CN112790106A

CN112790106A - 一种利用甲基磺酸乙酯（ems）构建大麦突变体库的方法

Info

Publication number: CN112790106A
Application number: CN201911130401.8A
Authority: CN
Inventors: 栾海业; 沈会权; 陈和
Original assignee: JIANGSU LITTORAL AGRICULTURE SCIENCE RESEARCH INSTITUTE
Current assignee: JIANGSU LITTORAL AGRICULTURE SCIENCE RESEARCH INSTITUTE
Priority date: 2019-11-13
Filing date: 2019-11-13
Publication date: 2021-05-14

Abstract

本发明公开了一种利用甲基磺酸乙酯构建大麦突变体库的方法，本发明以“苏啤6号”作为诱变对象，通过对比不同浓度EMS处理液在不同诱变时间下的大麦种子发芽率，确定半致死剂量，并用半致死剂量诱变处理大麦种子，调查M₂代的突变频率和突变类型，鉴定M₄代能够稳定遗传的突变体，构建突变体库，获得了叶、茎、穗子、生育期、育性、株高等突变类型，为大麦功能基因组学研究创制了丰富的材料，同时部分有益突变可直接应用于育种实践。

Description

一种利用甲基磺酸乙酯(EMS)构建大麦突变体库的方法

技术领域

本发明属于农作物诱变育种技术领域，涉及一种利用甲基磺酸乙酯构建辣椒突变体库的方法。

背景技术

大麦(Hordeum vulgare L.)是世界上四大禾谷类作物之一，具有生育期短、抗病、耐逆(耐旱、耐盐碱、耐贫瘠)等特点，对气候环境适应性较广泛；大麦主要用途有饲料、麦芽啤酒、食粮及工业原料等，并且是青藏高海拔地区最主要的粮食作物。大麦是二倍体自花授粉作物，染色体数为2n＝2x＝14，基因组大小为5.1Gb，2012年和2017年已公布了大麦基因组图谱。大麦具有遗传背景简单，遗传转化相对容易的特点，是麦类作物功能基因组研究的重要模式植物。

突变体库的创建是植物功能基因组学研究的重要基础，目前在拟南芥、水稻等模式作物上均已构建了饱和的突变体库，并利用突变体材料，已克隆了大量的功能基因。突变体库的构建还可以创造新的种质资源，丰富品种的遗传多样性，为新品种选育提供材料基础。甲基磺酸乙酯(EMS)化学诱变技术是构建植物突变体库的重要方法之一，EMS诱变具有诱变效率高，多为点突变，染色体畸变率较低等优点，所以被广泛应用于各种作物突变体库的构建。不同作物各种突变体的获得为作物功能基因的克隆及验证提供了丰富的材料基础。跟拟南芥、水稻、小麦相比，大麦突变库的构建还远没有达到饱和状态，需要构建新的突变体库来补充大麦功能基因组学研究，本研究旨在利用抗黄花叶病的优质大麦品种苏啤6号构建大麦突变体库，为大麦功能基因组学研究和遗传育种提供新突变体材料。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种利用甲基磺酸乙酯(EMS)构建大麦突变体库的方法，利用该方法可以获得多种类型突变体，为大麦功能基因组学研究创制丰富的材料，同时筛选出有利突变直接应用于育种实践。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种利用甲基磺酸乙酯构建大麦突变体库的方法，包括以下操作：

1)将饱满的大麦干种子于0.2mol/L的磷酸缓冲液中浸泡1h，浸种期间不断搅拌；浸种结束后取出大麦种子并吸干表面水分；

2)以不同浓度(0.5％、0.7％、0.9％、1.1％)、pH为7.0的甲基磺酸乙酯溶液为诱变处理剂；将100粒大麦种子100ml的诱变处理剂中，于室温条件下恒温振荡处理8～14h进行诱变处理；

3)诱变处理完成后将大麦种子取出并清洗干净，放于铺有滤纸的培养皿中，在26℃培养箱中培养7天；同时以未诱变处理的大麦种子同样处理作为对照；

以胚根的长度不短于种子长度的一半为发芽标准，统计大麦种子的发芽数，并计算发芽率和相对发芽率：

发芽率＝(发芽数/供试种子数)×100％

相对发芽率(％)＝(诱变处理的发芽率/对照的发芽率)×100％；

以相对发芽率在45～55％的诱变处理为最适诱变处理；

4)对5000-10000粒大麦种子，利用最适诱变处理浓度与时间进行EMS诱变处理，诱变结束后就，将种子点播于试验田间，记为M₁代，正常田间管理，种子成熟后分单株收种，收获的种子记为M₂代；

