮芽培养的光照强度优选为2500～3000lx，所述壮芽培养的时间优选为14～16h/d，所述壮芽培养的环境湿度优选为60～70％，所述壮芽培养的温度优选为26～30℃。
在本发明中，所述壮芽培养基以水为溶剂，包括硝酸铵1110mg/L、硝酸钾1267mg/L、二水氯化钙293mg/L、七水硫酸镁247mg/L、磷酸二氢钾226mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素VB110.0mg/L、盐酸吡哆醇VB61.0mg/L和烟酸1.0mg/L。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1外植体材料
剪取位于海南省琼海市阳江镇卢家村、已通过海南省林木品种审定委员会认定通过的海南本土油茶优良无性系“海大4号”的当年生半硬枝条，用湿毛巾包裹保湿及时带回实验室作为外植体材料。
2方法
2.1外植体消毒
将剪取的新鲜半硬枝条用软毛刷醮淡硫磺皂0.1％稀释液刷洗嫩枝条，流水漂洗10min，用吸水纸吸干水份，把叶子去掉2/3，剪成3～4cm长含一腋芽的茎段、顶芽，置超净工作台内进行外植体消毒。将外植体置于灭菌烧杯中，用70％分析纯酒精浸泡漂洗45s，无菌水冲洗2遍，接着用2％的次氯酸钠在摇床上振荡(100r/min)消毒12～15min，无菌水冲洗2遍，再以0.1％HgCl2溶液在摇床上振荡(100r/min)消毒10～12min，无菌水冲洗5遍，待接种。
表1不同消毒处理对“海大4号”油茶去叶片接种外植体消毒的影响
注：以改良MS为基本培养基，添加GA30.5mg/L+蔗糖30g/L+植物凝胶2.2g/L，pH5.5。接种方式为去除叶片后接种。污染率、诱导率分别于外植体接种14、30d后统计。表中同一列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
由表1可以得出，利用2％的次氯酸钠消毒加上0.1％HgCl2溶液的复合消毒方法，污染率降至10％以下，比常规只经0.1％HgCl2消毒，污染率显著降低了90.3％，有效建立海南本地油茶器官发生途径无菌体系。
2.2外植体接种和初代诱导培养
以带1/3叶片含腋芽茎段和带1/3叶片单个顶芽为外植体，以无菌短枝扦插的方式接种到初代诱导培养基(改良MS+GA30.5mg/L+Zt1.0mg/L+椰汁5％+蔗糖30g/L+植物凝胶2.2g/L，pH5.5)上，于(28±2)℃下，暗培养3～7d，然后进行光照培养，培养条件：光照强度1000lx～1500lx，光照时间12～14h/d，培养室湿度(65±5)％。
表2不同接种方式对腋芽和顶芽的芽诱导率的影响
注：以改良MS为基本培养基，添加GA30.5mg/L培养基作为外植体接种培养基。污染率、诱导率分别于要外植体接种14、30d后统计。表中同一列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。另芽诱导率(％)＝(萌发长度大于0.8cm无菌芽的外植体数/接种外植体总数)×100％。芽的萌发状况采用四级评价：I级，芽萌发成一芽四叶以上，节间明显，芽高≥3.0cm；II级，萌发，展叶，芽萌发为一芽三叶，0.8cm≤芽长度＜3.0cm；III级，芽膨大未展叶；IV级，芽无变化或褐变死亡。下同。
从表2中可以得出，与去除叶片的对照外植体相比，保留1/3叶片的外植体初代芽诱导率显著增加，顶芽和腋芽的芽诱导率分别显著增加了219％和313％，另萌芽抽梢明显呈I、II级且多芽萌发，而去除叶片的外植体则萌芽不力，抽梢相对短、部分芽保活膨大但未能萌发或趋坏死状，多呈II、III级状态。
表3不同细胞分裂素对“海大4号”油茶顶芽和腋芽萌发的影响
