CN113349052A - 一种紫菜突变体库的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种紫菜突变体库的构建方法，属于植物育种技术领域。本发明紫菜突变体库的构建方法是以条斑紫菜单孢子为诱变材料，采用甲基磺酸乙酯作为诱变剂，通过对诱变条件的优化，获得具有较高突变饱和度的突变体库，使其具有各种性状的突变体，且获得的诱变后代为纯系，突变率相对较高，为紫菜的种质选育和遗传学研究提供丰富的种质资源。

Description

一种紫菜突变体库的构建方法

技术领域

本发明属于植物育种技术领域，具体涉及一种紫菜突变体库的构建方法。

背景技术

突变体库的构建方法可以分为三类：自发突变、理化诱变和分子生物学方法。自发突变频率较低，在水稻和拟南芥中的自发突变频率仅为7.4×10^-9和7×10^-9，而且遗传背景不清楚，不能满足现代生物学研究高通量的要求。理化诱变是最常用的方法，操作简单，突变率高，突变随机性比较大常用的诱变剂有⁶⁰Co-γ射线、甲基磺酸乙酯、叠氮化钠等。分子生物学方法诱变操作比较复杂，需要成熟的遗传转化体系，常用的方法有插入诱变和基因编辑诱变。

在藻类中，尤其是大型海藻中，构建高饱和度的突变体库的研究比较少，似乎更多的也是着眼于获得单个突变体，比如，Zhang等(Zhang,B.-l.,X.-h.Yan,and L.-b.Huang,Evaluation of an improved strain of Porphyra yezoensis Ueda(Bangiales,Rhodophyta)with high-temperature tolerance.Journal of Applied Phycology,2010.23(5):p.841-847.)和Chen等(Chen,S.-S.,H.-C.Ding,and X.-H.Yan,Isolationand characterization of an improved strain of Porphyra chauhanii(Bangiales,Rhodophyta)with high-temperature resistance.Journal of Applied Phycology,2016.28(5):p.3031-3041.)分别用⁶⁰Co-γ射线诱变条斑紫菜原生质体和Porphyrachauhanii，并利用高温筛选的方法获得所需要的突变株。Yi等(Yi,Z.,et al.,ChemicalMutagenesis and Fluorescence-Based High-Throughput Screening for EnhancedAccumulation of Carotenoids in a Model Marine Diatom Phaeodactylumtricornutum.Mar Drugs,2018.16(8).)用EMS和亚硝基胍(N-methyl-N-nitro-N-nitroso-guanidine,NTG)诱变三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)，并建立了一种筛选含高类胡萝卜素的藻株的方法。Perin等(Perin,G.,et al.,Generation of random mutantsto improve light-use efficiency of Nannochloropsis gaditana cultures forbiofuel production.Biotechnol Biofuels,2015.8:p.161.)用EMS和插入诱变技术构建了微拟球藻(Nannochloropsis gaditana)的突变体库，并从中筛选出光利用率和产量明显提高的藻株。

突变体库是筛选突变体、研究基因功能、选育优良种质的资源库。大型海藻是重要的水产养殖物种，具有重要的经济价值，但是相较于高等农作物，构建海藻突变体库的研究较少，为获得突变体、选育种质带来了一定困难。

发明内容

本发明的目的在于提供一种紫菜突变体库的构建方法；具体是将EMS诱变和条斑紫菜单孢子放散技术相结合，以萌发率50％为标准，在合适的诱变条件下，构建大规模的突变体库。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种紫菜突变体库的构建方法，步骤如下：