5)M₂代种子并按株系播种定植，每个株系种植多株，在植株整个生长期间调查每个株系的叶、茎、穗子、生育期、育性等的表型变异，对筛选到的所有表型变异植株按单株收种，收获的种子记为M₃代；

6)每个M₃代种子按株系播种定植，每个株系种植多株，在植株生长期间，根据M₂代变异株的特点对M₃代株系的突变性状进行重复观测和鉴定；

7)对突变性状能够稳定遗传的M₃代株系按单株收获种子，继续按株系种植，成熟后收获不再分离株系的M₄代种子，所有不再分离株系的M₄代种子构成突变体库。

所述的大麦种子为“苏啤6号”啤酒大麦的干种子。

所述的最适诱变处理为：

以体积比浓度0.5％、pH为7.0的甲基磺酸乙酯溶液为诱变处理剂；将大麦种子置于100ml的诱变处理剂中，于室温条件下恒温振荡处理14h进行诱变处理。

所述的最适诱变处理为：

以体积比浓度0.9％、pH为7.0的甲基磺酸乙酯溶液为诱变处理剂；将大麦种子置于100ml的诱变处理剂中，于室温条件下恒温振荡处理10h进行诱变处理。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的利用甲基磺酸乙酯构建大麦突变体库的方法，利用EMS诱变构建测序品种比如(“苏啤6号”)的突变体库，不仅能够直接有效地利用测序成果进行突变体分析，为重要农艺性状基因的克隆创造条件，为获得具有独立自主知识产权的优良大麦基因奠定基础，而且获得了多种类型的基础材料；筛选出了籽粒无蜡质、低蛋白含量突变体，提高了啤酒大麦的品质；筛选出了矮杆突变体，增强了品种的抗倒伏性；筛选出的多叶突变体，可以用于青贮专用大麦的选育；筛选出了株型紧凑的突变体可改善株型，有利于合理密植，实现大麦高产。

诱变剂量的选择是构建突变体库的关键，而诱变剂量是根据不同剂量下种子的发芽率确定的，因此保证相对准确的种子发芽率对构建突变体库至关重要。影响种子发芽率的因素较多，现有技术中无论是大麦的辐射诱变，还是EMS化学诱变，均没有排除剂量对发芽率的影响。在确定诱变剂量时，诱变时间是另外一个至关重要的影响因素。本发明采用EMS对大麦进行化学诱变，明确EMS诱变处理大麦时诱变浓度，探索了不同的处理时间对诱变后发芽率的影响。

与目前大麦上常采用的辐射诱变相比，本发明的EMS产生的突变以点突变为主，对基因组损伤小、致死突变少、突变谱稳定、突变频率高，且无需借助昂贵的仪器设备，剂量易控制，操作简单易行，成本较低。

附图说明

图1为EMS诱导的大麦叶色突变体；A：叶黄条；B：红绿叶；C：白叶耳；D-E：叶病斑；F：旗叶卷曲；G：无旗叶H：宽叶I：细叶。

图2为EMS诱导茎秆突变体；A-B：无蜡质；C：多节多叶；D：矮化；E：多分蘖；F：无叶耳；G：异常茎H：茎秆弯曲。

图3为EMS诱导穗部性状突变体；A：棱型；B-C：异常穗；D：球穗；E：浅黄穗；F：白颖壳；G：双穗；H：长穗；I：短穗；J-K：雄性不育。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

1、EMS处理液的配制：用305ml、浓度为0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液与195ml、浓度为0.2mol/L的磷酸二氢钠溶液混匀，分别加入5，7，9和11ml的EMS，用蒸馏水定容至1升，即成体积比浓度为0.5％，0.7％，0.9％，1.1％，pH为7.0的EMS诱变处理液。

2、EMS诱变处理：选取饱满的苏啤6号干种子100粒，用0.2mol/L的磷酸缓冲液中浸泡1h，用滤纸吸干种子表面的水分，用体积比浓度为0.5％，0.7％，0.9％，1.1％，pH为7.0的EMS处理液分别诱变处理8h，11h，14h，17h，保持所有种子浸泡在诱变剂中，整个诱变过程置于26℃，110rpm的摇床内恒温振荡处理，然后取出种子，用纯水漂洗5遍，即成为经EMS诱变处理后的大麦种子。