注：各处理均在改良MS+GA30.5mg/L培养基的基础上添加。各指标于继代培养50d后统计。表中同一指标(三个指标分别为成芽率K1、成梢率K2和多芽率K3)内，不同字母表示不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。其中，污染率(％)＝(污染外植体数/接种外植体总数)×100。芽诱导率(％)＝(萌发长度大于0.8cm无菌芽的外植体数/接种外植体总数)×100％。芽的萌发状况采用四级评价：I级，芽萌发成一芽四叶以上，节间明显，芽高≥3.0cm；II级，萌发，展叶，芽萌发为一芽三叶，0.8cm≤芽长度＜3.0cm；III级，芽膨大未展叶；IV级，芽无变化或褐变死亡。在此基础上计算三个百分率，①成芽率K1：萌发成I、II级的外植体(S)占接种数(T)的百分比。K1＝(S/T)×100％；②成梢率K2：萌发成I级的外植体数(H)占S的百分比，K2＝(H/S)×100％。③多芽率K3：萌发成I级或II级，并为多芽体的外植体(H＇)占S的百分比，K3＝(H＇/S)×100％。一般把芽萌发芽数≥2即视作多芽体。下同。
细胞分裂素的基本功能是刺激分生组织细胞分裂，诱导芽的分化和形成，促进芽的生长，防止衰老以及消除顶端优势以促进侧芽萌发等。不同植株因自身内源激素含量和次生代谢物种类的不同，对不同种类的植物生长调节剂敏感和适应性不同。油茶与大多数山茶科植物一样，体内含有一定量的茶皂素，在腋芽和顶芽等定芽诱导萌发过程中，代谢特别旺盛，会产生大量的过氧化氢，而内源茶皂素会一定程度上降低细胞内过氧化氢酶的活性，使芽萌发过程中产生过量的过氧化氢不能及时清除，导致芽萌发生长受到不同程度的抑制；另生长调节剂的水平过高也会刺激油茶外植体的多酚氧化酶活性，从而加速外植体褐变甚至坏死，故添加合适种类和浓度的植物生长调节剂是油茶腋芽和顶芽外植体初代芽诱导成功的重要基础。
从表3中可以得出，在改良MS+GA30.5mg/L培养基的基础上，以未添加细胞分裂素(CTK)的培养基为对照，添加1mg/L不同种类的CTK(6-BA、Zt和TDZ)，对顶芽的成芽率K1并无显著影响，添加1mg/L的6-BA和TDZ，对腋芽的成芽率也无显著影响，但添加1mg/LZt，腋芽的成芽率K1比未添加CTK的显著增加了15.6％。以未添加CTK的培养基为对照，添加1mg/L的6-BA和TDZ，对顶芽和腋芽的成梢率K2均无显著影响，但添加1mg/LZt，顶芽和腋芽的成梢率分别比对照显著增加了35.2％和27.7％。以未添加CTK的培养基为对照，添加了CTK的培养基中，顶芽和腋芽的多芽率K3均比其对照分别显著增加了9.1～10.5倍和8.0～9.2倍，而添加不同种类CTK间的多芽率皆无显著差异。综上所述，在改良MS+GA30.5mg/L培养基的基础上添加CTK，能显著促进腋芽和顶芽的芽诱导萌发多芽，尤其是添加Zt，对提高顶芽和腋芽的成芽率和成梢率最明显，后续的增殖培养CTK可以Zt优先，6-BA和TDZ其次。
2.3增殖培养
将统计过初代诱导芽萌发情况的无菌外植体新萌芽，去除叶片后，切成含腋芽茎段(每段含一腋芽)、顶芽单芽或俩丛芽，按芽的生长方向，竖接种到改良MS+Zt1.0mg/L+IAA0.3mg/L+椰汁5％+蔗糖30g/L+植物凝胶2.2g/L，pH5.5的增殖培养基上进行增殖继代，新含腋芽茎段以无菌短枝扦插的方式、顶芽或俩丛芽以器官直接发生定芽的方式进行增殖培养。培养条件：光照培养，光照强度1500lx～2000lx，光照时间14～16h/d，培养室湿度(65±5)％。30d后，重复无菌单个腋芽或顶芽或俩芽小丛芽——增殖芽——无菌单个腋芽或顶芽或俩芽小丛芽的循环培养方式，以无菌短枝扦插增殖、俩丛芽增殖的器官直接发生定芽的增殖方式进行增殖，顶芽和腋芽的增殖系数分别达到了5.6和6.8。
表4添加不同种类和浓度配比植物生长调节剂对油茶无菌腋芽和顶芽增殖的影响
注：以增殖阶段的改良MS为基本培养基。各指标于继代培养30d后统计。表中同一指标内(三个指标分别为成芽率、成梢率和多芽率)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