(1)收集紫菜的孢子，将其按10⁴个/mL分散至灭菌海水中，静置后，除去上清；

(2)加入浓度为1-5.0625％(v/v)的诱变剂甲基磺酸乙酯，15℃，避光诱变30-60min；

(3)加入5％硫代硫酸钠溶液，终止诱变，去上清，用灭菌海水清洗；

(4)加入含有PES培养基的海水，先避光培养12h，然后去遮光，正常培养，每3天更换一次培养基；

(5)选择固定视野，每3天拍照、计数，并统计萌发率和相对萌发率；

(6)以相对萌发率为50％为标准，选择合适的诱变条件，诱变条斑紫菜单孢子，诱变完成后终止诱变；

(7)向步骤(6)诱变后的紫菜单孢子加入含有PES培养基的海水，先避光培养12h，然后去遮光，正常培养，每3天更换一次培养基；一段时间后，转入通气瓶中，10℃通气培养；在材料生长至5-7cm时，对其进行性状测定，评价突变体库的质量，进行种质保存。

在一个具体的实施例中，所述诱变剂甲基磺酸乙酯的浓度(v/v)为1％、1.5％、2.25％、3.375％、5.0625％，优选的为2.25％。

在一个具体的实施例中，所述诱变时间为30min或60min，优选的为30min。

在一个具体的实施例中，所述紫菜孢子由以下方法获得：

①取健康未成熟紫菜剁碎至20-30细胞的碎片，然后用灭菌海水清洗3次；

②将步骤①清洗后的碎片转移至含PES培养基的灭菌海水中，15℃100rpm培养；

③每天镜检观察单孢子放散量，至放散量每个视野≥10个时，将培养液摇匀，计数，过500目筛绢，滤液于3000rpm离心10min，倒去上清，加入少量的灭菌海水重悬孢子，摇晃均匀后计数。

上述方法构建的紫菜突变体库。

上述紫菜突变体库在紫菜基因功能研究或选育优良种质中的应用。

本发明技术方案的优点

本发明使用EMS诱变条斑紫菜单孢子构建大规模的突变体库，为推进紫菜功能基因组学的研究、种质选育奠定基础。

本发明相对于同类型的研究，优点有二：一是以EMS对单倍体的孢子进行诱变，获得的后代是直接发育为纯系叶状体，不像大多数高等植物，多为诱变二倍体种子，容易获得嵌合体，需要对诱变后代进行多代自交以获得纯系，从而进行下一步的研究；二是，突变率相对较高。对条斑紫菜突变后代进行表型突变的统计，长宽比突变的突变率为17.39％，比生长速率突变的突变率为13.59％，色素突变的为0.91％。同样使用EMS诱变的棉花，在突变一代，突变率为1.1％、二代为2.5％，大麦的EMS突变体库中，单一性状的突变率最高为1.5％(幼苗习性突变)，其次为叶部突变的突变率为1.42％，大豆EMS突变体库的突变率为2.97％，Mai Tsuda等人将EMS和伽马射线联用，诱变大豆种子，白化突变率为4.9％，矮化突变率为1.6％，番茄突变体库的突变率为1.14％。由此可知，本发明的表型突变率是高于其他研究的，这也为下一步的重测序、研究基因功能打下了良好的基础。

本发明的目的旨在于构建一个具有较高突变饱和度的突变体库，使其具有各种性状的突变体，为紫菜的种质选育和遗传学研究提供丰富的种质资源。

附图说明

图1不同浓度EMS处理30min后不同组的萌发率(A：相同培养时间下不同处理条件的萌发率；B：相同处理条件不同培养时间下的萌发率；不同字母表示显著性差异P＜0.05，单因素方差分析)；

图2不同浓度EMS处理60min后不同组的萌发率(A：相同培养时间下不同处理条件的萌发率；B：相同处理条件不同培养时间下的萌发率；不同字母表示显著性差异P＜0.05，单因素方差分析)；