3、种子的发芽试验：

将上述EMS诱变处理的种子置于铺有润湿的2层滤纸的培养皿(直径为90mm)中，进行发芽试验，每个处理设3次重复，每个重复100粒种子，置于人工气候箱内26℃暗培养，以胚根的长度不短于种子长度的一半为发芽标准，每天记载发芽种子数，并计算7天时的发芽率和相对发芽率，将相对发芽率接近50％的处理剂量确定为最适宜的诱变剂量，即半致死剂量。

发芽率和相对发芽率的计算方法如下：

发芽率(％)＝(全部正常发芽数/供试种子数)×100％；

相对发芽率(％)＝处理的发芽率/对照的发芽率×100％；

统计得到不同EMS浓度和诱变时间下的大麦种子发芽率如表1所示。

表1 不同EMS浓度和诱变时间下的大麦种子发芽率

选择以下两个处理作为最适宜的诱变剂量：0.5％处理14h，0.9％处理10h。

4、畸变率和畸变类型调查：

选用其中一个半致死剂量(0.5％，14h)对大麦种子进行EMS诱变处理，经诱变处理后的大麦种子，点播于试验田中，记为M₁代，正常田间管理，种子成熟后分单株收种，收获的种子记为M₂代，每个M₂代按株系播种定植，在植株整个生长期间调查每个株系的表型变异，对筛选到的表型变异植株按单株收种，收获的种子记为M₃代，每个M₃代按株系播种定植，每个株系种植多株，在植株生长期间，根据M₂代变异株的特点对M₃代株系的稳定性进行鉴定，对突变性状能够稳定遗传的单株继续种植M₄，成熟后收获株系种子，构成突变体库。

从2400个M₂代株系中筛选出140个突变株系，突变频率为5.84％。其中，幼苗习性突变体有34个，突变率为1.42％；叶部突变体有32个，突变率为1.33％；茎部突变体有35个，突变体率1.46％；穗部突变体有22个，突变率为0.92％；成熟期和育性突变体有17个，突变率为0.71％。

对M₄代稳定的突变体株系进行主要农艺性状调查，结果表明，突变群体中，在表型抽穗期、株高、穗长、单穗穗粒数、总蛋白含量、总淀粉含量方面均产生了丰富的变异，抽穗期为208-227天，株高为21.67-85.54cm，穗长为4.53-10.9cm，单穗穗粒数为14.25-72.52粒，总蛋白含量为12.42-16.78％，总淀粉含量为39.46-53.42％；其中单穗穗粒数与穗长的变异系数较大，分别为31.02和13.81。通过EMS诱变处理，在主要农艺性状方面均产生了不同于野生型的突变体，为以后基础理论研究及育种利用奠定了材料基础。

本研究对EMS诱变产生的突变株系的主要农艺性状进行了进一步的分析，发现了一批稳定的优良株系，比如矮秆、多叶(用于大麦青贮)、早熟、低蛋白等性状优良的突变株，这些优异种质资源可以直接应用到大麦育种中。

以上给出的实施例是实现本发明较优的例子，本发明不限于上述实施例。本领域的技术人员根据发明技术方案的技术特征所做出的任何非本质的添加、替换，均属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种利用甲基磺酸乙酯构建大麦突变体库的方法，包括以下操作：

发芽率＝(发芽数/供试种子数)×100％

相对发芽率(％)＝(诱变处理的发芽率/对照的发芽率)×100％；

以相对发芽率在45～55％的诱变处理为最适诱变处理；

6)每个M₃代种子按株系播种定植，每个株系种植多株，在植株生长期间，根据M2代变异株的特点对M₃代株系的突变性状进行重复观测和鉴定；

2.如权利要求1所述的利用甲基甲基磺酸乙酯构建大麦突变体库的方法，其特征在于，所述的大麦种子为“苏啤6号”啤酒大麦的干种子。

3.如权利要求1所述的利用甲基甲基磺酸乙酯构建大麦突变体库的方法，其特征在于，所述的最适诱变处理为：以体积比浓度0.5％、pH为7.0的甲基磺酸乙酯溶液为诱变处理剂；将大麦种子置于100ml的诱变处理剂中，于室温条件下恒温振荡处理14h进行诱变处理。

4.如权利要求1所述的利用甲基甲基磺酸乙酯构建大麦突变体库的方法，其特征在于，所述的最适诱变处理为：以体积比浓度0.9％、pH为7.0的甲基磺酸乙酯溶液为诱变处理剂；将大麦种子置于100ml的诱变处理剂中，于室温条件下恒温振荡处理10h进行诱变处理。