细胞分裂素(CTK)的生理作用主要是引起细胞分裂，诱导芽原基的形成和促进芽的生长，从而促进多芽诱导；生长素吲哚乙酸(IAA)主要是促进根原基的形成，对生长的促进作用主要则主要促进细胞的生长，特别是细胞的伸长，故两种植物生长调节剂的在细胞分裂生长中具协同作用，添加适当比例可明显促进芽的增殖和生长。植物细胞的分裂和分化的主要诱导因素就是细胞生长素和分裂素的比例,细胞分裂素/生长素的值大，会促进细胞分裂，对诱导芽生长和增殖有利，而生长素/细胞分裂素的值大，则促进根的生成更有利。从表4中可以得出，在6-BA/IAA比值约5～7时，随着植物生长调节剂浓度的增加，顶芽和腋芽成芽率、成梢率和多芽率总体上呈上升趋势，尤其在1mg/L 6-BA/0.2mg/L IAA时增加最明显，随着植物生长调节剂浓度的增加，在3mg/L 6-BA/0.5mg/L IAA时，各指标有所降低。同样，在Zt/IAA比值约5～7时，随着植物生长调节剂浓度的增加，顶芽和腋芽成芽率、成梢率和多芽率也基本维持着上升的趋势，在0.5mg/LZt/0.1mg/L IAA、1.0mg/LZt/0.2mg/LIAA条件下，腋芽的多芽率均比1mg/L 6-BA/0.2mg/L IAA条件下的显著增加，其他指标无显著差异，但在2.0mg/LZt/0.3mg/L IAA和3.0mg/LZt/0.5mg/L IAA条件下，顶芽和腋芽成芽率、成梢率和多芽率均比1mg/L 6-BA/0.2mg/L IAA条件下的显著增加，前两者间无显著差异。生产上为了节约成本，推荐海南地区油茶无菌顶芽和腋芽在增殖培养时，细胞分裂素/生长素以2.0mg/LZt/0.3mg/LIAA合适。
2.4壮芽培养
生长素和赤霉素具协同作用，都是使植物长高，生长素促进植物的伸长生长，主要作用于植物分生区和嫩芽的尖端，一定量的酸水解蛋白利于IAA的吸收和利用；赤霉素促进细胞伸长和扩大，从而引起茎秆伸长、增高和增粗，主要作用于植物茎部分生区。增殖新芽长到3～6cm时，可进一步进行壮芽培养，以作为芽苗砧嫁接接穗用。将抽梢的无菌短枝扦插新芽或将定芽丛芽切成以3～4个完整定芽为一丛，转接到壮芽培养基：改良MS+IAA 0.5mg/L+GA30.5mg/L+酸水解酪蛋白200mg/L、蔗糖30g/L+植物凝胶2.2g/L，pH5.5。培养条件：光照培养，光照强度2500lx～3000lx，光质增加红光，光照时间延长至14～16h/d，培养室湿度(65±5)％。培养25d后，定芽茎粗有效增粗了85％、芽长有效增高了79％，同时，叶片有效舒展和增大。将组培瓶芽移至自然散射光下练苗4～5d(不需打开瓶盖，炼苗时间太长也不合适，以免芽苗组织变老和培养基受杂菌污染，以影响嫁接效果)，即可在超净工作台上切下单芽，做芽苗砧嫁接接穗用。
表5IAA对油茶组培增殖芽壮芽的影响
注：各指标于继代培养30d后统计。同一列中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
2.5各阶段培养基
初代诱导培养基：以改良MS为基本培养基，包括以下含量组分：GA30.5mg/L，Zt1.0mg/L，椰子汁体积浓度5％～8％，蔗糖30g/L～35g/L和植物凝胶2.2g/L～2.5g/L，pH5.5。
改良MS培养基以水为溶剂，包括硝酸铵733mg/L、硝酸钾1666mg/L、二水氯化钙293mg/L、七水硫酸镁247mg/L、磷酸二氢钾113mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素VB10.1mg/L、盐酸吡哆醇VB60.5mg/L、烟酸0.5mg/L；培养基的pH值为5.4～5.5。