图3EMS处理后不同组在10d的相对萌发率(不同字母表示显著性差异P＜0.05，单因素方差分析)；

图4对照和M0代的长宽比测定结果(A：不同长宽比的材料所占的比例；B：对照和M0代平均长宽比的比较，**表示差异极显著P<0.01)；

图5对照和M0代中不同叶型的占比；

图6不同叶型的M0代叶状体(1：卵形或长卵形；2：渐尖；3：哑铃形；4：带状；5：楔形；6：异常；图中的比例尺均为1cm)；

图7对照和M0代的Fv/Fm测定结果(A：对照和M0代中不同Fv/Fm的占比；B：对照和M0代平均Fv/Fm的比较，**表示差异极显著P<0.01)；

图8对照和M0代的Qy、NPQ和qP测定；

图9对照和M0代比生长速率的比较；

图10对照和M0代叶状体的边缘观察结果(A：对照；B1-3：M0代个体)；

图11对照和M0代中色素突变体测定结果(A：对照；B：RM-1；C：RM-2；D：RM-3；E：RM-4；F：RM-5；G：RM-6；H：PM，图中的比例尺均为1cm)。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

材料：实验室培养的30日龄条斑紫菜RZ纯系叶状体，长5cm左右。培养条件：温度10℃，光照强度35-45μmol photons m^-2s^-1，光周期/暗周期：12h/12h，海水盐度27P.S.U，每3天更换一次含有PES培养基的海水。

试剂：甲基磺酸乙酯(Ethyl Methanesulfonate，EMS)体积分数为0，1％，1.5％，2.25％，3.375％，5.0625％；质量分数为5％的硫代硫酸钠溶液；灭菌海水

器材：倒置显微镜，离心机，500mL的三角瓶，50mL离心管，刀片，载玻片，盖玻片，1.5mL离心管，12孔板，计数器，计数板，移液器(5mL，1mL，50μL)，枪头

一种紫菜突变体库的构建方法，步骤如下：

1、制备紫菜孢子：

①取0.1g健康未成熟紫菜在载玻片上剁碎至20-30细胞的碎片；将碎片转移至1.5mL ep管中，用灭菌海水清洗3次；

②在灭菌的500mL三角瓶中加入200mL灭菌海水以及4mL PES培养基；将步骤①清洗后的碎片转移至含PES培养基的灭菌海水的三角瓶中，15℃100rpm培养；

③每天镜检观察单孢子放散量，至放散量每个视野≥10个时，将三角瓶中水体摇晃均匀，用计数板计数(由于过滤后会有一定的损失，因此需要保证一定的基数)；

④用已灭菌的500目筛绢、50mL离心管、漏斗、1L烧杯进行收集。具体过程：

准备4个50mL的离心管；将步骤③中的培养液摇匀，过500目筛绢，过滤后的滤液分装到上述50mL的离心管中，3000rpm离心10min，倒去上清，加入少量的灭菌海水重悬孢子；吸取灭菌海水吹打筛绢上的碎片，获得的滤液再次离心，用5mL枪头吸去部分上清，将多个离心管中的悬液合并，摇晃均匀，计数。

2、诱变处理

(1)根据上述制备的紫菜孢子悬液的浓度，分装适量紫菜孢子悬液至孔板中，使终浓度为10⁴个/mL，吹打均匀，静置3小时。

(2)诱变：除去步骤(1)紫菜孢子悬液的上清，加入1mL的诱变剂(分别采用甲基磺酸乙酯的浓度(v/v)为0％、1％、1.5％、2.25％、3.375％、5.0625％)，15℃，诱变(诱变过程遮光，每个诱变剂浓度分别诱变30min和60min)。诱变结束后，加入50μL的5％硫代硫酸钠溶液，终止诱变，去上清，用灭菌海水清洗3次。清洗后，加入含有PES培养基的海水，避光培养12h后，去遮光，正常培养(15℃，光强：40μmol photons m^-2s^-1，光周期：光:暗＝12h:12h，静置培养)；每3天换一次水。