增殖培养基：以改良MS为基本培养，包括以下含量组分：IAA0.3mg/L，GA30.5mg/L，Zt2.0mg/L，椰子汁体积浓度5％～8％，蔗糖30g/L～35g/L和植物凝胶2.2g/L～2.5g/L，pH5.5。
改良MS培养基以水为溶剂，包括硝酸铵733mg/L、硝酸钾1666mg/L、二水氯化钙293mg/L、七水硫酸镁247mg/L、磷酸二氢钾113mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素VB110.0mg/L、盐酸吡哆醇VB61.0mg/L、烟酸1.0mg/L；培养基的pH值为5.4～5.5。
壮芽培养基：以改良MS为基本培养，包括以下含量组分：IAA 0.5mg/L，GA30.5mg/L，酸水解酪蛋白(Casein Acid Hydrolysate)200mg/L+蔗糖30g/L～35g/L和植物凝胶2.2g/L～2.5g/L，pH5.5。酸水解酪蛋白需过滤灭菌，0.22微米孔径过滤器。
改良MS培养基以水为溶剂，包括硝酸铵1110mg/L、硝酸钾1267mg/L、二水氯化钙293mg/L、七水硫酸镁247mg/L、磷酸二氢钾226mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素VB110.0mg/L、盐酸吡哆醇VB61.0mg/L、烟酸1.0mg/L；
3砧木的培养
十月中下旬寒露至霜降期间，海南地区油茶果由绿变黄，且有10％～20％的茶果开裂时进行果实采集。油茶果采收后，将茶果在阴凉干燥的室内堆放5～6d促其后熟，随后摊开果实保持室内通风，自然晾干2～3d，茶果失水后自然开裂，选择大粒饱满的种子进行砧木培育。
催芽池(长度根据场地自定)用中等粗粒的干净河沙，铺约15～18cm厚，整平；晾干后的种子先用50％的多菌灵800～1000倍药液浸泡20～25min消毒，再用清水漂洗3遍。在沙床中填入以清水冲洗干净的河沙13～15cm厚，刮平，将油茶种子撒播于沙床上，以种子有空隙但无层叠为准，再盖10～12cm厚的干净湿沙，压实，用清水喷淋后以不留明水为准，再喷施50％多菌灵可湿性粉剂1000倍药液，然后盖上薄膜保湿，进行砧木芽苗催芽，薄膜上可搭小拱棚，覆盖遮光率70％遮阳网。
在当年11月～次年12月间，保持沙子湿润，1月中旬海南地区气温陆续升高，在砧木苗的胚芽≥6cm，胚根≥10cm，即可进行嫁接。根据嫁接需要适时调节砂床温湿度，胚芽短于6cm，增加洒水，揭开薄膜，促进胚芽抽长，胚芽长，露出砂面，则减少洒水，加盖遮荫网，并加盖河砂，以免芽苗砧木老化。
4芽苗砧嫁接组培芽成苗
4.1起砧
在催芽沙床上，戴上乳胶手套，用手轻轻挖出砧木芽苗(注意不碰断芽苗砧上的种子和尽量不碰折根部)，将芽苗盛放在大盆里，用清水将芽苗上的沙子漂洗干净，然后将芽苗砧放在合适容器中，放入合适的容器中，以多菌灵50％可湿性粉剂0.13％～0.15％药液，杀菌消毒5～8min，再用6-BA 50mg/L浸泡砧木2～3min，然后取出用干净的湿毛巾包好保湿待用。
4.2组培芽接穗的采集
将壮芽培养20d后的组培芽瓶苗(继代≤10代，未发生变异)置于常温、自然散射光下炼苗5～8d后(晴天炼苗5d，若是阴天适当增加3d)，在超净工作台上将芽长≥3cm的单芽从丛芽基部切取下来，小于3cm的芽继续接种到2/3改良MS空白培养基上培养。将切下的芽洗净苗基部的培养基，再用0.1％硝酸钾溶液浸泡2～3min，然后取出用湿毛巾包好保湿待用。
4.3切砧木
将嫁接刀具用70％酒精浸泡消毒，将砧木芽苗放在平板上，在芽砧子叶以上2～2.5cm处切断，切口平整，砧木根长保留5～6cm。若切下的芽苗砧的胚根依然长于10cm，可将中段胚根末端切掉，再切留7～8cm长，留做胚根砧木。在砧木切断切口处沿中轴纵切一刀，深度0.8～1cm长。
4.4削接穗
在组培芽离基部约1.0～2.0cm处，用单面刀片在两侧削制一个长0.8～1.0cm的锲形双斜面，两斜面交汇于髓心，在2～3mm处切平接穗基部，然后在6-BA50mg/L的溶液中浸泡2～3min，然后取出用湿毛巾包好保湿待用。浸泡6-BA50mg/L的削制组培芽明显比清水浸泡的嫁接成活率提高31.5％。
表6不同植物生长调节剂浸泡组培芽接穗对油茶组培芽芽苗砧嫁接成活率的的影响
注：苗长≥3cm，同一列中不同小写字母表示差异显著。
4.5嵌穗和绑扎
采用劈接法，选取粗细匹配的砧木和接穗，随削随嫁接。把削好的组培芽接穗插入砧木切口，接穗与砧木形成层对齐，用长2.5～3.5cm，宽0.8～1.0cm，厚0.11mm的长方形铝片在砧穗结合部紧扣并反转，使砧穗充分紧密结合，嫁接完成后即放湿毛巾包裹的泡沫箱内保湿，半小时内栽植于苗床育苗袋中。
5芽苗砧嫁接组培芽苗的栽植和管理
5.1芽苗砧嫁接组培芽苗的栽植
栽植在简易遮荫大棚内(覆盖双层活动遮光度75％的遮阳网)进行，将体积混合比例为砖红壤土：蚯蚓土：椰糠＝8:1:1的营养土装入可降解轻基质无纺布育苗袋(宽12.5cm×高12.5cm)中，整齐摆放在苗床上，浇透水，以营养土充分浇透且不渍水为宜，晾透备栽植。用直径约2cm的小木棍插入装有营养土的、浇透水的育苗袋中央，摇挤成一个小穴，将嫁接好的芽苗砧嫁接组培芽苗栽植入育苗袋中。栽植深度以嫁接口露于土外0.5～1.0cm，压实基部土壤，让芽苗根系与营养土紧密接触。栽植后喷淋一次800倍的50％多菌灵可湿性粉剂药液，然后在搭好的小拱棚(每隔1m支棚弓径，棚高60cm)上盖上白色农用薄膜保湿，小拱棚四周和两头可培土压紧，防止空气对流，不利于小拱棚微环境保湿。棚内放置温湿度计，每天观测棚内温湿度，以便及时调控。
5.2芽苗砧嫁接组培芽苗的生长管理
5.2.1嫁接愈合期的保湿控温
栽植后35d的时间内，主要以保湿保温为主，嫁接苗愈合期间苗床温度控制在(34±4)℃，保持小棚内湿度在(90±5)％以上，遮荫度75％以上。确保薄膜无破损、无漏气，确保遮阳网无损坏。如温度过高，可增加遮阳网提高遮光率或在小拱棚顶上淋水降温；若阴天或下雨天时可将顶棚遮阳网掀起增加光照；天气干旱可适当揭膜微喷加强小棚内湿度管理，操作完及时盖上薄膜。经常观察嫁接苗是否有杂菌感染，只要发现及时清除被感染苗木并焚烧销毁，同时局部喷雾50％多菌灵800倍溶液，随时盖好薄膜。
5.2.2嫁接生长期的管理
35d后，嫁接苗愈合生根，抽梢率约8～15％，可每天9：00～18：00将小拱棚背风一头打开，通风降温，控制小棚内温度不超过40℃，通风后及时封闭小拱棚。若遇长期阴雨天，可将薄膜两头揭开，并做好清沟排水工作，以免苗床渍水。进入高温高湿时期，苗木生长快，每15d进行一次例规剔除杂草和枯株、剪砧芽，操作完后继续盖好薄膜。65d时，嫁接苗二次抽梢，掀开薄膜两头通风练苗，练苗5～7d后，逐步向上揭起四周的薄膜，10～15d后，选择阴天揭去全面薄膜。
5.2.3嫁接苗的追肥
揭开薄膜后，正处高温幼苗管理时期，注意保湿和遮阳，另及时剪除砧木萌芽。当嫁接苗抽梢长3～5cm时，喷施0.1％～0.2％尿素或磷酸二氢钾溶液，每15d施肥一次，连施2次。以后按复合肥：水溶有机肥＝1：1的比例，配成浓度为0.4％～0.5％的水溶液，喷施苗木，每15d1次，连续3～5次。
5.2.4揭遮荫网
嫁接苗栽植90d左右，可逐步拆除遮阴棚。可先掀遮荫棚四周的遮阳网，7～10d后再逐渐掀开顶棚遮荫网，让阳光逐渐照进来，10d后可拆除顶棚遮阳网，全面接受自然光照。
5.2.5病虫害防治
油茶组培芽嫁接苗主要有叶炭疽病、叶斑病，采用苯醚申环唑1000～1200倍液叶面喷施；蚜虫、红蜘蛛等害虫用5％的甲氨基酸阿维菌素苯甲酸盐750倍液+20％啶虫脒1000倍液+20％达螨灵1500倍液叶面喷施。可根据病虫害的发生情况采取单一或复合药剂喷施。
5.2.6组培芽嫁接苗木分级管理