(3)计数。在20倍镜下选择固定视野，每3天拍照计数，并计算萌发率。

不同诱变条件下各处理组的萌发率情况如图1-3所示：

图1为不同浓度的EMS处理30min后不同组的萌发率结果，统计各组在1d、4d、7d和10d的萌发率，并进行显著性检验。结果发现：30min处理组中，随诱变剂浓度的增加，孢子的萌发率逐渐下降。当浓度低于2.25％时，从第1天起至第10天，单孢子萌发率均与对照无显著差异(P>0.05)，表明低浓度EMS对单孢子萌发没有明显的抑制效应；当浓度为2.25％时，单孢子萌发率在第1天即显著降低(P<0.05)；当浓度为3.375％时，单孢子萌发率自第1天起进一步显著下降(P<0.05)，第10d时萌发率仅为0.51％，表明该条件下EMS显著抑制了单孢子的萌发；当浓度为5.0625％，单孢子全部死亡(图1A)。如图1B所示，除3.375％×30min外，其余各组组内4d、7d和10d的单孢子萌发率之间无显著差异(P>0.05)，如2.25％×30min组内的4d、7d、10d的萌发率之间无显著差异(P>0.05)，认为到第10d时，萌发率已经稳定。

图2为不同浓度的EMS处理60min后不同组的萌发率结果，

60min处理组中，随着诱变浓度的增加，60min处理组的各组的孢子的萌发率逐渐下降。当浓度低于1.5％时，从第1天至第10天，单孢子的萌发率与对照无显著差异(P>0.05)，表明该条件对单孢子萌发无明显的抑制效应；当浓度为1.5％时，单孢子的萌发率在第1天就显著降低(P<0.05)；当浓度达到2.25％时，单孢子萌发率急剧下降，第1天的萌发率仅为7.82％，第4天-第10天，萌发率为0；浓度为3.375％和5.0625％，第1天时单孢子就全部死亡(图2A)。如图2B所示，每组组内的4d、7d和10d萌发率之间没有显著性差异(P>0.05)，认为到第10d时，萌发率已经稳定。

图3为不同浓度EMS处理不同时间后在10d的相对萌发率，由于3.375％×60min、5.0625％×30min和5.0625％×60min的萌发率为0，所以没有列出来。由图3可知，随着处理条件的增强，相对萌发率不断下降，且在相同的EMS浓度下，60min处理组比30min处理组的相对萌发率要低；低剂量处理组与对照组的相对萌发率差异不显著，如1％×30min组，其相对萌发率为99.72％。

为保证一定的突变率，同时获得较大的群体，本发明以相对萌发率50％为标准选择EMS诱变条件，在本发明中，2.25％×30min组的相对萌发率为51.57％，约为对照组的一半，可以作为紫菜突变体库构建的优异条件，并对其构建的突变体库质量评价后进行种质保存。

(4)突变体库质量评价：在步骤(2)诱变处理后的材料(M0代个体)培养10d后，转入2L通气瓶中，通气(控制每瓶中通气量相同)，10℃培养，光强与光周期同上。在材料生长至5-7cm左右时，开始对M0代个体进行性状的测定，测定性状包括长、宽、长宽比、叶型、叶缘、光合生理和生长速度等。

构建的突变体库的质量评价方法：

在对M0代材料及对照进行45-50天的培养后，随机挑选一部分材料，进行长、宽、长宽比、叶型、叶缘、光合生理和生长速度等表型的测定，并对所测量的材料进行拍照记录，统计突变类型及突变比例，与对照统计结果进行比较，具体的测量方法如下：

①长、宽、长宽比

将紫菜展平在白色纸板上，用尺子测量并记录叶状体长(最长)、宽(最宽)，长宽比的计算公式如下，

计算公式：长宽比＝最长/最宽；

②叶型

对展平在纸板上的紫菜进行拍照，对紫菜形状进行描述；

③叶缘

将紫菜展平在载玻片上，显微观察叶状体边缘是否有突起，拍照记录。

④光合生理

使用封闭式叶绿素荧光仪FluorCAM MF180(PSI，捷克)对M0代个体进行荧光淬灭曲线(Quenching curve)的测定，步骤如下：将叶状体展平在大平皿中，尽量展平，不要留下褶皱，在表面留一层水以避免叶状体失水，影响叶状体的状态，材料暗适应15min后，测定荧光淬灭曲线，可以直接获得最大光合效率(Maximum PSⅡquantum yield,Fv/Fm)、实际光合效率(effective PSⅡquantum yield，Qy)、非光化学淬灭(non-photonchemicalquenching，NPQ)和光化学淬灭(photochemical quenching，qP)。

⑤比生长速率

从群体中随机取出一部分材料，调整紫菜的培养密度，使每瓶的培养密度相同，并调整每瓶材料的通气量及营养盐浓度，使其一致，10℃、光照强度40μmol photons m^-2s^-1、光周期：12L：12D，培养；驯化4天后，将紫菜展平在白色平板上，拍照记录材料初始状态；继续培养4天后，拍照记录材料状态；利用image J软件对照片进行处理，计算紫菜的初始面积(S₀)、最终面积(S_t)；按Yong等(2013)的方法计算紫菜的比生长速率(Specific growthrate,SGR)，

其中，S₀为叶状体初始面积，单位为mm²；S_t为培养t天后叶状体的面积，单位为mm²，t为培养的时间，单位为天。

⑥突变率的计算

比较对照和M0代群体在各个指标上的差异是否显著，同时计算突变率，采用标准差法确定突变体判别界线，

X_b(±)表示突变体判别界线；

和σ表示对照组的平均值和标准差；Z_α/2是标准正态分布的100α百分位点，α＝0.05，Z_α/2＝1.964，取整数为2。

依据该界线对M0代进行有效突变体的筛选，并计算突变率，

突变率＝(有效突变体株数/总株数)*100％

其中，有效突变体株数为，在某一性状上，群体中高于或低于X_b(±)的株数；总株数为随机挑选出来的M0代个体数。

在Excel中进行数据处理，在SPSS中对处理结果显著性检验(独立样本t检验，P<0.05)。

结果：

长宽比的测定结果如图4所示，以C代表长宽比。对照组长宽比主要集中在5-15的范围内，占比达85.45％，C≥15组的占比为13.82％，C<5的占比为0.66％；M0群体长宽比主要集中在C<10的范围内，占比达89.13％，10≤C<15为9.78％，C≥15占1.09％(图4A)。M0代长宽比的平均值为6.06，对照的长宽比的平均值为11.02，显著性检验表明，M0代的长宽比极显著于低于对照(P<0.01)(图4B)。

叶型分析统计结果如图5和图6所示，由图5可知，对照群体中，卵形或长卵形占比最高，达到75.66％，其外观特点为两端较窄、中部较宽；其次是渐尖和哑铃形，占比分别为10.51％和10.53％，前者基部较宽，由基部向顶端逐渐变窄，状似宝塔，后者中间较窄、两端宽；楔形和带状占比分别为2.63％和0.66％。在M0代中，尽管卵形或长卵形占比仍然是最高的，为54.35％，但渐尖形和哑铃形比例增加，分别为16.3％和11.96％，楔形为3.26％，同时，带状和异常比例均增加，均为7.07％。6种叶型中，对照仅在卵形上高于M0代，而其他5种叶型，均是M0代高于对照，6种叶形图片参见图6。

光合生理的测定结果如图7和图8所示，分别测定了对照群体和M0代个体的Fv/Fm，结果如图7所示，对照群体Fv/Fm值主要分布在0.55-0.6,比例为72.19％，Fv/Fm在0.5—0.55的占16.56％，Fv/Fm≥0.6占11.26％。M0代群体中，相较于对照群体，0.55≤Fv/Fm<0.6组的比例有所降低，比例为55.75％，但Fv/Fm在0.5—0.55和<0.5的比例增加，分别为29.31％和8.05％，Fv/Fm≥0.6的比例下降为6.9％(图7A)。整体而言，M0代个体的平均Fv/Fm值极显著低于对照(P<0.01)(图7B)。如图8所示，在Qy、NPQ和qP三个参数中，M0代材料仅在NPQ这一参数上极显著低于对照，其他无显著差异。