嫁接苗生长6个月后，将苗高达25cm以上的苗挑出来放置其他苗床单独管理，此后，随着苗木的生长，定期挑选达到一定规格的苗木分批管理，直到绝大多数苗木达到海南省嫁接苗木出圃标准。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种海南地区油茶嫁接用接穗的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)对油茶的外植体用酒精溶液浸泡，无菌水冲洗后使用质量百分含量为2％次氯酸钠溶液消毒，无菌水冲洗后使用质量百分含量为0.1％氯化汞溶液消毒，无菌水冲洗后，得到消毒外植体；
所述外植体包括油茶的顶芽或带腋芽的茎段；
2)将所述步骤1)得到的消毒外植体接种于初代诱导培养基上暗培养3～7d后，再进行光照培养7～10d，得到外植体萌芽；
所述初代诱导培养基以第一改良MS培养基为基础培养基，以水为溶剂，每升包括GA30.5mg、Zt 1mg、蔗糖30～35g、植物凝胶2.2～2.5g和体积浓度为5～8％的椰汁，所述初代诱导培养基的pH值为5～6；
3)将所述步骤2)得到的外植体萌芽以单芽无菌短枝扦插增殖或俩丛芽增殖的方式接种于增殖培养基上增殖培养30d以上，得到增殖芽；
所述增殖培养基以第二改良MS培养基为基础培养基，以水为溶剂，每升包括IAA0.2～0.5mg、Zt 1～3mg、蔗糖30～35g、植物凝胶2.2～2.5g和体积浓度为5～8％的椰汁，所述增殖培养基的pH值为5～6；
4)将所述步骤3)得到的增殖芽接种于壮芽培养基上壮芽培养25d以上，得到壮芽组培芽，所述壮芽组培芽上的单芽为油茶嫁接用接穗；
所述壮芽培养基以第三改良MS培养基为基础培养基，以水为溶剂，每升包括IAA0.5mg、GA3 0.5mg、酸水解酪蛋白200mg/L、蔗糖30～35g、植物凝胶2.2～2.5g，所述壮芽培养基的pH值为5～6。
2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述步骤1)顶芽为带三分之一叶片的单个顶芽；
所述带腋芽茎段为带三分之一叶片含1个腋芽的茎段。
3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述步骤1)2％次氯酸钠溶液消毒的时间为12～15min。
4.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述步骤1)0.1％氯化汞溶液消毒的时间为10～12min。
5.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述步骤2)光照培养的条件包括：所述光照培养的光照强度为1000～1500lx，所述光照培养的时间为12～14h/d，所述光照培养的环境湿度为60～70％，所述光照培养的温度为26～30℃。
6.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述步骤2)第一改良MS培养基以水为溶剂，包括硝酸铵733mg/L、硝酸钾1666mg/L、二水氯化钙293mg/L、七水硫酸镁247mg/L、磷酸二氢钾113mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L和烟酸0.5mg/L。
7.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述步骤3)增殖培养的条件包括：所述增殖培养的光照强度为1500～2000lx，所述增殖培养的光照时间为14～16h/d，所述增殖培养的环境湿度为60～70％。
8.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述步骤3)第二改良MS培养基以水为溶剂，包括硝酸铵733mg/L、硝酸钾1666mg/L、二水氯化钙293mg/L、七水硫酸镁247mg/L、磷酸二氢钾113mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素10.0mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L和烟酸1.0mg/L。