M0代和对照群体比生长速率测定结果如图9所示，对照群体平均比生长速率为14.53％/day，M0代平均比生长速率为16.89％/day，M0代略高于对照，但两者之间差异并不显著(P>0.05)。

条斑紫菜的叶缘均为全缘，无齿状突起，是紫菜分类的一个依据。对M0代群体进行显微观察，统计个体中，M0代叶缘和对照一样，均无齿状突起(图10)。

在M0代群体中，发现了7株色素突变体，包括6株红色突变体和1株紫色突变体，分别命名为RM-1、RM-2、RM-3、RM4、RM-5、RM-6和PM(图11)，其中，RM-1～RM-6为红色突变体，颜色分别为深红、深红、深红、红褐色、深红、深红；PM为紫色突变体，颜色为紫色；对照群体中未发现突变体。

突变率的计算：首先以标准差法计算M0代在长宽比、光合生理和比生长速率3个性状上的突变体判别界线，依据该界线对测量群体进行有效突变体株的筛选和突变率的计算，有效突变体株数和突变率如表1所示，色素突变的频率约为0.91％。

表1M0代突变率

*：色素突变的频率基于773株的M0群体进行计算。

(5)在对M0代个体进行性状测定后，进行种质的保存，于紫菜基部用刀片切取部分藻体(面积约为0.5cm×1cm)，将其切成三等份；将藻体碎片转入0.7％的碘化钾溶液中浸泡10分钟以杀菌；将藻体碎片转入灭菌海水中以去除碘化钾溶液；向48孔板中加入1ml的含有PES培养基的海水；将藻体碎片转入48孔板中，15℃，静置培养；前期无需进行培养基的更换，待到其完成自交、获得丝状体后，再更换新鲜的同种培养基。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (7)

1.一种紫菜突变体库的构建方法，其特征在于，步骤如下：

(1)收集紫菜单孢子，将其按10⁴个/mL分散至灭菌海水中，静置后，除去上清；

(2)加入浓度为1-5.0625％(v/v)的诱变剂甲基磺酸乙酯，15℃，避光诱变30-60min；

(3)加入5％硫代硫酸钠溶液，终止诱变，去上清，用灭菌海水清洗；

(4)加入含有PES培养基的海水，先避光培养12h，然后去遮光，正常培养，每3天更换一次培养基；

(5)一段时间后，转入通气瓶中，10℃通气培养；在材料生长至5-7cm时，对其进行性状测定，评价突变体库的质量，进行种质保存。

2.根据权利要求1所述紫菜突变体库的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中的诱变条件是以诱变处理后紫菜孢子的相对萌发率50％为标准，选择的合适诱变条件。

3.根据权利要求1所述紫菜突变体库的构建方法，其特征在于，所述诱变剂甲基磺酸乙酯的浓度为2.25％(v/v)。

4.根据权利要求1所述紫菜突变体库的构建方法，其特征在于，所述诱变时间为30min。

5.根据权利要求1所述紫菜突变体库的构建方法，其特征在于，所述紫菜单孢子由以下方法获得：

①取健康未成熟紫菜剁碎至20-30细胞的碎片，然后用灭菌海水清洗3次；

②将步骤①清洗后的碎片转移至含PES培养基的灭菌海水中，15℃100rpm培养；

③每天镜检观察单孢子放散量，至放散量每个视野≥10个时，将培养液摇匀，计数，过500目筛绢，滤液于3000rpm离心10min，倒去上清，加入少量的灭菌海水重悬孢子，摇晃均匀后计数。

6.权利要求1-5任一项所述方法构建的紫菜突变体库。

7.权利要求6所述紫菜突变体库在紫菜基因功能研究或选育优良种质中的应用。

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