9.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述步骤4)壮芽培养的条件包括：所述壮芽培养的光照强度为2500～3000lx，所述壮芽培养的时间为14～16h/d，所述壮芽培养的环境湿度为60～70％。
10.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述步骤4)壮芽培养基以水为溶剂，包括硝酸铵1110mg/L、硝酸钾1267mg/L、二水氯化钙293mg/L、七水硫酸镁247mg/L、磷酸二氢钾226mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素10.0mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L和烟酸1.0mg/L。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116076365A (zh) * 2023-02-17 2023-05-09 贵州省林业学校(贵州省林业干部学校) 一种威宁短柱油茶穗条的快繁方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2764844A (en) * 1953-01-26 1956-10-02 Young Ray Allen Method of grafting camellias and other tender plants
CN1460713A (zh) * 2003-04-29 2003-12-10 广西富新科技股份有限公司 金花茶组培快繁培养基
CN101822160A (zh) * 2010-05-05 2010-09-08 广西壮族自治区林业科学研究院 油茶组培继代芽嫁接育苗方法
CN108450218A (zh) * 2018-02-10 2018-08-28 信阳农林学院 一种油茶的种苗繁育方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2764844A (en) * 1953-01-26 1956-10-02 Young Ray Allen Method of grafting camellias and other tender plants
CN1460713A (zh) * 2003-04-29 2003-12-10 广西富新科技股份有限公司 金花茶组培快繁培养基
CN101822160A (zh) * 2010-05-05 2010-09-08 广西壮族自治区林业科学研究院 油茶组培继代芽嫁接育苗方法
CN108450218A (zh) * 2018-02-10 2018-08-28 信阳农林学院 一种油茶的种苗繁育方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
王以红等: "油茶岑软3号芽器官离体培养再生植株的研究", 《西部林业科学》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116076365A (zh) * 2023-02-17 2023-05-09 贵州省林业学校(贵州省林业干部学校) 一种威宁短柱油茶穗条的快繁方法
CN116076365B (zh) * 2023-02-17 2023-11-14 贵州省林业学校(贵州省林业干部学校) 一种威宁短柱油茶穗条的快繁方法

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